黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株SATB1表達(dá)的影響*

張淑群 高曉燕 薛興歡 馬一楠 馬興聰

·基礎(chǔ)研究·

黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株SATB1表達(dá)的影響*

張淑群 高曉燕 薛興歡 馬一楠 馬興聰

目的：觀察黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞SATB1蛋白表達(dá)的影響。方法：用MTT法、劃痕愈合實驗觀察不同濃度黃芩素干預(yù)后MDA-MB-231細(xì)胞增殖和運動遷移能力的變化；用Western Blot法檢測黃芩素干預(yù)后MDA-MB-231細(xì)胞SATB1蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：隨作用時間的延長和藥物濃度的增加，黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞增殖和運動遷移的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈明顯的時間-劑量依賴性（P＜0.05）；黃芩素可顯著降低MDA-MB-231細(xì)胞中SATB1蛋白的表達(dá)，而且隨著藥物濃度增加，SATB1蛋白表達(dá)量逐漸減少（P＜0.05）。結(jié)論：黃芩素可通過抑制SATB1的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、侵襲和遷移能力。

黃芩素 SATB1 乳腺癌 細(xì)胞株

Department of Oncology,the SecondAffiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University School of Medicine,Xi'an 710004,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81274136),Xi'an Jiaotong University's

Cross Project Funds(No.Xjj2012141),and the Talent Funds of the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University(No.RCCGG201105)

乳腺癌在全球女性腫瘤病死率中排第二位［1］，患者死亡的主要原因是腫瘤細(xì)胞在身體其他部位的播散和增殖，約有50%的乳腺癌患者初診時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2-3］，因此目前治療的難點和關(guān)鍵是預(yù)防和控制腫瘤的轉(zhuǎn)移。特異富含AT序列結(jié)合蛋白1（special AT-rich sequence binding protein 1，SATB1），是一種組織特異性核基質(zhì)結(jié)合蛋白，在胸腺細(xì)胞、祖細(xì)胞和上皮基底層顯著表達(dá)，在其他正常細(xì)胞和組織中幾乎不表達(dá)，參與染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的形成和組織特異性基因表達(dá)的調(diào)控，在T細(xì)胞的發(fā)育、早期紅細(xì)胞分化，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和響應(yīng)各種刺激中起重要作用［4-10］。近來研究發(fā)現(xiàn)SATB1在多種腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，能調(diào)控1 000余種腫瘤相關(guān)基因，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。被認(rèn)為是一個潛在的重要的抗腫瘤藥物作用的靶分子。

黃芩素是從中藥黃芩中分離出來的單體，其分子式為C15H10O5，分子量為270.24（圖1）。研究發(fā)現(xiàn)黃芩素在人乳腺癌、肝癌、胰腺癌等細(xì)胞株中具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的作用［11-13］。然而其抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果提示，在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中黃芩素可通過抑制SATB1蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自上海生物研究所細(xì)胞庫；黃芩素購自美國Sigama公司，純度為99%；兔抗人SATB1多克隆抗體購自美國Abcam公司；鼠抗人β-Actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京博奧森生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 MDA-MB-231細(xì)胞加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶壁80%時傳代。

1.2.2 MTT法檢測黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成濃度為5×104個/mL的細(xì)胞懸液，以200 μL/孔種于96孔板，孵育24 h。用含10%血清的1640培養(yǎng)液將黃芩素儲存液（0.1 M）配置成終濃度為5、10、20、40、80 μmoL/L的培養(yǎng)液。96孔板中加入200 μL不同濃度的黃芩素培養(yǎng)液?？瞻讓φ战M加入200 μL普通細(xì)胞培養(yǎng)液。每個濃度設(shè)6個平行復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)分別于24 h，48 h，72 h后，加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，培養(yǎng)4 h后棄掉原液，加入MDSO 150 μL/孔。振蕩10 min，酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定各孔光密度（optical density，OD）值，記錄結(jié)果。細(xì)胞增殖抑制率（inhibition ratio，IR），IR=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%；計算出黃芩素的48 h的50%抑制濃度（IC50）。

1.2.3 劃痕試驗檢測黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 按1.0×105個/mL密度，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)80%時，用200 μL的移液器槍頭劃痕，記錄劃痕區(qū)相對距離。加入含黃芩素濃度分別為0、10、20 μmol/L的維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24、48 h 3個時間段分別觀察并照相。每組2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。倒置顯微鏡下測量細(xì)胞向劃痕區(qū)遷移的相對距離，根據(jù)原始細(xì)胞劃痕區(qū)寬度計算出細(xì)胞實際遷移距離。

1.2.4 Western Blot法檢測黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞SATB1蛋白表達(dá)的影響 RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)印到PVDF膜，5%的脫脂奶粉中封閉90 min，加一抗（SATB1 1.25∶1 000，β-actin 1：1 000）4℃過夜；洗膜后加入1：1 000的二抗稀釋液室溫下孵育1 h。ECL顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析；實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芩素體外抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖

與對照組比較，黃芩素在24、48、72 h及各濃度（5、10、20、40、80 μmol/L）均對MDA-MB-231細(xì)胞有抑制作用。隨著藥物濃度的提高和培養(yǎng)時間的延長，黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，即具有時間-劑量依賴性（表1，圖2）。通過SPSS 18.0軟件計算出黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞作用48 h的半數(shù)增殖抑制濃度（IC50）為27.92 μmol/L。

2.2 黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞體外遷移能力的影響

細(xì)胞運動能力的檢測也是一種判斷腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的方法。本實驗將待測細(xì)胞分為3組，對照組、10 μmol/L及20 μmol/L黃芩素干預(yù)組。倒置顯微鏡下可見對照組與濃度為10 μmol/L的黃芩素組MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，而作用48 h后濃度為20 μmol/L黃芩素干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由原來的長梭形變?yōu)轭悎A形。分別于劃痕后0、24、48 h觀察并記錄細(xì)胞劃痕區(qū)的愈合情況。黃芩素干預(yù)組劃痕區(qū)細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯少于對照組，藥物干預(yù)組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著藥物濃度的提高，劃痕區(qū)愈合寬度明顯減少（圖3）。

表1 黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）Table 1 Inhibitory effects of Baicalein on MDA-MB-231 cell migration（±s，n=6）

Concentration（μmol·L-1）24 h 48 h 72 h 0 5 OD 0.406±0.031 0.482±0.013 IR（%）0 -22.84 OD 0.603±0.036 0.533±0.051 IR（%）0 13.20 OD 0.981±0.027 0.841±0.063 IR（%）0 14.27

表1 黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）（續(xù)表1）Table 1 Inhibitory effects of Baicalein on MDA-MB-231 cell migration（±s，n=6）

Concentration（μmol·L-1）10 20 40 80 24 h 48 h 72 h OD 0.408±0.052 0.338±0.029 0.316±0.016 0.264±0.014 IR（%）-6.53 20.63 27.26 42.67 OD 0.507±0.033 0.356±0.025 0.283±0.022 0.207±0.023 IR（%）18.18 46.90 60.49 74.76 OD 0.824±0.025 0.465±0.011 0.212±0.030 0.193±0.014 IR（%）20.08 52.60 78.39 80.33

2.3 Western Blot檢測黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞SATB1蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)MTT法檢測結(jié)果求出的黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的48h半數(shù)抑制濃度（IC50），選用濃度分別為0、10、20、40 μM的黃芩素處理細(xì)胞MDA-MB-231 48 h后，分別提取細(xì)胞總蛋白用于Western Blot檢測。結(jié)果如圖4所示，與空白對照組比較，不同濃度的黃芩素（10、20、40 μM）分別干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞48h后，SATB1蛋白的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且隨藥物濃度的提高，SATB1蛋白表達(dá)量逐漸減少（P＜0.05）。說明黃芩素可降低MDA-MB-231細(xì)胞中SATB1蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴性。

3 討論

癌細(xì)胞的異常生長和轉(zhuǎn)移是癌癥的重要生物學(xué)特性。侵襲轉(zhuǎn)移是數(shù)百萬癌癥患者發(fā)病和死亡的主要原因［14］。篩選有效的不良反應(yīng)小的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物，對提高乳腺癌療效、改善預(yù)后、提高生存質(zhì)量，具有重要的意義。黃芩素是從黃芩中提取出來的黃芩苷苷元化合物，研究顯示其具有較強(qiáng)的抗癌活性，可抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT549、4T-1的增殖、降低其侵襲遷移能力及，可使MMP-2、MMP-9、uPA、NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)［11，15-18］，但具體作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究采用MTT法觀察不同濃度梯度黃芩素對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示黃芩素具有抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用，且呈時間-劑量依賴性（P＜0.05）。遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中必不可少的環(huán)節(jié)之一；劃痕愈合實驗被廣泛用于二維水平細(xì)胞遷移運動能力的研究。本實驗發(fā)現(xiàn)黃芩素具有抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞運動遷移的作用。這同Wang等［11］的研究報道一致。

SATB1是一種組織特異性的核基質(zhì)結(jié)合蛋白，它以獨特的“籠狀”結(jié)構(gòu)錨定于染色質(zhì)，能為眾多轉(zhuǎn)錄因子提供作用位點，在基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用［7］。Han等［19］發(fā)現(xiàn)SATB1在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，在腫瘤演進(jìn)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用?；蚪M學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SATB1通過調(diào)控1 000個以上基因（主要是調(diào)控細(xì)胞粘附、細(xì)胞信號、ECM形成和細(xì)胞周期）的表達(dá)促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。SATB1水平增加的細(xì)胞其促進(jìn)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的基因上調(diào)（包括ERBB2、MMP2，3，9、ABL1、E-cadherin），而轉(zhuǎn)移抑制基因的表達(dá)被抑制。這些SATB1所調(diào)控的基因是通過比較高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞在SATB1基因敲除前后基因表達(dá)譜的變化得出的。Zhang等［20］報道在結(jié)腸癌組織中，SATB1的表達(dá)與多種生物學(xué)和遺傳學(xué)標(biāo)記的表達(dá)呈正相關(guān)（包括Cyclin D1、MMP2、NF-κB、PCNA），同時與APC和BRAF（V600E）表達(dá)的缺失相關(guān)。本研究黃芩素是否通過抑制SATB1的表達(dá)從而發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)小劑量黃芩素干預(yù)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，可下調(diào)SATB1蛋白的表達(dá)，且隨劑量增加抑制作用顯著增強(qiáng)（P＜0.01），提示下調(diào)SATB1蛋白表達(dá)可能是黃芩素抑制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。

綜上所述，黃芩素可顯著抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，提示黃芩素可能具有潛在的抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。本實驗首次發(fā)現(xiàn)黃芩素可下調(diào)SATB1蛋白的表達(dá)，提示黃芩素可能通過抑制SATB1的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。為闡明黃芩素抗腫瘤的作用機(jī)制提供了新的研究思路。其詳細(xì)確切機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。與此同時SATB1的表達(dá)可也作為一個新的工具，以評估乳腺癌的惡性程度，并且有望成為新的治療靶點。

1 Friedenreich CM.Physical activity and breast cancer:review of the epidemiologic evidence and biologic mechanisms[J].Recent Results Cancer Res,2011,188:125-139.

2 Ahmad A,Hart IR.Mechanisms of metastasis[J].Crit Rev Oncol Hematol,1997,26(3):163-173.

3 Sporn MS.The war on cancer[J].Lancet,1996,347(9012):1377-1381.

4 Wang M,Yin B,Matsueda S,et al.Identification of special AT-rich sequence binding protein 1 as a novel tumor antigen recognized by CD8+T cells:implication for cancer immunotherapy [J].PLoS One,2013,8(2):e56730.

5 Cai S,Han HJ,Kohwi-Shigematsu T.Tissue-specific nuclear architecture and gene expression regulated by SATB1[J].Nat Genet, 2003,34(1):42-51.

6 Kohwi-Shigematsu T,Poterlowicz K,Ordinario E,et al.Genome organizing function of SATB1 in tumor progression[J].Semin Cancer Biol,2013,23(2):72-79.

7 Galande S,Purbey PK,Notani D,et al.The third dimension of gene regulation:organization of dynamic chromatin loopscape by SATB1[J].Curr Opin Genet Dev,2007,17(5):408-414.

8 Pavan Kumar P,Purbey PK,Sinha CK,et al.Phosphorylation of SATB1,a global gene regulator,acts as a molecular switch regulating its transcriptional activity in vivo[J].Mol Cell,2006,22(2): 231-243.

9 Ahlfors H,Limaye A,Elo LL,et al.SATB1 dictates expression of multiple genes including IL-5 involved in human T helper cell differentiation[J].Blood,2010,116(9):1443-1453.

10 Satoh Y,Yokota T,Sudo T,et al.The Satb1 protein directs hematopoietic stem cell differentiation toward lymphoid lineages[J].Immunity,2013,38(6):1105-1115.

11 Wang L,Ling Y,Chen Y,et al.Flavonoid baicalein suppresses adhesion,migration and invasion of MDA-MB-231 human breast cancer cells[J].Cancer Lett,2010,297(1):42-48.

12 Chiu YW,Lin TH,Huang WS,et al.Baicalein inhibits the migration and invasive properties of human hepatoma cells[J].Toxicol Appl Pharmacol,2011,255(3):316-326.

13 Takahashi H,Chen MC,Pham H,et al.Baicalein,a component of Scutellaria baicalensis,induces apoptosis by Mcl-1 down-regulation in human pancreatic cancer cells[J].Biochim Biophys Acta, 2011,1813(8):1465-1474.

14 Lee Y,Yeo H,Liu S-H,et al.Increased anti-P-glycoprotein activity of baicalein by alkylation on the A ring[J].J Med Chem,2004,47 (22):5555-5566.

15 Ding D,Zhang B,Meng T,et al.Novel synthetic baicalein derivatives caused apoptosis and activated AMP-activated protein kinase in human tumor cells[J].Org Biomol Chem,2011,9(21):7287-7291.

16 Po LS,Chen ZY,Tsang DS,et al.Baicalein and genistein display differential actions on estrogen receptor(ER)transactivation and apoptosis in MCF-7 cells[J].Cancer Lett,2002,187(1-2):33-40.

17 Huang S,New L,Pan Z,et al.Urokinase plasminogen activator/urokinase-specific surface receptor expression and matrix invasion by breast cancer cells requires constitutive p38alpha mitogen-activated protein kinase activity[J].J Biol Chem,2000,275(16):12266-12272.

18 Wang CZ,Li XL,Wang QF,et al.Selective fraction of Scutellaria baicalensis and its chemopreventive effects on MCF-7 human breast cancer cells[J].Phytomedicine,2010,17(1):63-68.

19 Han HJ,Russo J,Kohwi Y,et al.SATB1 reprogrammes gene expression to promote breast tumour growth and metastasis[J].Nature,2008,452(7184):187-193.

20 Zhang J,Zhang B,Zhang X,et al.SATB1 expression is associated with biologic behavior in colorectal carcinoma in vitro and in vivo [J].PLoS One,2013,8(1):e47902.

（2013-12-05收稿）（2014-02-22修回）

（本文編輯∶周曉穎）

Effect of Baicalein on the expression of SATB1 in MDA-MB-231 cells

Shuqun ZHANG,Xiaoyan GAO,Xinghuan XUE,Yinan MA,Xingcong MA
Correspondences to:Shuqun ZHANG;E-mail:zhangshuqun1971@aliyun.com

Objective:To investigate the effect of Baicalein on SATB1 expression and its relation to proliferation,invasiveness and migration of MDA-MB-231 cells.Methods:Colorimetric 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) and wound healing assays were used to detect the cell proliferation and the migration changes of MDA-MB-231 cells when treated with different concentrations of Baicalein.SATB1 expression in MDA-MB-231 cells was detected by Western blot.Results:Along with the reaction time and increase drug concentration,the inhibitory effect of Baicalein on proliferation and migration of MDA-MB-231 cells gradually increased in a time-and dose-dependent manner(P＜0.05).After treatment with Baicalein for 48 h,an obvious decrease was observed in the level of SATB1 protein expression of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner(P＜0.05).Conclusion:Baicalein can suppress MDA-MB-231 cells growth and migration by inhibiting its proliferation in a time-and dose-dependent manner.It can also down-regulate the expression of SATB1.

Baicalein,SATB1,breast cancer,MDA-MB-231 cells

10.3969/j.issn.1000-8179.20132064

張淑群 醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，副教授，博士、碩士研究生導(dǎo)師，研究方向為乳腺癌的中藥干預(yù)。

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科（西安市710004）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：81274136）、西安交通大學(xué)交叉項目基金（編號：Xjj2012141）和西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院人才基金（編號：RCCGG201105）資助

張淑群 zhangshuqun1971@aliyun.com

E-mail∶zhangshuqun1971@aliyun.com