黑素瘤相關(guān)MicroRNAs的研究進(jìn)展

吳 飛宋寧靜

黑素瘤相關(guān)MicroRNAs的研究進(jìn)展

吳 飛1宋寧靜2?

近年來發(fā)現(xiàn)MicroRNAs可通過膜受體酪氨酸蛋白激酶通路、PI3K－AKT通路、P16INK4ACDK4/6－RB通路、小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1通路影響黑素瘤的生物學(xué)行為,MicroRNAs及其靶基因相關(guān)通路的研究對黑素瘤的早期診斷、預(yù)后判斷以及黑素瘤的靶向治療具有重要的意義。

黑素瘤； MicroRNAS； 靶基因； 信號通路

1 M icroRNAs

MicroRNAs是一類內(nèi)源性、非編碼、高度保守的小RNA,主要作用是通過與mRNA的相互作用調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)水平。在胚胎早期發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡以及多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等一系列重要的生命過程中都有廣泛的影響。有學(xué)者推測,人類基因組所有基因的表達(dá)可能都直接或間接受到MicroRNAs的調(diào)節(jié)。

與mRNA一樣,MicroRNAs主要由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄剪接修飾,最初產(chǎn)物為Pri－miRNA,長度約300～1000個堿基,局部有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。首先在核內(nèi)被Drosha RNase切成含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Pre－miRNA,長度約70個堿基。轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中后,被Dicer酶切成含有20～24對堿基的RNA雙鏈結(jié)構(gòu)。雙鏈解旋后,其中一條為成熟MicroRNAs,另一條為其互補(bǔ)鏈。成熟MicroRNAs可與RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RNA－induce silencing complex,RISC)結(jié)合,形成非對稱RISC復(fù)合物(asymmetric RISC assemble)。此復(fù)合物可通過非嚴(yán)格堿基配對原則與目標(biāo)基因3'端非編碼區(qū)結(jié)合,形成一種MicroRNA－mRNA鏈,從而阻止mRNA的翻譯,在基因水平影響蛋白的合成。1MicroRNAs參與調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制與siRNA介導(dǎo)的mRNA降解不同,其表達(dá)有其嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈幌嘈院蜁r相性,在不同組織、不同發(fā)育階段表達(dá)都有顯著差異。成熟MicroRNAs互補(bǔ)鏈產(chǎn)生后一般會被立即水解,少部分會長期存在,并有與MicroRNAs相似的作用。

2 M icroRNAs與黑素瘤

黑素瘤發(fā)病的過程有明顯的步驟:異型黑素細(xì)胞首先在局部不典型增生；隨后出現(xiàn)放射性生長和垂直性生長形成局部侵襲的原發(fā)性黑素瘤；隨著腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步向真皮侵襲和播散,血管淋巴管形成,腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。長期以來學(xué)者對于這一轉(zhuǎn)變過程的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了大量的研究,近年來相關(guān)MicroRNAs對于黑素瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響引起了廣泛的重視。

Stark對一系列黑素瘤細(xì)胞系MicroRNAs表達(dá)譜進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)目前已知的MicroRNAs中有279種與黑素瘤的各種生物學(xué)行為有直接或間接的關(guān)系。2然而由于MicroRNAs結(jié)構(gòu)特殊,而且其以一種不完全互補(bǔ)的方式與靶基因結(jié)合,導(dǎo)致靶基因難以確定,故其中大部分異常MicroRNAs目前尚無明確意義。此外,由于樣本量小,許多研究結(jié)論缺乏說服力,各個研究之間的標(biāo)準(zhǔn)不一,也難以進(jìn)行橫向比較。黑素瘤相關(guān)MicroRNAs的研究尚不成熟,目前研究主要為以下幾條通路:

2.1 膜受體酪氨酸蛋白激酶通路(RAS－RAF－MEKERK) 此通路RAS被各種生長因子(如:干細(xì)胞因子、纖維生長因子、肝細(xì)胞生長因子等)激活后,可介導(dǎo)RAF的聚集,通過磷酸化作用依次激活絲裂原激活蛋白酶激酶的激酶(MEK)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)。ERK在黑色素痣中有促細(xì)胞有絲分裂的作用。RAS在原發(fā)性黑素瘤中突變率為15%～30%,利用RNA干擾技術(shù)減少RAS可以降低細(xì)胞內(nèi)ERK水平,并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。3后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)RAS是let－7a的靶基因,后者具有抑制RAS表達(dá)的作用,可抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。4此外,活化的ERK可上調(diào)整合素β3的表達(dá),促進(jìn)癌基因的轉(zhuǎn)錄。RAF、MEK和ERK均是RAS的下游基因,RAF在黑素瘤中變異率可達(dá)50%～70%,其主要變異類型為BRAFV600E,且RAF變異一般不與RAS變異同時發(fā)生,故此通路相關(guān)的總變異率可達(dá)到80%～90%。此外,cKIT基因也可激活此通路,Godshalk認(rèn)為該激活因素在肢端型和黏膜型黑素瘤亞型中有較強(qiáng)致癌作用。5cKIT是miR－221的靶基因,后者是最早發(fā)現(xiàn)的與黑素瘤相關(guān)性較大的MicroRNAs之一,Kanemaru運(yùn)用qRT－PCR對94例黑素瘤患者和20名健康者血清miR－221水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)兩者具有明顯的差異,并與腫瘤侵犯程度相關(guān),認(rèn)為其可作為一種可靠的黑素瘤診斷標(biāo)記物；在原位黑素瘤手術(shù)切除后miR－221水平降低,這提示miR－221還可作為一種治療療效和預(yù)后評估的指標(biāo)。6miR－221/222也可調(diào)節(jié)cKIT,還可影響細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑P27的表達(dá),P27對細(xì)胞的增殖、凋亡具有調(diào)節(jié)作用,在黑色素腫瘤由良性向惡性的轉(zhuǎn)變過程中P27表達(dá)逐漸消失。7在黑素瘤的發(fā)展過程中,當(dāng)miR－221/222過度表達(dá)時,cKIT和p27水平下調(diào)。Igoucheva也證實抑制cKIT和p27可使黑素瘤細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。8Mattia還提出ETS－1/miR－222調(diào)節(jié)軸,即致癌基因ETS－1受到miR－222的調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中轉(zhuǎn)錄性激活miR－221/222,而在痣細(xì)胞痣或原位黑素瘤卻抑制miR－221/222的表達(dá)。9此外miR－214還可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子AP－2γ(Transcription Factor AP－2 gamma,TFAP2C)間接激活cKIT。10

2.2 PI3K－AKT通路 此通路在大多數(shù)轉(zhuǎn)移性黑素瘤中被激活,PI3K被生長因子激活后轉(zhuǎn)變?yōu)檠錚IP2進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為PIP3,后者可激發(fā)AKT磷酸化下游蛋白,從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。目前發(fā)現(xiàn)僅有miR－125b水平與AKT3呈負(fù)相關(guān),可能為miR－125b的靶基因。11在原發(fā)性黑素瘤中miR－125b的大幅度下調(diào)與腫瘤的早期轉(zhuǎn)移有關(guān),并與前哨淋巴結(jié)陽性率有關(guān)。12

2.3 P16INK4A－CDK4/6－RB通路 黑素細(xì)胞的凋亡衰老常伴有P16INK4A水平的上升。在大多數(shù)散發(fā)的黑素瘤和30%家族性黑素瘤中P16INK4A會因沉默或變異而鈍化。P16可抑制細(xì)胞周期蛋白D依賴性激酶(cyclin－D－dependent kinases)CDK4和CDK6,而后兩者是維持腫瘤抑制物視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,RB)活性的重要物質(zhì)。P16INK4A的失活會導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D依賴性激酶的超?；罨?通過磷酸化作用使E2F轉(zhuǎn)錄因子從RB上分離,從而上調(diào)細(xì)胞的增殖能力。let－7b通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1、D3、CDK4和細(xì)胞周期蛋白A阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。let－7b在原發(fā)性黑素瘤中明顯下調(diào)。13通過對黑素瘤MicroRNA表達(dá)譜的分析發(fā)現(xiàn)miR－193b的表達(dá)明顯低于良性痣細(xì)胞痣,高表達(dá)的轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞系的增殖和生長的G1期明顯被抑制,miR－193b的靶基因為細(xì)胞周期蛋白D1,后者是影響細(xì)胞周期的主要因素,在包括黑素瘤在內(nèi)的多種腫瘤中普遍高表達(dá)。14miR－205在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的表達(dá)明顯低于原位黑素瘤和良性痣細(xì)胞痣,而重新轉(zhuǎn)染后,可抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究證實miR－205的靶基因為轉(zhuǎn)錄因子E2F1。15,16

2.4 小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia－associated Transcription Factor,MITF) MITF在細(xì)胞的增殖、分化、瘤變中起重要作用。對于細(xì)胞外凋亡信號的整合極為重要。MITF可對Dicer基因進(jìn)行調(diào)節(jié),Dicer酶是MicroRNAs形成的關(guān)鍵酶,參與RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物的形成,所以與黑素瘤相關(guān)的MicroRNAs都與之相關(guān),對于黑色素細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和細(xì)胞周期有廣泛的影響。17有學(xué)者認(rèn)為MITF的水平直接決定色素細(xì)胞的發(fā)展和最終歸宿。在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中MITF表達(dá)水平上調(diào),并與生存率相關(guān)。18最近研究表明MITF對于黑素細(xì)胞的調(diào)節(jié)呈雙向性,其表達(dá)水平過高或過低都會促進(jìn)黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。19此外, MITF是最主要的黑素生成轉(zhuǎn)錄因子,其功能與細(xì)胞內(nèi)POU3F2基因的表達(dá)水平有關(guān)。20

由于MITF的這種特性,以其為靶基因的MicroRNAs不能被簡單地認(rèn)為促癌或抑癌作用,MITF的3'非編碼區(qū)可與miR－137、miR－148/152和miR－124/ 506等許多MicroRNAs的“種子區(qū)域”結(jié)合。21Goswami還發(fā)現(xiàn)MITF還含有另一個較短的3'非編碼區(qū), miR－340可以結(jié)合這兩個非編碼區(qū),其作用是維持MITF含量的穩(wěn)定。22miR－137被認(rèn)為是調(diào)節(jié)MITF表達(dá)水平的主要因素之一,其表達(dá)與MITF呈負(fù)相關(guān)。23研究表明,在直腸癌中miR－137也具有雙重調(diào)節(jié)作用:既可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長,又在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌中高水平表達(dá)。24,25此外,MITF的另一種調(diào)節(jié)基因miR－506在早期黑素瘤中上調(diào),但在轉(zhuǎn)移性黑素瘤標(biāo)本中卻下調(diào)。21MiR－182的靶基因也是MITF,在黑素瘤由原位向轉(zhuǎn)移性發(fā)展的過程中伴隨著該miRNA的明顯上調(diào)。當(dāng)該基因受到抑制時腫瘤細(xì)胞的侵襲性下降,凋亡增加,反之轉(zhuǎn)移性增加。26Mueller還發(fā)現(xiàn)miR－148在黑素瘤侵襲性生長過程中會明顯下調(diào),27對MITF也有重要的調(diào)節(jié)作用。Mazar認(rèn)為MITF對miR－211有調(diào)節(jié)作用,后者在大多數(shù)黑素瘤細(xì)胞系和標(biāo)本中都明顯下調(diào),與黑素瘤的發(fā)展和侵襲有關(guān)。其在黑素瘤和痣細(xì)胞痣中表達(dá)存在顯著差異,可能與黑素瘤的成瘤有關(guān)。28相對于良性痣細(xì)胞痣miR－155在黑素瘤細(xì)胞系中下調(diào),miR－155的表達(dá)可抑制黑素瘤增殖,增加細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR－155的靶基因為SKI。29后者是MITF的強(qiáng)效誘導(dǎo)物,在黑素瘤中常過度表達(dá),有刺激細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。30

2.5 p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1通路 在研究黑素瘤細(xì)胞系miR－149－3p的含量時,發(fā)現(xiàn)6組野生型p53陽性黑素瘤細(xì)胞系miR－149－3p的含量均上調(diào),而另一組p53基因沉默的ME4405細(xì)胞株卻沒有這一現(xiàn)象。31這說明p53有直接上調(diào)miR－149－3p的作用,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR－149－3p與GSK3a的下調(diào)和Mcl－1的上調(diào)有直接的關(guān)系。32而Mcl－1被認(rèn)為是黑素瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。33由此p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1通路可能影響黑素瘤細(xì)胞凋亡。

以上通路之間存在相互聯(lián)系和作用,一種MicroRNAs也可在多條通路中發(fā)揮作用。也有數(shù)種MicroRNAs共同調(diào)節(jié)某一蛋白表達(dá),其中機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語

近年來,黑素瘤的死亡率較為穩(wěn)定,甚至出現(xiàn)了輕度下降,其重要原因為對于該病的早期診斷和手術(shù)水平提高,在T1(≤1.00 mm)10年生存率達(dá)92%,而T4(＞4.00 mm)僅為50%。34WHO黑素瘤分型主要依據(jù)臨床表現(xiàn),然而黑素瘤包含著大量生物學(xué)的改變,在體內(nèi)有眾多的信號通路控制其發(fā)生發(fā)展,根據(jù)其生物學(xué)行為及信號通路影響特點(diǎn)尋求有意義的生物學(xué)標(biāo)記和治療靶點(diǎn)將成為黑素瘤治療的新理念。因此建立一套生物學(xué)分型十分必要,在這種分型中MicroRNAs是可能性最大的潛在標(biāo)志。2007年Gaur等根據(jù)當(dāng)時已知的241種MicroRNAs區(qū)分了多種良惡性腫瘤及其亞型,發(fā)現(xiàn)3種MicroRNAs(miR－146, miR－204 and miR－211)在黑素瘤中異常表達(dá)。35由于MicroRNAs在不同臨床類型和各個病程階段中都有顯著特點(diǎn),每一型黑素瘤都有自身的MicroRNAs表達(dá)譜,找出亞型特異性MicroRNAs及其靶基因?qū)谒亓龅脑缙谠\斷和個體化治療有重要意義。36

1 Filipowicz W,Bhattacharyya SN,Sonenberg N.Mechanisms of posttranscriptional regulation by microRNAs:are the answers in sight?Nat Rev Genet,2008,9(2):102－114.

2 Stark MS,Tyagi S,Nancarrow DJ,et al.Characterization of the melanomamiRNAome by deep sequencing.PLoS One,2010,5 (3):e9685.

3 Eskandarpour M,Kiaii S,Zhu C,etal.Suppression of oncogenic NRAS by RNA interference induces apoptosis of humanmelanoma cells.Int JCancer,2005,115(1):65－73.

4Muller DW,Bosserhoff AK.Integrin beta 3 expression is regulated by let－7amiRNA inmalignantmelanoma.Oncogene,2008, 27(52):6698－6706.

5Godshalk SE,Paranjape T,Nallur S,et al.A variant in amicroRNA complementary site in the 3'UTR of the KIT oncogene increases risk of acralmelanoma.Oncogene,2011,30(13):1542－1550.

6 Kanemaru H,Fukushima S,Yamashita J,et al.The circulating microRNA－221 level in patientswith malignantmelanoma as a new tumourmarker.JDermatol Sci,2011,61(3):187－193.

7 Felicetti F,Errico MC,Bottero L,et al.The promyelocytic leukemia zinc finger－microRNA－221/222 pathway controlsmelanoma progression through multiple oncogenic mechanisms.Cancer Res,2008,68(8):2745－2754.

8 Igoucheva O,Alexeev V.MicroRNA－dependent regulation of cKit in cutaneous melanoma.Biochem Biophys Res Commun, 2009,379(3):790－794.

9Mattia G,Errico MC,PetriniM,et al.Constitutive activation of the ETS－1－miR－222 circuitry in metastatic melanoma.Pigment CellMelanoma Res,2011,24(5):953－965.

10Penna E,Orso F,Tenaglia E,et al.MicroRNA－214 contributes to melanoma tumour progression through suppression of TFAP2C.EMBO J,2011,30(10):1990－2007.

11Glud M,Manfe V,Biskup E,et al.MicroRNAmiR－125b in-duces senescence in human melanoma cells.Melanoma Res, 2011,21(3):253－256.

12Glud M,Rossing M,Hother C,et al.Downregulation ofmiR－125b in metastatic cutaneous malignantmelanoma.Melanoma Res,2010,20(6):479－484.

13Schultz J,Lorenz P,Gross G,et al.MicroRNA let－7b targets important cell cyclemolecules inmalignantmelanoma cells and interfereswith anchorage－independent growth.Cell Res,2008, 18(5):549－557.

14 Chen J,Feilotter HE,Zhang X,et al.MicroRNA－193b represses cell proliferation and regulates cyclin D1 in melanoma. Am JPathol,2010,176(5):2520－2529.

15 Dar AA,Majid S,de Sem ir D,et al.miRNA－205 suppresses melanoma cell proliferation and induces senescence via regulation of E2F1 protein.Biol Chem,2011,286(19):16606－16614.

16Philippidou D,Schmitt M,Moser D,et al.Signatures ofmicroRNAs and selected microRNA target genes in humanmelanoma.Cancer Res,2010,70(10):4163－4173.

17 Vachtenheim J,Borovansky J."Transcription physiology"of pigment formation in melanocytes:central role of MITF.Exp Dermatol,2010,19(7):617－627.

18Gray－Schopfer V,Wellbrock C,Marais R.Melanoma biology and new targeted therapy.Nature,2007,445(7130):851－857.

19 Cheli Y,Giuliano S,Botton T,et al.Mitf is the keymolecular switch between mouse or human melanoma initiating cells and their differentiated progeny.Oncogene,2011,30(20):2307－2318.

20Hoek KS,Goding CR.Cancer stem cells versus phenotypeswitching in melanoma.Pigment Cell Melanoma Res,2010,23 (6):746－759.

21 Haflidadottir BS,Bergsteinsdottir K,Praetorius C,et al.miR－148 regulates Mitf in melanoma cells.PLoS One,2010,5(7): e11574.

22Goswami S,Tarapore RS,Teslaa JJ,et al.MicroRNA－340－mediated degradation of microphthalmia－associated transcription factormRNA is inhibited by the coding region determinantbinding protein.JBiol Chem,2010,285(27):20532－20540.

23Deng Y,Deng H,Bi F,etal.MicroRNA－137 targets carboxyl－terminal binding protein 1 in melanoma cell lines.Int J Biol Sci,2011,7(1):133－137.

24 Bandres E,Agirre X,Bitarte N,et al.Epigenetic regulation of microRNA expression in colorectal cancer.Int JCancer,2009, 125(11):2737－2743.

25 Huang ZM,Yang J,Shen XY,et al.MicroRNA expression profile in non－cancerous colonic tissue associated with lymph nodemetastasis of colon cancer.JDig Dis,2009,10(3):188－194.

26 Segura MF,Hanniford D,Menendez S,et al.AberrantmiR－182 expression promotes melanoma metastasis by repressing FOXO3 and microphthalmia－associated transcription factor. Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(6):1814－1819.

27Mueller DW,RehliM,Bosserhoff AK.miRNA expression profiling in melanocytes and melanoma cell lines reveals miRNAs associated with formation and progression ofmalignantmelanoma.J Invest Dermatol,2009,129(7):1740－1751.

28Mazar J,DeYoung K,Khaitan D,etal.The regulation ofmiRNA－211 expression and its role inmelanoma cell invasiveness. PLoSOne,2010,5(11):13779.

29 Levati L,Pagani E,Romani S,et al.MicroRNA－155 targets the SKIgene in humanmelanoma cell lines.Pigment Cell Melanoma Res,2011,24(3):538－550.

30 Chen D,XuW,Bales E,et al.SKIactivatesWnt/beta－catenin signalling in humanmelanoma.Cancer Res,2003,63(20): 6626－6634.

31 Avery－Kiejda KA,Zhang XD,Admas LJ,et al.Smallmolecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA－damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res,2008,14(6):1659－1668.

32 Jin L,Hu WL,Jiang CC,etal.MicroRNA－149?,a p53－responsivemicroRNA,functions as an oncogenic regulator in humanmelanoma.Proc Natul Acad Sic USA,2011,108(38): 15840－15845.

33 Jiang CC,Lucas K,Avery－Kiejda KA,et al.Up－regulation of Mcl－1 is critical for survival ofhumanmelanoma cells upon endoplasm ic reticulum stress.Cancer Res,2008,68(16):6708－6717.

34 Balch CM,Gershenwald JE,Soong SJ,et al.Final version of 2009 AJCCmelanoma staging and classification.JClin Oncol, 2009,27(36):6199－6206.

35Gaur A,Jewell DA,Liang Y,et al.Characterization of microRNA expression levels and their biological correlates in human cancer cell lines.Cancer Res,2007,67(6):2456－2468.

36 Nana－Sinkam SP,Fabbri M,Croce CM.MicroRNAs in cancer:personalizing diagnosis and therapy.Ann NY Acad Sci, 2010,1210:25－33.

(收稿:2013－04－16 修回:2013－08－04)

M icroRNAs in melanoma

WU Fei,SONGNing-jing.Shanghai Skin Disease Hospital,Shanghai,200443

MicroRNAs can affectmelanoma biology through multiple signaling pathways(RAS－RAF－MEK－ERK,PI3K－AKT,P16INK4A－CDK4/6－RB,MITF,p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1).Researches on MicroRNAs are of significance in early diagnosis,prognostic judgment and target therapies ofmelanoma.

melanoma；MicroRNAs；target gene；signaling pathways

1安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚性病臨床學(xué)院,上海,200443

2上海市皮膚病醫(yī)院,上海,200443

?通信作者