解磷微生物的分離與篩選

鐘傳青，曹廣祥，黃為一

（1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南250101；2.山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南250062；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210095）

0 引言

磷作為植物體內(nèi)有機化合物的主要成分，有利于硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化與利用，為生物固氮所必需，同時能促進(jìn)植物體內(nèi)碳水化合物的運輸和淀粉的轉(zhuǎn)化，因此，磷元素對于植物的光合作用、呼吸作用、脂肪代謝、氮代謝等都是不可缺少的［1］。然而我國耕地土壤中全磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.2～1.1 g／kg土之間變動［2］，許多土壤磷素嚴(yán)重供應(yīng)不足，大部分磷以難溶態(tài)存在，不能被植物直接吸收利用。

微生物廣泛存在于自然界比如土壤、空氣和水等環(huán)境中，有的微生物能夠分解或者富集土壤中的有毒物質(zhì)，如石油烴、農(nóng)藥、重金屬等［3－6］；有的能夠降解土壤中的纖維素、木質(zhì)素等［7］；少數(shù)微生物能夠固定空氣中的游離氮素［8］，為植物提供營養(yǎng)；或者分泌生長素、激素等刺激植物生長的物質(zhì)［9－11］。解磷微生物也是眾多土壤微生物中的一種，該類微生物可以分泌磷酸酶及有機酸來促進(jìn)土壤難溶磷向有效磷的轉(zhuǎn)化［12－14］，以促進(jìn)植物的生長發(fā)育，縮短開花期，提高作物產(chǎn)量。

相關(guān)試驗表明，施用解磷微生物肥料的土壤，其有效磷含量均有所增加［15］。解磷微生物的分離與篩選工作量大，因此建立簡單、有效的篩選模型顯得尤為重要。文中研究從全國部分省份、不同地區(qū)采樣，采樣地點涵蓋山東、江蘇、安徽、福建、江西、四川、陜西等省份，同一地區(qū)根據(jù)土壤類型、植被種類等選取不同地點進(jìn)行采樣，以從中分離和篩選能夠轉(zhuǎn)化難溶磷為有效磷的解磷微生物。研究結(jié)果表明在解磷微生物分離過程中，選用無機磷固體平板作為初篩模型，根據(jù)其溶磷圈有無及直徑大小確定是否具有解磷作用，操作簡便，成本低；然后進(jìn)一步利用磷礦粉液體發(fā)酵試驗為復(fù)篩模型確定具有較強解磷效果的菌株，為將其制成微生物菌劑提供了豐富的解磷微生物資源，同時為微生物磷肥的研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從全國部分省份不同類型土壤中采樣，共采集24個樣品；同時選用不同植物種子，以其種皮作為分離解磷微生物的樣品來源。

1.2 培養(yǎng)基

（1）培養(yǎng)基A采用0.25 g的七水合硫酸鎂，10.00 g的葡萄糖，0.10 g的氯化鈣，2.00 g的酵母膏，1000 mL的蒸餾水，15～20 g的瓊脂，105℃滅菌30 min。另外將已滅菌的1 mL 10%的磷酸二氫鉀溶液與10 mL 10%的氯化鈣溶液混合，待出現(xiàn)大量白色沉淀后加入50 mL已滅菌的培養(yǎng)基A，并用0.1 mol／L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH值至 7.0，最后倒平板。

（2）培養(yǎng)基B采用0.30 g的七水合硫酸鎂，0.03 g的七水合硫酸亞鐵，0.03 g的一水合硫酸錳，5.00 g的磷酸鈣，1000 mL的蒸餾水，pH值為7.0～7.5，20 g的瓊脂，105℃滅菌30 min。

（3）培養(yǎng)基 C采用10.00 g的蛋白胨，5.00 g的牛肉膏，5.00 g的氯化鈉，1000 mL的蒸餾水，pH值為7.2～7.4。121℃滅菌20 min。

（4）培養(yǎng)基 D采用10.00 g的葡萄糖，0.50 g的硫酸銨，0.30 g的氯化鈉，0.30 g的氯化鉀，0.30 g的七水合硫酸鎂，0.03 g的 七水合硫酸亞鐵，0.03 g的一水合硫酸錳，1000 mL的蒸餾水，5.00 g的磷礦粉，pH值為7.0～7.5，105℃滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 解磷微生物的分離與初篩

稱取10.00 g的待測土樣，在超凈工作臺內(nèi)將稱好的土樣放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，28℃、200 rpm條件下振蕩30 min后進(jìn)行梯度稀釋，在培養(yǎng)基 A固體平板涂布后28℃倒置培養(yǎng)48 h。將其中生長較快的微生物單菌落劃線在培養(yǎng)基B固體平板上，鏡檢觀察菌體形態(tài)是否一致，同時記錄各菌株的生長狀況、菌體形態(tài)以及對無機磷的利用情況。

1.3.2 解磷微生物的復(fù)篩

（1）種子液制備

將初篩時生長較快、溶磷圈較大的菌株進(jìn)行活化，經(jīng)鏡檢合格后將其接入裝有50 mL培養(yǎng)基C的三角瓶中，28℃、200 rpm培養(yǎng)48 h后備用。

（2）磷礦粉液體發(fā)酵

按照10%接種量重新接入含有50 mL培養(yǎng)基D的三角瓶中。分別設(shè)空白（接入空白培養(yǎng)基D）、接滅活菌（接入含有等量菌體的滅菌發(fā)酵液）、接活菌三個處理，每個處理再設(shè)三個重復(fù)。將各三角瓶放于200 rpm的搖床上28℃下培養(yǎng)7 d。

（3）發(fā)酵液中可溶性磷含量的測定

發(fā)酵結(jié)束后將所有錐形瓶121℃滅菌40 min，加兩滴6%H2O2后放入60℃水浴鍋中水浴48 h，定量濾紙過濾后將其定容至55 mL。吸取15 mL濾液，4000 rpm離心10 min，吸5～10 mL上清于50 mL容量瓶中，同時另取容量瓶，吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液加水至30 mL。滴加兩滴二硝基酚指示劑于上述容量瓶中，再加4 N氫氧化鈉溶液至溶液變黃后滴加2 N硫酸1～2滴使其剛剛褪色。加5 mL鉬銻抗試劑后加水定容，混勻。25～30℃顯色0.5 h，用分光光度計700 nm進(jìn)行比色，計算并記錄有效磷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷微生物的分離

從微生物分離結(jié)果來看（見表1），在采集的土樣中，解磷微生物數(shù)量較多，以細(xì)菌為主，其次為霉菌與酵母，解磷微生物種類豐富。菜園土與種子表面所含解磷微生物種類較多，可能是因為菜園土有機質(zhì)豐富，能夠給解磷微生物提供碳氮源及其他營養(yǎng)成分。不同類型、不同省份來源的土壤樣品中解磷微生物種類與數(shù)量均不同，究其原因可能是土壤類型不同，然而樣品有效磷總量與解磷微生物數(shù)量不呈正相關(guān)。為能夠從中篩選出高效解磷微生物，滿足植物對磷的需求，還需從以上微生物中篩選出解磷能力較強的微生物，制成微生物菌劑，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

2.2 解磷微生物的初篩與鑒定

將分離出的解磷菌株在培養(yǎng)基B上劃線，根據(jù)其生長速度、溶磷圈大小等篩選出生長較快、解磷效果較好的菌株。在平板上生長48 h的部分微生物菌落特征如圖1所示，括號內(nèi)是根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)與生理生化特征研究進(jìn)行初步鑒定，將菌株鑒定到屬的結(jié)果。結(jié)果表明：由模型分離出的解磷微生物有細(xì)菌、霉菌、酵母等，這些微生物能夠溶解培養(yǎng)基中的難溶磷，使平板產(chǎn)生透明溶磷圈。溶磷圈是解磷微生物的特征之一，有溶磷圈的微生物能夠溶解培養(yǎng)基中的難溶磷，從而產(chǎn)生透明圈；溶磷圈的大小與其生物量有關(guān)。培養(yǎng)基A能夠產(chǎn)生磷酸三鈣、磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣，以及少量的氫氧化鈣，因此如果能夠在培養(yǎng)基A上產(chǎn)生透明圈，說明該微生物能夠溶解其中的沉淀，具有解磷能力。

表1 不同來源解磷微生物的數(shù)量和種類分布

2.3 解磷微生物的復(fù)篩

部分溶磷微生物的復(fù)篩結(jié)果見表2。微生物的解磷能力需要通過復(fù)篩試驗進(jìn)一步確定其對難溶磷的溶解能力，初篩得到的解磷微生物，能夠溶解培養(yǎng)基A產(chǎn)生的磷酸三鈣、磷酸氫鈣等，如果微生物能夠分泌酸，也會產(chǎn)生透明圈；另一方面，有的解磷微生物雖然不能溶解磷酸三鈣，也有可能對其他難溶磷比如磷酸鐵、磷酸鋁等有溶解效果，因此需要進(jìn)一步通過復(fù)篩試驗確認(rèn)其解磷效果。接滅活菌是為了排除因接菌處理帶入的微生物量磷及其代謝產(chǎn)物引起難溶磷的溶解，接菌處理有效磷含量與接培養(yǎng)基對照的比值反應(yīng)了該微生物的溶磷效果。經(jīng)分析可知，P17、Y3、P10、P103、F4等菌株溶磷效果均較好。培養(yǎng)基D中的磷礦粉，可以更換為其他難溶性磷源，從而確認(rèn)待測微生物對不同難溶磷的溶解效果。

圖1 樣品中分離出的解磷微生物（a）霉菌 P103（木霉屬）；（b）霉菌 P128（曲霉屬）；（c）霉菌 F4（青霉屬）；（d）酵母Y3（紅酵母屬）；（e）細(xì)菌P10（短桿菌屬）；（f）細(xì)菌P17（芽孢桿菌屬）

表2 溶磷微生物的復(fù)篩結(jié)果

3 結(jié)論

文章從來自全國各地26個樣品中分離出2000多株解磷微生物，確立了能夠有效分離解磷微生物的篩選模型。這些解磷微生物包括細(xì)菌、霉菌和酵母等，其中菜園土中有機質(zhì)含量高，解磷微生物數(shù)量較多，四川苗圃菜園土中解磷微生物高達(dá)168 CFU／mL；種子表皮如大豆表皮中解磷微生物數(shù)量高達(dá)138 CFU／mL。不同省份、不同類型的土壤樣品中解磷微生物種類和數(shù)量存在顯著差異。通過解磷微生物的初篩和復(fù)篩模型分別篩選到木霉P103、曲霉P128、青霉F4、短桿菌P10、紅酵母Y3和芽孢桿菌P17等多株高效解磷微生物，對于溶磷效果較好的微生物，需要進(jìn)一步研究其是否具有植物病原性，以及是否能夠分泌促進(jìn)植物生長的代謝產(chǎn)物與激素等，為將其用于實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

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