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    萊姆病螺旋體檢測技術的進展

    2014-01-23 09:03:11王瑋琳
    中國實驗診斷學 2014年3期
    關鍵詞:萊姆病靈敏性螺旋體

    鄭 旭,王瑋琳,丁 旭,喬 萍*,劉 陽*

    (1.吉林大學 基礎醫(yī)學院藥理系,吉林 長春130021;2.吉林出入境檢驗檢驗局,吉林 長春130062)

    1 萊姆病螺旋體簡介

    萊姆病(Lyme Disease,LD)最早發(fā)現(xiàn)于美國的Lyme鎮(zhèn)并由此得名,萊姆病是由蜱傳播的一種自然疫源性、人畜共患疾病,通過肩突硬蜱感染人體宿主,可引起多系統(tǒng)器官損害,游走性紅斑、神經(jīng)炎、關節(jié)炎、心肌炎等。1982年Burgdorfer W等人成功從肩突硬蜱(Ixodes ricinus)中分離出萊姆病病原體——螺旋體[1],螺旋體感染通常是開始于肩突硬蜱幼蟲階段,主要以哺乳動物為宿主,積聚于宿主中腸。十九世紀末美國CDC已報道病例200 000多例,二十世紀初也有數(shù)萬件病例。萊姆病分布較廣泛,全球70多個國家都有該病發(fā)生,我國已有30多個省市發(fā)生該病。

    1984年螺旋體被正式命名為伯氏疏螺旋體[2],屬于原核生物界螺旋體目螺旋體科疏螺旋體屬的一種,是一種單細胞疏松盤繞的左旋螺旋體,菌體長20-30 μm,寬0.2-0.3 μm。蜱傳播的疏螺旋體屬包含約40個種屬,通過不同的宿主相互作用和攜帶病原體的載體特異性,將螺旋菌分2個主群:回歸熱(RF)螺旋體和復雜狹義伯氏疏螺旋體。RF螺旋體通過“軟蜱”傳染,復雜狹義伯氏疏螺旋體通過“硬蜱” 引起萊姆病。宿主和載體的特異性可以更容易的區(qū)分RF和伯氏疏螺旋體。

    伯氏疏螺旋體在細菌中是最復雜的一個,基因組包含950 kb線性染色體、范圍在9-62 kb,由不同的線性質粒和環(huán)形質粒組成,線性擴增子有共價閉合端粒,擴增子需要端粒解離酶ResT,基因組有很低的G+C,含量大約在28%左右。大約5%的螺旋體染色體和15%質?;蚓幋a130多個脂質蛋白。螺旋體的外膜蛋白(outer surface proteins,Osp)大多是脂質蛋白,已被報道的OspA、OspB、OspC、OspD、OspE和 OspF等。其中具有抗原性的是OspA、OspC和 OspF。許多文獻都研究過外膜蛋白,針對這些蛋白的抗原性采用相

    應抗體進行檢測,其中應用多克隆抗體檢測結合蛋白質印跡法(Western blot ),以區(qū)分不同的致病病原體抗原,但至今仍然沒有一個準確的抗原Marker,確定抗原Marker可以更好更快的檢測。外膜蛋白可以在萊姆病不同的發(fā)病階段被檢測,但每個階段如何檢測沒有統(tǒng)一的標準。許多學者也一直致力于這方面的研究。

    伯氏疏螺旋體有數(shù)十幾種基因型:B.buredorferi sensu stricto、B.garinii、B.afzelii、B.japanica、B.valaisiana、B.1usitaniae、B.andersonii、B.tanulkii、B.turdi、B.bissetii、.B.hermsii、B.sinica、B.bavariensis sp.nov、B.spielmanii、 B.valaisiana 、B.yangtze sp.nov.等。其中,B.burgdorferi ss、B.afzelii、 B.bissettii、B.garinii、B.lusitaniae和B.bavariensis sp.nov.主要流行于歐洲中部,在美國B.burgdorferi ss是主要的病原體,我國病原體則以B.garinii為主,其次為B.afzelii 和B.burgdorferi ss。其中有四種基因型有致病性即狹義伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi sensus stricto)、伽氏疏螺旋體(B.garinii)、阿氏疏螺旋體(B.Afzelii)、B.spielmanii,其余的潛在病原體仍然不是很清晰。然而,在臨床病人體中存在的B.bissettii、B.lusitaniae和B.valaisiana也有跡象可能引起萊姆病[3-4]。

    為了滿足實驗診斷,許多新的檢測方法被應用,如應用酶聯(lián)反應檢測特異性抗體、重組抗原、表位抗原;應用分子生物學方法進行檢測,如PCR、熒光定量PCR及聯(lián)合應用RFLP、LAMP等。本文對萊姆病螺旋體的檢測方法進行綜述,以期能夠為將來的研究提供幫助。

    2 直接檢測

    最初實驗室的診斷是分離菌體,螺旋體通過BSK完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng),在生長14天后可在暗視野相差顯微鏡下觀察其形態(tài),雖然現(xiàn)在的實驗試劑都已經(jīng)商品化,大大縮短了原有的培養(yǎng)基準備和配置時間,但仍無法做到快速檢測,所以培養(yǎng)菌體不是我們進行檢測的主要手段。

    3 免疫學技術檢測

    萊姆病常常在感染初期階段被診斷,而游走性紅斑(EM)常作為臨床的診斷標準。但EM只在一部分病例中出現(xiàn),大約40%的游走性紅斑患者血清呈陰性,也有感染后持續(xù)很多年才在健康人群中發(fā)現(xiàn)血清呈陽性。因此,不能作為確診的唯一標準。有些病人可能有非典型皮損,或沒有皮膚癥狀,但實驗室檢測結果陽性時也可診斷為萊姆病螺旋體感染。這些檢測通常旨在檢測特異的IgM 或IgG 抗螺旋體抗體。

    最早的檢測方法是應用間接免疫熒光檢測IIFA。ELISA也廣泛應用于輔助診斷,但不能準確分辨萊姆病的致病基因型,同時也會出現(xiàn)假陽性的結果,其靈敏性低。按照歐洲標準,在兩個階段進行血清學診斷,第一階段包括應用ELISA方法,檢測IgM和IgG抗體水平。第二階段應用免疫印跡法(IB)進一步檢測不確定的結果。此后經(jīng)過不斷的對比和改良,將第一階段的ELISA換成 IIFA再聯(lián)合 IB,大大提高了實驗的準確性。但這種檢測也還存在一定的缺陷,選擇一個合適的抗原對于血清學的檢測是很重要的,如p30、p31、p39、p83、Osp17可作為重要的抗原,但抗原的檢測會產生一定的交叉反應,使得檢測仍無法得到十分準確的結果,感染早期OspC是最要的抗原之一,蜱在幼蟲時感染螺旋體就可表達,部分學者認為OspC和VlsE抗原可以作為檢測抗原。針對這些抗原除傳統(tǒng)的一些方法,現(xiàn)在普遍應用的蛋白質印跡法(Western blot )結果通過特異條帶表示,可以很好的區(qū)分疫苗反應產生的抗體和自然產生的抗體,所以WB的特異性較傳統(tǒng)方法好。但因為條帶局限于主觀視覺可導致假陽性,抗體反應也各有不同,所以診斷標準尚不明確。

    螺旋體特異性抗原即使感染了幾周也不易察覺,也沒有明顯的感染癥狀,直接培養(yǎng)和普通PCR的診斷方法敏感性過低,近年來為了能在早期就可以檢測到感染的活體病原,學者通過淋巴細胞轉化實驗(lym-phocyte transformation test,LTT)應用裂解液裂解抗原檢測健康個體陰性血清與陽性血清,在臨床上即使應用抗生素治療LTT也可以達到很高的準確性和特異性[5]。應用(LC)-MS/MS(gel-based liquid chromatography)和(2D)-LC-MS/MS技術檢測不同蛋白,在所檢測的286種蛋白中,有97種在三個致病螺旋體中發(fā)現(xiàn),可作為靶蛋白應用于普及性的疫苗以阻止不同種螺旋體所引起的萊姆病[6]。

    隨著LD血清學的發(fā)展,應用重組抗原大大提高了檢測的準確性和靈敏性,除外膜蛋白A、B、C、E、F,還有FlaA,BBK32,P35,VlsE和DbpA。重組蛋白在感染的不同階段針對IgG和IgM,大大提高了檢測效率和結果的準確性,在血清學診斷中重組抗原單獨應用或聯(lián)合應用,與應用單獨全蛋白相比減少了交叉反應。另外,也可以聯(lián)合應用不同的免疫學方法檢測重組抗原,如ELISA-IB可增加靈敏性。目前部分學者研究發(fā)明一種新方法免疫聚合酶鏈式反應(Immuno-PCR,IPCR)以感染螺旋體產生的宿主免疫應答為基礎,應用重組抗原在體內表達促進免疫應答產生相應抗體進行檢測[7]。IPCR是一種液相蛋白檢測方法,結合了PCR的靈敏性以及免疫分析為基礎的特異性和多樣性,對于直接檢測血液中的病原體和多宿主免疫應答抗體的檢測,IPCR有潛在的可應用性[8-9]。

    除上述針對IgG和IgM抗體的體外實驗檢測,也可通過自身的細胞免疫應答進行增殖分析,萊姆病螺旋體細胞免疫應答已被應用到外周血單核細胞或病人感染組織的細胞。螺旋體功能性抗體檢測:有研究認為,萊姆病早期的血清陰性結果是形成了特異的抗原—抗體復合物,阻礙了對自由抗體的檢測。抑制螺旋體抗體實驗是通過螺旋體、臨床病人的血清、外源性補體共同培養(yǎng),觀察螺旋體生長抑制進行判斷。循環(huán)免疫復合物抗體的檢測,首先將免疫復合物從血清中沉淀,然后裂解復合物,釋放抗體,以便抗體能被ELISA或Western blot檢測,這種方法適用于早期萊姆病常規(guī)檢測血清呈陰性的病例,以及判定陽性血清是否假陽性。

    4 分子生物技術檢測

    對于萊姆病螺旋體的分子生物學檢測主要是PCR方法,在大多數(shù)的研究中針對不同的基因序列設計引物,如針對OspC、OspA、16SrRNA、5S-23SrRNA。在實驗診斷中,PCR方法因為快速及相對簡便而起到很重要的作用,各種PCR方法包括傳統(tǒng)PCR,巢式PCR,實時定量PCR。1989年第一次應用PCR檢測螺旋體,與免疫學方法相比PCR檢測可以省去培養(yǎng)、觀察及操作中的時間損耗,且更為靈敏,在不斷的發(fā)展中,各種不同的PCR也日益完善。

    在不同的病原體細菌中,對于診斷、流行病調查和對病原體中主要基因的追蹤,分子生物學提供了強有力的方法。PCR特異性應用于體內培養(yǎng)困難的病原體檢測同時也適用于感染螺旋體的檢測,如rrs編碼16SrRNA,ospA編碼外膜蛋白A,flaB編碼鞭毛等,以DNA為基礎的多種標記物能夠區(qū)分螺旋體種類。

    應用于螺旋體鑒定的大部分方法,如PCR,脈沖場凝膠電泳,隨機擴增DNA等,花費大量時間和經(jīng)費而且人為的錯誤和污染也不能避免。PCR基礎方法中,巢氏PCR被認為是臨床檢測螺旋體菌屬最敏感的方法之一,以基因內部片段:flaB,5S,23S,ospA等為靶基因進行引物設計,雖然引物設計更復雜,但避免了交叉反應。同時也減少了單一PCR產物的錯配、人為原因等誤差,可更好的增加準確性、重復性、敏感性。

    熒光定量PCR技術,融匯了PCR高靈敏性、DNA 雜交的高特異性和光譜技術的高精確定量等優(yōu)點,通過直接探測PCR過程中熒光信號的變化,以獲得定量的結果,使得檢測更方便快捷,擴增靶基因的同時也可通過一個PCR過程檢測靶基因產物,減少環(huán)境對目的基因產物的污染。很多文章報道了以熒光PCR方法檢測螺旋體種屬水平,螺旋體基因如hbb,p66,recA,ospA,glpQ,16S rRNA等,區(qū)分狹義螺旋體種類,擴增DNA的擴增子很容易確定解鏈溫度,不需要以往的PCR過程。熒光PCR可快速檢測臨床樣本、動物組織、及環(huán)境中存在的病原體。

    PCR有不同的靈敏性,包含種屬特異性探針的PCR相對傳統(tǒng)PCR以及高靈敏和特異性的實時定量PCR(qPCR)更有優(yōu)勢,例如針對5S-23S,16S,ospA特異性序列,以TaqMan(MGB)為探針檢測蜱中螺旋體病原體比TaqMan減少更多的錯配。

    PCR也可結合不同的檢測手段進行診斷,主要有限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP) 和反向線狀印跡(Reverse line blot,RLB),但是PCR結合RFLP、RLB在區(qū)分本病病原時需要復雜的系統(tǒng),及專業(yè)的技術人員,費時費力,對實驗操作要求較高。PCR方法用于檢測伯氏疏螺旋體時,由于其基因的多態(tài)性無法有一個標準直接鑒別伯氏疏螺旋體,所以也會花費大量的鑒定時間。另一種核酸擴增方法——環(huán)介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[10]用于實驗檢測,具有更高的靈敏性和擴增效率,LAMP可以控制酶反應的最佳溫度,相比傳統(tǒng)PCR在最后階段很少發(fā)生擴增的抑制反應 ,較之前的方法簡便,但溫度的控制卻很難把握。

    綜上所述,萊姆病的檢測所應用的方法只是輔助檢測手段,不能作為確診的標準?,F(xiàn)今,因地域不同,感染蜱傳疾病的情況有所差異。同時蜱傳疾病的菌種容易產生多種變異菌株,各種遺傳和變異特性很難確定,不利于對萊姆病的預防和治療的研究,目前蜱傳疾病已引起許多學者的廣泛關注,隨著對其致病機理研究的更加透徹,其檢測方法的研究也勢必飛速發(fā)展。

    參考文獻:

    [1]Burgdorfer W,Barb our AG,Hayes SF,et al.Lyme disease a tick borne spirochetes[J].Science,1982,216:1317.

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    [3]Collares-Pereira M,Couceiro S,Franca I,et al.First isolation of Borrelia lusitaniae from a human patient[J].Clin Microbiol,2004,42:1316.

    [4]Rudenko N,Golovchenko M,Mokracek A,et al.Detection of Borrelia bissettii in cardiac valve tissue of a patient with endocarditis and aortic valve stenosis in the Czech Republic[J].Clin Microbiol,2008,46:3540.

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    [9]Heikkila T,I Seppala,H Saxen,et al.Species-specific serodiagnosis of Lyme arthritis and neuroborreliosis due to Borrelia burgdorferi sensu stricto,B.afzelii,and B.garinii by using decorin binding protein A [J].Clin Microbiol,2002,40:453.

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