早期應用艾司洛爾對LPS誘導膿毒癥大鼠心功能的影響

王胤中，史克潔，穆心葦

(南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院重癥醫(yī)學科，江蘇南京 210006)

膿毒癥是由感染所導致的全身性炎癥反應，它在危重病人中有較高的發(fā)病率。事實上，膿毒癥是全世界非冠心病重癥監(jiān)護病房主要的死亡原因［1］。在膿毒癥過程中，機體的腎上腺素能使神經系統(tǒng)處于高度激活狀態(tài)，加之糾正休克時使用的大量血管活性藥物，使得內源性與外源性的兒茶酚胺產生疊加效應，首先，增快心率，增強心肌收縮力，但也增加了心肌氧耗;其二，激活的交感神經使IL-6和TNF-α的釋放增加1 000倍［2］，最終引起心肌損害，心功能受抑制。此前國內外已有大量的研究證實，膿毒癥的患者往往伴有心功能受損。

此前β受體阻滯劑主要應用在心肌梗死、心力衰竭等心血管領域。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)在圍手術期、多發(fā)傷、燒傷等患者中應用β受體阻滯劑，可降低病死率，改善預后。

本實驗旨在研究早期應用β1受體阻滯劑艾司洛爾的膿毒癥大鼠模型，觀察其心肌損傷標志物、心肌細胞β1、β2、β3受體亞型含量、心肌線粒體超微結構以及心肌病理形態(tài)學改變，以了解艾司洛爾對損傷心肌的保護作用，為臨床膿毒癥患者早期干預提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠60只，體重(280±20)g，由南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院動物實驗中心提供并飼養(yǎng)，大鼠飼料及飲水均由該中心提供。

1.2 動物分組 按隨機數字表法將大鼠分成:膿毒癥組(LPS組)10只，LPS建立大鼠模型。

艾司洛爾組(ESM組)40只，LPS建立大鼠模型，按艾司洛爾給予時機及不同劑量分4個亞組，A1組:即刻給予低劑量艾司洛爾;A2:即刻給予高劑量艾司洛爾;B1組:6 h后給予低劑量艾司洛爾;B2:6 h后給予高劑量艾司洛爾?？瞻捉M(X組)10只，生理鹽水注射。

1.3 主要試劑及藥品 艾司洛爾(齊魯制藥有限公司 20130614)，LPS(美國 sigma L2880)，Tn-I試劑盒(美國 TSZ DL7757)，CA試劑盒(美國 TSZ NH4898)，NT-proBNP試劑盒(美國 TSZ MH4968)，β1-AR試劑盒(美國 TSZ HU8366)，β2-AR試劑盒(美國 TSZ HU7954)，β3-AR試劑盒(美國 TSZ HU9613)，全蛋白提取試劑盒(中國 凱基KGP2100)，BCA蛋白含量檢測試劑盒(中國 凱基KGPBCA)。

1.4 膿毒癥動物模型的建立 購買的大鼠在實驗中心飼養(yǎng)1周，建立LPS模型前放置右側頸內靜脈導管并保留用以輸液。置管后單籠飼養(yǎng)，每日肝素鹽水沖管。觀察3 d后，大鼠進食正常，無死亡，確定靜脈通路放置成功后再建立模型。LPS組及ESM組均給予LPS 10 mg·kg-1腹腔注射［3］。本實驗中動物按照動物倫理學標準處置。

1.5 給藥方案 所有大鼠均在開始實驗時就給予生理鹽水10 mL·kg-1·h-1持續(xù)泵入，共計12 h。A1組在給予LPS處理后立即經頸內靜脈持續(xù)微量泵泵入艾司洛爾，劑量為10 mg·kg-1·h-1，使用6 h后停用;A2組艾司洛爾，劑量為20 mg·kg-1·h-1［4］，使用6 h后停用。B1組在給予LPS處理6 h后經頸內靜脈持續(xù)微量泵泵入艾司洛爾，劑量為10 mg·kg-1·h-1，使用6 h后停用;B2組艾司洛爾，劑量為20 mg·kg-1·h-1，使用6 h后停用。

1.6 樣本采集及觀察指標

1.6.1 心功能指標 采取和Guo等一樣的方法進行心功能測定［5］，本實驗采用 VisualSonics，Vevo 2100超聲儀，頻率為21 MHz探頭對大鼠行超聲心動圖檢查。所有藥物使用完畢1 h后，經氣體異氟烷全麻后通過超聲心動圖測得心臟射血分數(EF%)及左室短軸縮短率(FS%)。

1.6.2 大鼠血清制備與貯存 自右側頸內靜脈脈取血4 mL，離心制備血清，置于-70℃低溫冰箱保存，待行肌鈣蛋白(TN-I)、兒茶酚胺(CA)、N 端腦鈉肽前體(NT-proBNP)檢測。均用 ELISA法檢測，按試劑說明書操作。

1.6.3 大鼠心肌組織收集與貯存 取血后迅速打開胸腔，取出心臟，用預冷生理鹽水沖洗干凈后，濾紙吸干，無菌留取左室近心尖心肌組織迅速放入液氮凍存4 h，后取出保存于-70℃低溫冰箱，用以制備組織勻漿，提取心肌全蛋白，并運用ELISA法檢測心肌組織β受體亞型含量。

1.6.4 大鼠心肌組織的病理學檢查 在LPS組、A1、B1、X組隨機選取1只大鼠，另外再取近心尖心肌組織1塊，4%多聚甲醛固定。標本石蠟包埋，切片，免疫組化，觀察。

1.6.5 大鼠心肌線粒體的超微結構檢查 在LPS組、A1、X組隨機選取1只大鼠，另外再取近心尖心肌組織1塊，2.5%戊二醛固定。鋨酸固定，脫水，樹脂包埋，超薄切片，電子染色，觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包，計量資料以均數±標準差(±s)表示，均通過正態(tài)性檢驗。多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析。組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 心功能指標 ESM各組較LPS組在EF%及FS%上均有好轉，有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，但A1組與A2組之間、B1組與B2組之間EF%及FS%無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(見表1)。由于艾司洛爾是超短效β1受體阻滯劑，半衰期只有9 min，本實驗設計是停用藥物1 h后測量心功能，此時艾司洛爾對于機體的直接作用已經消失，這時測量的心功能反映的是LPS及艾司洛爾共同作用后的結果。見圖1～3。

表1 超聲心動圖測心功能(%，±s)

表1 超聲心動圖測心功能(%，±s)

注:A1組與其他組☆P＜0.01，A1與其他組△P ＞0.05，LPS與其他組*P ＜0.001。

組別EF FS A1 組 69.89 ±3.17* 48.28 ±1.87*A2組 70.19±3.95 △＊ 48.99±1.74 △＊B1組 65.15±3.00 ☆＊ 44.65±1.66 ☆＊B2組 66.89±3.33 ☆＊ 45.88±1.70 ☆＊LPS組 59.49±3.38 ☆ 39.12±1.44 ☆X 組 80.45±4.33 ☆＊ 51.85±2.48☆＊

2.2 不同組別血清標志物的比較 與LPS組及ESM組與 X組大鼠在兒茶酚胺、TN-I、NT-proBNP濃度均有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。說明經過LPS的處理，大鼠兒茶酚胺濃度明顯增加并出現(xiàn)了心肌損傷、心衰的現(xiàn)象。LPS組與ESM組在兒茶酚胺濃度上無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。A組較B組在TN-I和 NT-proBNP濃度方面均有降低 (P＜0.001)，同時也發(fā)現(xiàn)在A2組較A1組兩項指標有進一步降低的現(xiàn)象，這提示在本試驗中高劑量的ESM可能對于減輕心臟損傷帶來更好的作用。見表2。

表2 不同組別血清標志物濃度(μg·L-1，±s)

表2 不同組別血清標志物濃度(μg·L-1，±s)

注:A1組與其他組☆P＜0.01，A1與其他組△P＞0.05，LPS與其他組*P ＜0.001，LPS與其他組◇P ＞0.05。

組別CA TN-I NT-proBNP A1 組 8.06±0.43 ◇ 3.87±0.07* 182.36 ±24.97*A2組 8.28±0.30 △◇ 3.58±0.14 ☆＊ 117.17±14.28 ☆＊B1組 8.21±0.29 △◇ 4.59±0.19 ☆＊ 480.96±43.60 ☆＊B2組 8.35±0.30 △◇ 4.29±0.10 ☆＊ 362.15±18.34 ☆＊LPS組 8.07±0.38 △ 5.02±0.26 ☆ 935.78±28.23 ☆X 組 3.91±0.35 ☆＊ 0.76±0.33 ☆＊ 92.79±7.40☆＊

2.3 不同組別心臟β受體亞型的比較

2.3.1 β1受體含量 B組、LPS及X組β1均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，而A組β1高于B組，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，說明艾司洛爾使β1受體表達上調達到具有統(tǒng)計學意義需要6 h以上。同時也發(fā)現(xiàn)更高劑量的艾司洛爾可以帶來更明顯的β1受體上調。見表3。

2.3.2 β2受體含量 各組之間均沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。這也符合艾司洛爾是高選擇性β1受體阻滯劑的藥理特性。見表3。

2.3.3 β3受體含量 LPS組較X組β3有明顯增加(P＜0.01)，ESM四亞組組間β3沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但ESM四亞組較LPS組β3均有減少，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。見表3。

表3 心臟β受體亞型含量 (ng·g-1＊＊，±s)

表3 心臟β受體亞型含量 (ng·g-1＊＊，±s)

注:＊＊每1 mg全心肌蛋白提取物中β受體的含量;A1組與其他組☆P ＜0.01，A1組與其他組△P ＞0.05，LPS與其他組*P ＜0.01，LPS與其他組◇P ＞0.05。

組別 β1 β2 β3 A1組 1.77±0.11* 0.80 ±0.03 ◇ 0.62±0.07*A2組 1.88±0.11 ☆＊ 0.89±0.10 △◇ 0.64±0.07 △＊B1組 1.51±0.06 ☆◇ 0.84±0.14 △◇ 0.64±0.08 △＊B2組 1.48±0.06 ☆◇ 0.83±0.10 △◇ 0.58±0.06 △＊LPS組 1.47±0.03 ☆ 0.88±0.15 △ 0.74±0.11 ☆X 組 1.45±0.05 ☆◇ 0.82±0.05 △◇ 0.46±0.04☆＊

2.4 大鼠心肌免疫組化 β受體為細胞膜受體，β1的表達在A1組表達最為強烈，X組與LPS組沒有明顯差別。β2的表達在各組表達均沒有明顯差別。β3的表達在LPS組表達最為強烈，A1組其次，X組表達明顯減少。從大鼠的免疫組化可以看出，與心肌組織ELSIA法測得β受體亞型的含量結果相一致。見圖4～6。

2.5 大鼠心肌線粒體的超微結構 X組:線粒體呈圓形或卵圓形，基質電子密度正常，脊的數量正常，排列也正常。LPS組:線粒體腫脹，基質內有多個局灶性空泡，基質物質丟失。即刻低劑量ESM組:線粒體基質電子密度降低，脊移向周圍，并變短及數量減少，線粒體體積增大。見圖7～9。

3 討論

近年來，膿毒癥相關性心肌損傷受到越來越多的關注，不單單因為心臟是膿毒癥的主要靶器官，而且心功能的變化與全身各臟器功能的變化緊密聯(lián)系。一旦發(fā)生嚴重的心肌損傷，便導致心排減少，造成全身多臟器的低灌注，進一步引發(fā)多器官功能障礙(MODS)。因此降低膿毒癥相關性心肌損傷關系到膿毒癥治療的成敗。心力衰竭、感染性疾病、多器官損傷、重度中毒患者等危重病時均可以有TN-I低水平升高，往往提示并有心肌損傷。NT-proBNP是心室分泌的生物活性肽的前體，其生理作用是排鈉排水，對于維持血容量的穩(wěn)定有著至關重要的作用，對心衰發(fā)展起著重要的作用。心肌損傷的起始階段，機體己經激活神經內分泌系統(tǒng)，NT-proBNP已經作為容量調節(jié)的重要一環(huán)參與機體的自身調節(jié)。故其可作為心力衰竭早期預警標志物。本研究中發(fā)現(xiàn):X組大鼠與LPS組的TN-I和NT-proBNP濃度均有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。說明經過LPS的處理，大鼠出現(xiàn)了心肌損傷。A組較B組TN-I和 NT-proBNP 濃度降低(P ＜0.001)，同時也發(fā)現(xiàn)A2組較A1組TN-I和NT-proBNP濃度有進一步降低的現(xiàn)象，這提示在本試驗中更高劑量的ESM可能對于減輕心臟損傷帶來更好的作用。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，嚴重的心肌梗死、心力衰竭、創(chuàng)傷，都會出現(xiàn)兒茶酚胺風暴，并對機體造成嚴重損害，而應用β受體阻滯劑可以降低交感神經興奮性，可能帶來更積極的結果。在膿毒癥早期，已有廣泛的交感神經系統(tǒng)被激活［6］，在大多數死亡的感染性休克患者中可以觀察到心肌損傷的病理學改變［7］，但是國內沒有應用β阻滯劑阻斷膿毒癥時的交感神經激活，從而改善膿毒癥心功能相關報道。膿毒癥時心肌細胞暴露于高水平的兒茶酚胺環(huán)境，機體會反射性的發(fā)生β受體的下調［8］，表現(xiàn)為心肌細胞膜上β受體數量相對和絕對的減少，其受體下調的程度與疾病的嚴重程度呈正相關。隨著20世紀對β受體阻滯劑在治療心衰中的地位被顯著提高，使得心衰的治療發(fā)生了革命性改變，其作用機制既可以對抗高兒茶酚胺對心肌的毒性作用外，同時還可以上調β受體密度，抑制炎癥因子的釋放［9］，減少心肌細胞凋亡。Schmittinger 等［10］首次提出應用腎上腺素能受體拮抗劑治療膿毒癥合并心肌抑制者，引起了業(yè)內的極大興趣。

選擇性β1受體阻滯藥艾司洛爾，半衰期只有9 min，在治療劑量時沒有內在擬交感活性，具有很好的安全性。Suzuki等［4］研究發(fā)現(xiàn)，10 mg·kg-1·h-1和20 mg·kg-1·h-1兩種劑量的艾司洛爾對膿毒癥大鼠心臟均有保護作用。本實驗:X組與B1組、B2組及LPS組β1受體均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。而與A1組及A2組β1受體有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。說明艾司洛爾使β1受體表達上調達到具有統(tǒng)計學意義需要6 h以上。同時也發(fā)現(xiàn)更高劑量的艾司洛爾可以帶來更明顯的β1受體上調。由于艾司洛爾是高選擇性β1受體阻滯劑。故對于β2受體，各組均無統(tǒng)計學差異。以往在心力衰竭時發(fā)現(xiàn)，隨著兒茶酚胺濃度升高，β3受體被激活，β3受體表達較β1受體和β2受體明顯，Balligand［11］發(fā)現(xiàn)，在人類的幾種心肌病，β3受體表達是增加的，并引起心肌重塑。本實驗我們也發(fā)現(xiàn):A1組、A2組、B1組、B2組四個亞組間β3受體比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但四組與X組及LPS組β3兩兩之間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。LPS組較X組β3受體有明顯增加，但給予艾司洛爾后，β3受體含量均有下降。β3受體的下調可能是由于β1受體上調帶來的競爭效應。由于在心血管系統(tǒng)中，β3受體可介導心肌負性變力效應及血管平滑肌舒張作用。故β3受體的下調，可能對于減輕心肌損傷帶來有益的作用。另外Ackland等［12］發(fā)現(xiàn)，β阻滯劑的負性頻率作用，使心率減慢，延長了舒張期，改善了氧平衡;β阻滯劑抑制交感神經活性，抑制炎癥因子釋放。改善血流動力學，提高了心功能。

綜上所述，膿毒癥時應用β1受體阻滯劑艾司洛爾，上調β1受體表達，下調β3受體含表達，改變了膿毒癥時心肌β受體亞型的比例，這一點通過心肌的免疫組化也得到證實;減輕了心肌線粒體的損傷，改善心肌的能量代謝，從而增強了心功能［13］。本實驗為動物實驗，其臨床效果有待進一步確定。

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