桑黃總黃酮含量及其體外抗氧化活性研究*

劉 凡，龐道睿，鄒宇曉，廖森泰，肖更生

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610)

桑黃總黃酮含量及其體外抗氧化活性研究*

劉 凡，龐道睿，鄒宇曉，廖森泰**，肖更生

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610)

桑黃；黃酮含量；抗氧化活性

桑黃又名桑臣、桑黃菇、桑耳等，是一種大型珍貴藥用真菌，主要寄生于桑、楊、松、樺等樹(shù)的樹(shù)干上，在我國(guó)東北、華北、西北等地均有分布。桑黃(Phellinussp.)屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的真菌，具體又可以分為火木層孔菌(Igniarius)、鮑氏層孔菌(Baumii)、裂蹄層孔菌(Linteus)、瓦尼木層孔菌(Vaninii)等多個(gè)種[1]。

桑黃的藥用最早記載于《本草綱目》，“利五臟，宣腸胃氣，排毒氣”。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為桑黃味微苦，性寒，歸肝、腎經(jīng)，可治療崩漏帶下，脾虛泄瀉等癥[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑黃具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、降血脂[5]、增強(qiáng)免疫力[6]等功效，是國(guó)際公認(rèn)的最佳抗癌真菌之一[7]。

雖然目前對(duì)桑黃的研究主要集中在發(fā)酵條件優(yōu)化[8，9]、桑黃多糖的制備及其活性研究[10-14]以及人工栽培[15]等方面。但對(duì)桑黃黃酮的研究則多集中在制備工藝優(yōu)化[16-18]，關(guān)于桑黃黃酮的活性研究近年來(lái)也在逐漸興起[19-21]。

本文以不同來(lái)源的桑黃子實(shí)體和桑黃液體發(fā)酵菌絲體為材料，測(cè)定其總黃酮含量，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，分析兩者相關(guān)性，并比較桑黃液體發(fā)酵菌絲體與桑黃子實(shí)體在總黃酮含量和抗氧化活性方面的差異，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用桑黃資源，特別是液體發(fā)酵桑黃資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生桑黃SH-1(Phellinusigniarius)，寄生于松樹(shù)，購(gòu)自吉林；野生桑黃SH-2(Phellinuslinteus)，寄生于桑樹(shù)，購(gòu)自云南；人工代料栽培桑黃SH-3(Phellinusbaumii)，購(gòu)自黑龍江；人工代料栽培桑黃SH-4(Phellinusigniarius)，購(gòu)自安徽；人工椴木栽培桑黃SH-5(Phellinusbaumii)，購(gòu)自安徽。液體發(fā)酵培養(yǎng)桑黃SH-6，自行培養(yǎng)。桑黃菌種(Phellinusigniarius)，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出液30 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.2 g·L-1、酵母膏21 g·L-1、KH2PO41 g·L-1，pH自然。

總抗氧化活性(T-AOC)試劑盒、清除·OH試劑盒、清除O2-·試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。 乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

HH-4電熱數(shù)字顯示恒溫水浴鍋，上海金忠科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；DH300電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海佳勝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；UV-1700紫外分光光度計(jì)，日本島津。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桑黃菌絲體的制備

無(wú)菌條件下，用打孔器打取桑黃活化菌種塊，接入含有100 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶(250 mL)中，于120 r·min-1、25℃搖床培養(yǎng)7 d。將已生長(zhǎng)好的菌絲轉(zhuǎn)接入含有400 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶(1 000 mL)，于120 r·min-1、25℃繼續(xù)搖床培養(yǎng)10 d。將桑黃液體發(fā)酵物抽濾，取菌絲體。

1.3.2 桑黃提取物的制備

各桑黃子實(shí)體及發(fā)酵菌絲體于60℃恒溫干燥，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

稱取各桑黃樣品粉末1 g，加入30 mL甲醇，于40℃恒溫水浴12 h后，超聲(60 Hz，40℃)提取30 min，過(guò)濾，收集濾液。殘?jiān)瓷鲜霾僮髦貜?fù)提取2次。合并濾液，40℃減壓濃縮，定容到25 mL，4℃保存，備用。

1.3.3 總黃酮含量測(cè)定

桑黃提取物總黃酮含量測(cè)定采用 Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法測(cè)定?？傸S酮含量以每克桑黃樣品干物質(zhì)中含有的總黃酮質(zhì)量計(jì)。測(cè)定3次取平均值[22]。

1.3.4 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity，T-AOC)測(cè)定采用Fe3+還原試劑盒，參照試劑盒的測(cè)定方法，測(cè)定3次取其平均值，按以下公式計(jì)算其抗氧化活力(T，U·g-1)，公式為：

T=[(OD1-OD)0.01]30 ×(VV1)×N

式中：OD1表示測(cè)定管OD值；OD表示對(duì)照管OD值；V表示反應(yīng)液總體積(mL)；V1表示取樣量(mL)；N表示樣品稀釋倍數(shù)。

清除羥自由基(·OH)能力(Scavenging Hydroxyl Radical Capacity，SHRC)測(cè)定，采用Fenton反應(yīng)試劑盒，參照試劑盒的測(cè)定方法，測(cè)定3次取其平均值，按以下公式計(jì)算其抗氧化活力(S，U·g-1)，公式為：

S=(OD-OD1)(OD2-OD3)×M×(1V1)×N

式中：OD表示對(duì)照管OD值；OD1表示測(cè)定管OD值；OD2表示標(biāo)準(zhǔn)管OD值；OD3表示空白管OD值；M表示標(biāo)準(zhǔn)管濃度；1表示1 mL；V1表示取樣量(mL)；N表示樣品稀釋倍數(shù)。

S1=(OD-OD1)(OD2-OD3) ×M×1000×N

式中：OD表示對(duì)照管OD值；OD1表示測(cè)定管OD值；OD2表示標(biāo)準(zhǔn)管OD值；OD3表示空白管OD值；M表示標(biāo)準(zhǔn)管濃度；1 000的單位是mL；N表示樣品稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源桑黃的總黃酮含量測(cè)定比較

對(duì)6種不同來(lái)源的桑黃提取物總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

由圖1結(jié)果可知，不同來(lái)源的桑黃總黃酮含量存在明顯差異。3種人工栽培桑黃子實(shí)體的總黃酮含量比較接近，2種野生桑黃子實(shí)體的總黃酮含量存在顯著差異。在所有供試樣品中，桑黃SH-2的總黃酮含量最高，達(dá)到61.33 mg·g-1，而液體發(fā)酵培養(yǎng)的桑黃菌絲體SH-6的總黃酮含量相對(duì)較低，為27.19 mg·g-1。這可能是由于野生桑黃的生長(zhǎng)環(huán)境差異較大，而人工培養(yǎng)桑黃的環(huán)境控制條件相近所造成的。此外，桑黃菌種的差異，以及子實(shí)體和菌絲體的差異，也可能是導(dǎo)致不同樣品桑黃總黃酮含量差異的原因。

2.2 不同來(lái)源的桑黃體外抗氧化活性比較

6種供試桑黃的體外抗氧化活性測(cè)試結(jié)果如圖2～圖4所示。

由圖2～圖4結(jié)果可以看出，不同來(lái)源的桑黃，其體外抗氧化活性存在明顯差異。野生桑黃子實(shí)體的體外抗氧化能力普遍較強(qiáng)，特別是桑黃SH-2表現(xiàn)尤為突出。桑黃SH-2的體外總抗氧化能力(T-AOC)和清除超氧陰離子自由基能力(SSARC)在所有供試樣品中最強(qiáng)，分別達(dá)到589.86 U·g-1和100.44 U·g-1。清除羥自由基能力(SHRC)最強(qiáng)的為桑黃SH-1，達(dá)到 3 060.41 U·g-1，桑黃SH-2次之，為 2 748.64 U·g-1。綜合而言，野生桑黃(SH-1、SH-2)體外抗氧化活性最強(qiáng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)的桑黃菌絲體體外抗氧化活性相對(duì)較弱，人工代料或椴木培養(yǎng)的3種桑黃樣品體外抗氧化活性表現(xiàn)相近，相互間差異不明顯。

2.3 桑黃體外抗氧化活性與其總黃酮含量之間的相關(guān)性分析

采用SPSS 17.0 軟件分別對(duì)桑黃體外總抗氧化能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力與其總黃酮含量之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

注：**表示在0.01水平上(雙側(cè))顯著相關(guān)。

從表1可以看出，桑黃提取物的體外總抗氧化能力、清除羥自由基能力和清除超氧陰離子自由基能力，與其總黃酮含量之間的相關(guān)性都達(dá)到了極顯著水平(p<0.01)，表明黃酮類化合物是桑黃抗氧化活性的重要物質(zhì)基層。相較于抗氧化活性的測(cè)定，總黃酮含量的測(cè)定更為簡(jiǎn)便，由此認(rèn)為，在鑒定桑黃藥材品質(zhì)時(shí)，可通過(guò)檢測(cè)桑黃總黃酮含量來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化作用。

3 結(jié)論

桑黃是目前國(guó)際社會(huì)公認(rèn)抗腫瘤效果最好的珍稀菌類之一。但由于野生桑黃受其特殊生理狀態(tài)和復(fù)雜生長(zhǎng)環(huán)境的制約，在自然界中形成的桑黃子實(shí)體很少，這使得對(duì)桑黃的研究受到了限制，也制約了桑黃產(chǎn)品的進(jìn)一步研制和開(kāi)發(fā)，遠(yuǎn)不能滿足人們的需求。

通過(guò)本試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，野生桑黃在總黃酮含量及體外抗氧化活性方面具有一定優(yōu)勢(shì)，其活性物質(zhì)含量(黃酮)及生理活性(抗氧化)均優(yōu)于人工栽培及液體發(fā)酵桑黃樣品。但野生桑黃資源的稀缺性注定了其研究、應(yīng)用的局限性。而在供試桑黃樣品中，人工栽培桑黃樣品亦含有較豐富的黃酮類化合物，表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化活性，說(shuō)明人工栽培桑黃子實(shí)體具有一定的開(kāi)發(fā)潛力，可以彌補(bǔ)野生桑黃資源不足的缺憾。此外，液體發(fā)酵桑黃菌絲體樣品雖然在總黃酮含量及體外抗氧化活性方面不如野生桑黃及人工栽培桑黃子實(shí)體，但液體深層發(fā)酵培養(yǎng)具有周期短、產(chǎn)量高、成本低等特點(diǎn)[23]，通過(guò)液體發(fā)酵可以快速獲得大量桑黃菌絲體，可為桑黃資源的開(kāi)發(fā)利用提供原料保障。

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The Total Flavone Content and in Vitro Antioxidant Activity ofPhellinussp.

LIU Fan, PANG Dao-rui, ZOU Yu-xiao, LIAO Sen-tai, XIAO Geng-sheng

(Sericulture and Farm Produce Processing Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-Food science and Technology of Guangdong, GuangzhouGuangdong510610)

In order to investigate the material base of antioxidation and develop the medicinal function ofPhellinussp., the total flavone contents and in vitro total antioxidant capacity (T-AOC), scavenging hydroxyl radical capacity (SHRC) and scavenging superoxide anion radical capacity (SSARC) of extracts from six different varieties ofPhellinussp. were determined. Meanwhile, the dose-effect relationship between total flavonoid content and antioxidant activity was analyzed. The result indicated that there were significant differences among the total flavonoid contents of different varieties ofPhellinussp.. Each extract had good in vitro antioxidant activity, and the sample SH-2 was best. The correlation between total flavonoid content and T-AOC, SHRC, SSARC ofPhellinussp. reached extremely significant level (p<0.01).

Phellinus; Flavone content; Antioxidant activity

*項(xiàng)目來(lái)源：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金“桑資源加工利用崗位”(CARS-22-ZJ0502)；廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目“藥用真菌桑黃抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物的研究”，編號(hào)：粵科基字[2010]3號(hào)；廣東省農(nóng)科院院長(zhǎng)基金“藥用真菌桑黃的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)及其次級(jí)代謝產(chǎn)物研究”，編號(hào)：201006。

劉凡(1983-)，男，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。E-mail: liufan1234@126.com

**通信作者： 廖森泰，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工、蠶桑資源綜合利用研究。E-mail: liaost@163.com

2014-01-18

S646.9

A

1003-8310(2014)02-0047-04