毒蕈鑒別及毒素檢測研究進(jìn)展*

張黎光，李峻志，祁 鵬，李安利，戴 璐，吳小杰

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

蕈類又稱蘑菇，夏秋季節(jié)我國廣大地區(qū)氣溫較高，雨量充沛，為蘑菇等大型真菌的繁衍提供了極有利的條件。野生蕈菌是大自然賜給人類的美味佳肴，營養(yǎng)豐富、味道鮮美，對(duì)提高人體免疫力很有幫助，自古以來就被人們視為食用佳品。但有些野生蕈菌被人們食用后造成中毒，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡，人們稱這類野生蕈菌為有毒野生蘑菇，即毒蘑菇 (也稱毒蕈)。

毒蕈的外觀與可食野生蕈菌極其相似，在野外雜生情況極難分辯，易造成人們誤食中毒。近年來，我國毒蘑菇中毒的發(fā)生率呈上升趨勢。據(jù)報(bào)道，因誤食有毒野生蘑菇引起的中毒死亡事件已居各種中毒致死事件的第2位，而且仍不斷在發(fā)生。毒蕈的毒性有強(qiáng)有弱，有的毒蕈毒性雖小，但進(jìn)食過多仍可發(fā)生嚴(yán)重中毒;有的毒蕈毒性非常強(qiáng)，誤食中毒后，一旦出現(xiàn)臨床癥狀已屬晚期，目前尚無特效治療措施，搶救治療成功率較低，死亡率高。所以毒蕈的鑒別及毒素的檢測對(duì)于預(yù)防毒蕈中毒十分重要。

對(duì)于毒蕈的識(shí)別，勞動(dòng)人民在長期采集和利用大型真菌的過程中已經(jīng)總結(jié)積累了許多經(jīng)驗(yàn)和方法。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，特別是真菌學(xué)發(fā)展起來以后，相關(guān)科技工作者在前人經(jīng)驗(yàn)和研究成果的基礎(chǔ)上，對(duì)毒蘑菇的分類、鑒別以及毒素的檢測進(jìn)行了一系列研究和探索，取得了較大的成果。本文對(duì)人類識(shí)別毒蕈的經(jīng)驗(yàn)、方法或成果進(jìn)行調(diào)查歸納，進(jìn)而進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，這對(duì)更有效地識(shí)別毒蕈及預(yù)防中毒，進(jìn)而大規(guī)模地開發(fā)利用大型野生真菌資源具有一定的實(shí)際參考價(jià)值和理論指導(dǎo)意義［1］。

1 毒蕈的鑒別

1.1 民間經(jīng)驗(yàn)識(shí)別

從生境和形態(tài)上區(qū)分，可食用的無毒蘑菇多生長在清潔的草地、松樹或櫟樹上，毒蕈則往往生長在陰暗、潮濕的骯臟地帶且菌蓋表面顏色鮮艷，有紅、綠、墨黑、青紫等顏色，特別是紫色的蘑菇往往有劇毒，采摘后易變色。毒蕈的菌蓋中央呈凸?fàn)?，形狀怪異，菌蓋表面厚實(shí)板硬，菌環(huán)菌柄上有菌輪，菌柄多細(xì)長或粗長，易折斷，毒蕈往往生有菌托。此外，毒蕈往往有怪異味，如辛辣、酸澀、惡腥等。關(guān)于毒蕈的鑒別從古至今有著各種各樣的探索，民間鑒別的土辦法就不少于幾十種，但目前還沒有1種簡單、通用而有效的方法鑒別毒蕈。毒蕈的鑒別主要仍是依靠形態(tài)特征和生態(tài)習(xí)性。

1.2 真菌分類學(xué)鑒定

對(duì)生物資源的認(rèn)識(shí)關(guān)鍵在于對(duì)物種的確定，因此，分類學(xué)鑒定法是識(shí)別毒蕈最科學(xué)、最基本的方法。利用子實(shí)體等菌絲組織體的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，如菌蓋的形狀、大小、顏色、質(zhì)地、菌肉、菌褶、菌蓋附著物、菌蓋邊緣的特征;菌柄的有無、形狀、長度、表面、內(nèi)部以及菌環(huán)、菌托、還有孢子印、孢子、生境等特征對(duì)標(biāo)本進(jìn)行科學(xué)地鑒定，當(dāng)標(biāo)本的學(xué)名確定后，進(jìn)而通過有關(guān)資料來確定其毒性特性［2］。分類方面的專著主要有《毒蘑菇》、《毒蘑菇識(shí)別》、《中國真菌志》、《中國大型真菌》、《中國大型真菌原色圖鑒》、《中國大型真菌的多樣性》等，國外專著有《原色日本菌類圖鑒》等。真菌分類學(xué)鑒定法主要作用在于確定物種，僅適于專業(yè)人員采用，對(duì)毒蕈的識(shí)別并不是直接的。

1.3 植物檢驗(yàn)法、動(dòng)物檢驗(yàn)法

張志光等［3］根據(jù)鵝膏毒肽抑制RNA聚合酶的活性，影響細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的原理，建立了1種以植物種子萌發(fā)試驗(yàn)的抑制率來鑒定、檢測野生菌中是否含鵝膏毒肽的方法，稱之為“抑芽法”;這種方法比較簡易、快速而有效，可由于受實(shí)驗(yàn)條件限制，以及在沒有標(biāo)樣的情況下，初步鑒定鵝膏菌子實(shí)體的毒素毒性與含量范圍，對(duì)野外采集的標(biāo)本進(jìn)行毒性大小的比較和制備純化毒素的活性檢測。此外，借助于動(dòng)物毒性試驗(yàn)，判斷野生菌有無毒性，具有一定的實(shí)際價(jià)值。陳士瑜等［4］在上世紀(jì)80年代中期曾記載過利用尾草履蟲鑒別毒蘑菇毒性的試驗(yàn)，采用此法確定了不少毒蘑菇，為毒蘑菇識(shí)別奠定了一定基礎(chǔ);草履蟲對(duì)毒蘑菇的中毒反應(yīng)與人是否一致，這一結(jié)論尚待進(jìn)一步驗(yàn)證，可以推測，能使尾草履蟲中毒的蘑菇不一定也使人中毒。也有報(bào)道采用活魚試驗(yàn)是否反應(yīng)敏感，具體是用一定量的新鮮蘑菇，破碎后放入養(yǎng)魚水池中，半小時(shí)后觀察魚的存活狀態(tài)［5］。鄭穎等采用小鼠腹腔注射法可快速有效檢測蘑菇是否有毒，及初步判斷主要致死毒素是什么類型［6］。張志光等［7］同時(shí)采用3種方法檢測灰花紋鵝膏菌對(duì)小白鼠的毒性，不僅檢測出了該蘑菇具有毒性，而且通過結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)該毒蘑菇既含毒肽又含毒傘肽。目前，常用于檢測蘑菇毒性的供試恒溫動(dòng)物除了大白鼠、小白鼠外，還有猴、狗、貓等雜食或嚙齒類動(dòng)物，據(jù)資料記載，針對(duì)每種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物又有自由進(jìn)食、灌胃、肌肉注射3種方法［4－8］。根據(jù)試驗(yàn)后動(dòng)物的癥狀甚至死亡情況即可判斷待測蘑菇是否有毒，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，凡能引起某種嚙齒動(dòng)物或雜食動(dòng)物中毒的野生菌，大多數(shù)對(duì)人體是有毒的。恒溫動(dòng)物試驗(yàn)法不僅能較為準(zhǔn)確的鑒定蘑菇的毒性，同時(shí)還能為毒素的分析提供有力的依據(jù)。此方法雖然簡單但費(fèi)時(shí)，而且還受材料及其用量的限制以及不同動(dòng)物對(duì)供測蘑菇敏感性的影響［9］，因此需要專門的機(jī)構(gòu)或設(shè)施方能推廣應(yīng)用。

2 毒蕈毒素檢測

2.1 化學(xué)顯色檢測法

毒蕈中的毒素和某些特定化學(xué)試劑有時(shí)會(huì)發(fā)生變色反應(yīng)，根據(jù)這一原理，可檢驗(yàn)?zāi)骋活惡囟ǘ舅氐亩巨?。這種方法準(zhǔn)確性較高，簡單易操作，但1種方法只能檢驗(yàn)1種毒素或1種毒蕈。對(duì)于毒蕈中的其它毒素或其它種毒蕈則不能鑒別。因此不能作為鑒別的主要方法，只能作為輔助手段。以下簡單介紹幾種毒蕈中有毒成分分離與檢測［10－19］。

毒肽和毒傘肽:含有鵝膏肽類毒素的蘑菇主要有鵝膏屬Amanita、盔孢傘屬Galerina和環(huán)柄菇屬Lepiota中的一些種類，在鵝膏菌屬中，主要有毒鵝膏菌 (Amanita phalloides)、白毒鵝膏菌 (A.verna)、鱗柄白毒鵝膏菌 (A.virosa)、雙孢鵝 膏 菌 (A.bisporigera)、 赭 鵝 膏 菌 (A.ocreata)、A.suballiacea、A.tenuifolia、A.bygroscopia 等;在盔孢傘屬中，主要有秋盔孢傘 (Galerinaautumnalis)、毒盔孢傘(G.venenata)、單色盔孢傘 (G.unicolor)、G.marginata、G.beinthii等;在環(huán)柄菇屬中，主要有褐鱗環(huán)柄菇 (Lepiota helveola)、栗色環(huán)柄菇 (L.castanea)、肉褐鱗環(huán)柄菇(L.brunneoincarnata)、L.josserandi、L.heteri、L.scobinella 等。目前，國內(nèi)外主要采用V.E Tyler方法進(jìn)行毒肽類檢測，采用甲醇提取分離后，用硅膠 G作吸附劑，用氯仿和無水乙醇(19∶1，v·v－1)展開，用桂皮醛作顯色劑，前者為藍(lán)色斑點(diǎn)，后者為紫色斑點(diǎn)。此外，Meixnes介紹了1種簡易檢測毒傘肽的方法，其原理是以毒傘肽同復(fù)雜的生物聚合物即木質(zhì)素酸化反應(yīng)為基礎(chǔ)，形成1種藍(lán)色的產(chǎn)物。具體試驗(yàn)是將新鮮毒蕈搗爛后汁液滴在1張白報(bào)紙上，待干后，再滴濃鹽酸，陽性為藍(lán)色斑點(diǎn)，而毒肽與木質(zhì)素不產(chǎn)生此反應(yīng)，因此無藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn)。本法適合中毒現(xiàn)場檢測。

生物堿類:據(jù)報(bào)道野生毒蕈中普遍存在生物堿，其檢出率高達(dá)90%。目前國內(nèi)主要采用雷氏鹽或 Stas－otto's方法進(jìn)行分離，采用紙層析和薄層析進(jìn)行定性。薄層一般用硅膠G板，用氯仿、環(huán)已烷和甲醇 (75∶15∶10，v·v－1)展開，噴Drugendorff顯示劑，陽性為桔紅色斑點(diǎn)。據(jù)Broum報(bào)告，膽堿、乙酰膽堿和毒蕈堿的 RF值分別為0.09、0.22和0.28，由于在堿性條件下乙酰膽堿水解，故不干擾毒蕈堿檢測。有條件的話，將生物堿提取分離后，經(jīng)純化、重結(jié)晶后作生物堿的沉淀和顯色反應(yīng)、熔點(diǎn)或光譜分析，測定其分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)和元素組成，進(jìn)而確定為何種生物堿。

蟾蜍素:鵝膏菌屬中的毒蠅鵝膏菌 (Amanita muscaria)、褐 云 斑 鵝 膏 菌 (A.porphyria)、 豹 斑 毒 鵝 膏 菌(A.pantherina)、橙黃鵝膏菌 (A.citrina)以及橘黃裸傘(Gymnopilus sepctabilis)等毒蕈含有蟾蜍素。該毒素采用甲醇提取分離后，用硅膠G作吸附劑，用醋酸乙酯、異丙醇和25%氨水 (45∶35∶20，v·v－1)展開，用 2，4—二硝基苯肼或?qū)Χ装被饺╋@色，分別顯紫紅色或藍(lán)色為陽性反應(yīng)。

5－羥色胺及5－羥色氨酸:在緊縮斑褶菌 (Panaeolus sphinctrinus)中發(fā)現(xiàn)此類毒素。檢材采用甲醇提取分離后，用硅膠G作吸附劑，用氯仿和5%甲醇 (濃氨水飽和)展開，用對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色，顯2個(gè)紫色斑點(diǎn)為陽性。

光蓋傘素及光蓋傘辛:存在于墨西哥裸蓋傘 (Psilocybe mexicana)、古巴裸蓋傘 (P.cubensis)、日本裸蓋傘、網(wǎng)紋斑褶菇 (Panaeolus retirugis)、鐘形斑褶菇 (P.campanulatus)等毒蕈中。該毒素采用甲醇提取分離，常用的有3種不同類型的層析板，即硅膠板、纖維素板和氧化鋁板。先點(diǎn)上標(biāo)樣，再點(diǎn)上蘑菇提取液，用丁醇、乙酸和水 (12∶3∶5，v·v－1)作分離相，干燥后置紫外燈下初步觀察。為了顯色清楚還要配制臨時(shí)試劑，硅膠板用Ehrlich’s試劑 (10%的對(duì)二甲胺苯醛溶于濃鹽酸中與丙酮按1∶4配成溶液)，纖維素板和氧化鋁板用20%純無水對(duì)甲苯磺酸溶于甲醇溶液。用紙巾包裹層析板，淋上不同試劑，放置通宵后第2天觀察，結(jié)果光蓋傘素呈紅褐色至紫褐色，光蓋傘辛呈紫黑色，它們各有不同的RF值。此法簡單易行，可快速定性檢測蘑菇子實(shí)體是否含有裸蓋菇素類毒素［20］。

奧來毒素:含此毒素的毒蕈主要是絲膜菌屬Cortinarius的一些種類。其中細(xì)鱗絲膜菌 (Cortinarius speciosissimus)和C.splendens在我國有分布。1983年Schumacher和Hoiland提出1種快速定性檢測蘑菇子實(shí)體中是否含有奧來毒素的方法，即取新鮮或干的蘑菇放在5倍體積的水里研磨，室溫下靜置10 min后過濾，然后在濾液中加入等體積的3%的FeCl3·6H2O(溶解在0.5 moL HCl中)，如出現(xiàn)藍(lán)黑色即表明該蘑菇中含有奧來毒素［21］。這一方法可用于出現(xiàn)中毒后，直接檢測吃剩的蘑菇或嘔吐物確認(rèn)是否誤食含奧來毒素蘑菇，以便迅速確定有效可行的治療方法。也適用于野外采集時(shí)的初步鑒定。

此外還有報(bào)道，用氫氧化鉀可識(shí)別鱗柄白毒鵝膏菌 (變金黃色)，用硫酸可識(shí)別出毒鵝膏菌 (變青紫色)和豹斑毒鵝膏菌 (變橙黃色)［1］。

2.2 高效液相色譜法

據(jù)部分地區(qū)不完全統(tǒng)計(jì)，誤食野生蕈菌的中毒事件中，95%以上都是由鵝膏菌所致［22］。高效液相色譜 (HPLC)的發(fā)展與應(yīng)用，使鵝膏菌毒素研究與開發(fā)進(jìn)入了一個(gè)新的階段，現(xiàn)在商品化的鵝膏菌毒素都是由HPLC法分離純化的。首先應(yīng)用HPLC進(jìn)行毒素研究的是Beutler和Der marderosian，之后Pastorello等、En Jalbert F.等、Hampl J等都相繼研究了鵝膏菌毒素檢測分離技術(shù)，該法分離生物樣品具有速度快、靈敏度高、分辨率好、用量少等優(yōu)點(diǎn)。我國學(xué)者張秀堯等［23］在此基礎(chǔ)上建立了同時(shí)快速檢測尿液和血漿中3種鵝膏毒肽、2種鬼筆毒肽的超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。柳潔等［24］采用超高效液相色譜－電噴霧離子化－四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) (UPLC－ESI－Q－TOF)，建立了野生菌樣品中α－鵝膏毒肽、β－鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽4種毒素特征信息的高分辨質(zhì)譜指紋圖譜和分析鑒定方法;該方法快速、準(zhǔn)確、選擇性好、特異性強(qiáng)，為毒素的定性確證提供了1種可靠方法，同時(shí)也滿足對(duì)樣品中毒素含量的定量測定要求，適用于突發(fā)毒蕈中毒事件的毒素確證分析。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，誤食毒蕈中毒給人類帶來極大的危害。關(guān)于毒蕈識(shí)別與鑒定，民間簡易識(shí)別方法可用來區(qū)別某種毒蕈，但不能作為鑒別毒蕈通用方法;毒素化學(xué)檢測方法有些較繁瑣，加之不少的毒素不穩(wěn)定，故不能完全作為可食蘑菇與毒蕈鑒別的方法。因此認(rèn)為，在目前比較科學(xué)和切實(shí)可行的方法應(yīng)是從分類學(xué)上認(rèn)識(shí)毒蕈的種類，通過形態(tài)特征和生態(tài)習(xí)性等生物學(xué)性狀觀察，尤其是擔(dān)孢子形狀、顏色、大小、花紋等，輔以生物學(xué)方法，并結(jié)合相關(guān)毒性試驗(yàn)和化學(xué)檢驗(yàn)加以鑒別。各級(jí)相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)有關(guān)毒蕈知識(shí)的宣傳，提高人們對(duì)毒菌中毒危害性的認(rèn)識(shí)，在采摘野生蕈菌食用時(shí)要慎之又慎，盡可能避免誤食中毒事件的發(fā)生。

毒性物質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)各類生物樣品中毒肽的檢測還受時(shí)間限制。為了預(yù)防毒蕈中毒，毒蕈毒素的快速鑒別檢測技術(shù)理應(yīng)成為以后重要的研究方向。目前針對(duì)神經(jīng)致幻毒蕈已有人進(jìn)行了這方面的應(yīng)用嘗試，即改良比色法檢測色胺類物質(zhì)及定性檢測試紙的研制［25，26］。新型、靈敏、快速的分析方法如高效液相色譜、核磁共振、質(zhì)譜、紫外－紅外檢測等現(xiàn)代檢測手段為研究毒蕈不同組織和不同生化樣品中毒素種類及含量提供了可能。病人的血漿、尿液、膽汁等都可以作為檢測對(duì)象，這對(duì)臨床治療及毒素的基礎(chǔ)研究具有現(xiàn)實(shí)意義。隨著技術(shù)的發(fā)展，到目前為止，可以同時(shí)分離鑒定多種毒素，并適時(shí)監(jiān)控，被檢測樣品范圍及檢測靈敏度也提高了很多。對(duì)分離到的毒性物質(zhì)還可以借助質(zhì)譜等技術(shù)加以結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)一步對(duì)其毒性做出分子水平的解釋。然而該領(lǐng)域目前仍屬于基礎(chǔ)性研究，開發(fā)利用毒蕈涉及較廣泛的學(xué)科領(lǐng)域，由于條件所限，開展的研究也比較膚淺，有待于進(jìn)一步深入研究，尤其是針對(duì)毒性機(jī)理和藥理活性的研究等方面還需做大量工作。

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