利用往返電泳法(R-PAGE)檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒技術(shù)要點(diǎn)

邱彩玲

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030)

利用往返電泳法(R-PAGE)檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒技術(shù)要點(diǎn)

邱彩玲1,2*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030)

目前國(guó)內(nèi)普遍采用的往返電泳法是檢測(cè)馬鈴薯類病毒的主要方法之一，但該方法存在靈敏度低，重復(fù)性差等問(wèn)題。因此，針對(duì)上述問(wèn)題總結(jié)出一些技術(shù)要點(diǎn)：（1）保證植物生長(zhǎng)環(huán)境及正確取樣；（2）提高凝膠中RNA的濃度和質(zhì)量；（3）控制好反向電泳的溫度和時(shí)間；（4）及時(shí)更換染色液。

往返電泳；馬鈴薯類病毒；技術(shù)要點(diǎn)

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的類病毒，其病原是一種比一般病毒小得多的低分子量物質(zhì)[1,2]，具有高度的侵染性，極易通過(guò)接觸、農(nóng)具、衣物和切刀等進(jìn)行汁液傳播，也可通過(guò)花粉和子房傳到種子中。據(jù)報(bào)道，PSTVd還可以通過(guò)某些昆蟲(chóng)傳播，如:綠盲蝽蟓、蚱蜢和馬鈴薯甲蟲(chóng)等，傳播途徑十分廣泛。PSTVd強(qiáng)系可引起減產(chǎn)60%，弱系減產(chǎn)20%～35%，造成較大經(jīng)濟(jì)損失[3]。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒是威脅中國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)的重要病害，該病害在中國(guó)從南到北均有發(fā)生，并呈逐年上升趨勢(shì)，在北部的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重危害馬鈴薯生產(chǎn)和實(shí)生種子的品質(zhì)，是種薯生產(chǎn)和實(shí)生種子利用中亟待解決的問(wèn)題[4]。

往返電泳（R-PAGE）技術(shù)的原理及方法是：類病毒分子在自然和變性條件下電泳遷移率存在明顯不同，變性所引起類病毒核酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其電泳遷移率明顯慢于相同分子量的其它線性RNA分子，第一次電泳在非變性條件下，類病毒RNA的棒狀核酸同寄主核酸分離出來(lái),第二次電泳是在變性條件下變換電極，此時(shí)，類病毒核酸由棒狀變成單鏈環(huán)狀，比同樣大小的核酸遷移慢，因此，類病毒RNA會(huì)產(chǎn)生一條明顯的帶，據(jù)此，結(jié)合可靠靈敏的銀染色技術(shù)測(cè)定類病毒。R-PAGE的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，要求的實(shí)驗(yàn)條件比較簡(jiǎn)單，一般的實(shí)驗(yàn)室都能滿足，可以普遍采用。然而，R-PAGE方法的靈敏度不及NASH和RT-PCR法，并且重復(fù)性不好，因此，筆者通過(guò)一系列的方法對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，以期提高R-PAGE的靈敏度和重復(fù)性，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

1 保證植物生長(zhǎng)環(huán)境及正確取樣

由于馬鈴薯類病毒受溫度和光照的影響，因此，試管苗和溫室中種植的植株的生長(zhǎng)環(huán)境應(yīng)不低于18℃（最好高于20℃），并至少每天16 h光照，試管苗應(yīng)在培養(yǎng)4～6周后，莖高達(dá)到5 cm后取樣，整株取樣。作為陰性對(duì)照的試管苗應(yīng)在溫室種植一段時(shí)間后，使之生長(zhǎng)充分，于開(kāi)花前取樣，應(yīng)取頂部充分展開(kāi)的葉片[5]。

2 提高凝膠中RNA的濃度和質(zhì)量

2.1 確保RNA提取質(zhì)量

在日常工作中總結(jié)出以下幾點(diǎn)：（1）在RNA提取過(guò)程中，加入液氮可以迅速使細(xì)胞裂解，充分釋放出RNA，從而提高RNA提取效率；（2）操作盡可能在冰上進(jìn)行，速度要快，盡量減少RNA提取的時(shí)間；（3）對(duì)試驗(yàn)中涉及的器皿、耗材等進(jìn)行處理，避免RNA酶降解。雖然PSTVd的結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，與一般的RNA相比不易降解，但嚴(yán)格的操作對(duì)于確保試驗(yàn)成功仍然是必不可少的重要環(huán)節(jié)。

2.2 提高RNA濃度

不言而喻，回溶溶液的多少直接影響著樣品中RNA的濃度，因此，在許可的范圍內(nèi)減少回溶溶液可以提高RNA濃度，提高檢測(cè)效率。另外，使用大量樣品提取RNA也可以取得很好的效果。

2.3 增加上樣量

凝膠中RNA的總量越多，就越容易檢測(cè)到含量較低的馬鈴薯類病毒，提高檢測(cè)的效果。因此，在適當(dāng)范圍內(nèi)，應(yīng)盡可能多的加入待檢RNA樣品，以提高檢測(cè)的效率。

3 控制好反向電泳的溫度和時(shí)間

由于類病毒在自然條件下呈棒狀高度配對(duì)的狀態(tài)，而在高溫（70～80℃）條件下變性，由棒狀變成環(huán)狀，致使在丙烯酰胺中的遷移率減慢，從而通過(guò)兩次電泳將類病毒的核酸帶與寄主中的其他核酸分離出來(lái)。因此，必須嚴(yán)格控制反向電泳的溫度，避免類病毒復(fù)性或變性不充分，使反向電泳的類病毒遷移率增加，與寄主核酸區(qū)分不明顯，影響檢測(cè)效率；然而，溫度也不能過(guò)高，否則高溫對(duì)凝膠有損害，使凝膠變形，影響馬鈴薯類病毒的檢測(cè)。

4 及時(shí)更換染色液

為了AgNO3染色液可以重復(fù)利用，降低成本、減少工作量，一般都重復(fù)使用，但不宜使用的次數(shù)過(guò)多，否則隨著AgNO3濃度的降低，染色效果會(huì)下降，甚至可以出現(xiàn)假陰性，因此，當(dāng)AgNO3溶液中出現(xiàn)較多的沉淀時(shí)，應(yīng)適時(shí)更換染色液，以確保染色效果，使陽(yáng)性樣品清晰的顯示出來(lái)。

由于馬鈴薯類病毒可以通過(guò)接觸、昆蟲(chóng)、種子等多種途徑傳播，因此，該病害必須要嚴(yán)格控制，嚴(yán)把種薯關(guān)。另外，由于目前沒(méi)有有效的方法脫除，且不能通過(guò)藥劑防治，因此，預(yù)防馬鈴薯類病毒是馬鈴薯生產(chǎn)中亟待解決的大問(wèn)題，而目前解決的辦法只有嚴(yán)格檢測(cè)才能從根本上控制該病害。所以，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒病的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于中國(guó)脫毒種薯生產(chǎn)、馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都至關(guān)重要。

[1]田波,張秀華,夏遠(yuǎn)南.我國(guó)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的初步研究[J].病毒學(xué)集刊,1982,1(1):119-122.

[2]Diener T O.Potato spindle tuber'virus':a replicating low molecular weight RNA[J].Virology,1971,45(1):411-428.

[3]程天慶.馬鈴薯栽培技術(shù)[M].2版.北京:金盾出版社,1996: 123.

[4]白艷菊,李學(xué)湛,呂典秋,等.用NASH方法檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].雜糧作物,2001,21(3):42-43.

[5]PM 7/33(1).Diagnostic protocols for regulated pests,potato spindle tuber pospiviroid[S].Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 34, 257-269.

Technical Points of Return-polyacrylamide Gel Electrophoresis(R-PAGE)on Detection of Potato Spindle Tuber Viroid(PSTVd)

QIU Cailing1,2＊
(1.Virus-free Seedling Research Institute,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin,Heilongjiang 150086,China;
2.College of Agronomy,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

At present,return-polyacrylamide gel electrophoresis(R-PAGE)is a commonly used method for potato spindle tuber viroid(PSTVd)detection in China.But,there are some drawbacks in this technique,such as low sensitivity and poor repeatability.In response to the problems mentioned above,some technical points were pointed out based on the author's experience for PSTVd detection:(1)optimization of plant growth environments and proper sampling;(2)increasing the concentration and quality of RNA in the gel;(3)the control of temperature and time in reverse electrophoresis;and(4) replacingthestainingsolutiontimely.

return-polyacrylamide gel electrophoresis(R-PAGE);potato spindle tuber viroid(PSTVd);technical point

S532

B

1672－3635（2014）04-0233-02

2014-06-14

哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（2013AE6AW059）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（CARS-10-P14）。

邱彩玲（1976-），女，博士研究生，主要從事馬鈴薯病害檢測(cè)技術(shù)研究。

邱彩玲，E-mail:279145673@qq.com。