利用晚疫病菌無毒基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)鑒定馬鈴薯抗病基因

周晶，張子瑩，路遠(yuǎn)，田振東，謝從華

（園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家蔬菜改良中心華中分中心，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢430070)

病蟲防治

利用晚疫病菌無毒基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)鑒定馬鈴薯抗病基因

周晶，張子瑩，路遠(yuǎn)，田振東*，謝從華

（園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家蔬菜改良中心華中分中心，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢430070)

由Phytophthora infestans引起的晚疫病是馬鈴薯的毀滅性病害。明確現(xiàn)有馬鈴薯品種或育種材料含有的晚疫病抗病基因，對(duì)于抗病育種和合理利用不同抗病基因防治馬鈴薯晚疫病具有重要意義。根據(jù)“基因?qū)颉睂W(xué)說，馬鈴薯無毒基因與抗病基因產(chǎn)物互作會(huì)產(chǎn)生典型過敏反應(yīng)（HR）。理論上利用病原菌無毒基因可以鑒定馬鈴薯是否含有相應(yīng)抗病基因。本研究嘗試?yán)棉r(nóng)桿菌注射技術(shù)，在馬鈴薯葉片中瞬時(shí)表達(dá)晚疫病菌無毒基因（Avr），根據(jù)過敏反應(yīng)發(fā)生情況，進(jìn)而推斷馬鈴薯品種/育種材料所含相應(yīng)抗病基因（R）。研究結(jié)果顯示：適合馬鈴薯瞬時(shí)表達(dá)的農(nóng)桿菌濃度為0.5（OD600），馬鈴薯材料農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)存在明顯的基因型和葉齡依賴性，充分展開的幼嫩葉片適合農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)。Avr1,Avr2,Avr3a和Avr4在含有相應(yīng)抗病基因的馬鈴薯鑒別寄主上瞬時(shí)表達(dá)能夠產(chǎn)生HR，表明無毒基因注射鑒定結(jié)果是可靠的。無毒基因注射鑒定結(jié)果與抗病基因特異引物PCR擴(kuò)增結(jié)果在不同基因型材料上有時(shí)并不一致，反映了這兩種方法各有局限性，若能將這兩種方法結(jié)合使用，則會(huì)提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

馬鈴薯；晚疫病；無毒基因；抗病基因；瞬時(shí)表達(dá)；農(nóng)桿菌注射

馬鈴薯是世界第四大糧食作物，僅次于水稻、玉米和小麥[1]。馬鈴薯在生產(chǎn)過程中受到多種病原菌的危害，其中由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是最嚴(yán)重的病害之一。選育抗晚疫病品種是防治晚疫病最經(jīng)濟(jì)、最環(huán)保的方法。當(dāng)前馬鈴薯抗晚疫病育種利用的抗病基因主要是來自野生種Solanum demissum的R1-R11 11個(gè)主效R基因[2]。這11個(gè)主效R基因已被定位，其中R1、R3a和R3b基因已被克隆[3-5]；R1、R2、R3、R4和R10基因已經(jīng)被廣泛的用于馬鈴薯育種[6]。另外來自于不同馬鈴薯野生種的10多個(gè)不同R基因也已被克隆[6,7]，這些抗病基因的克隆為馬鈴薯抗晚疫病育種提供了重要基因資源。由于晚疫病病菌變異迅速，導(dǎo)致馬鈴薯抗病基因很快失去抗性[8]。因此，在不同產(chǎn)區(qū)根據(jù)晚疫病生理小種組成來選擇合適的抗病品種就顯得尤為重要。目前國內(nèi)研究者已開展了馬鈴薯產(chǎn)區(qū)晚疫病菌生理小種變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，基本明確了病原菌群體結(jié)構(gòu)，為晚疫病防治奠定了基礎(chǔ)[9-11]。中國已育成馬鈴薯品種近300個(gè)，但是這些品種含有那些抗病基因并不清楚，這對(duì)合理布局含有不同抗性基因的品種防治晚疫病造成很大困難。

根據(jù)“基因?qū)颉奔僬f[12]，抗病基因產(chǎn)物和病原菌無毒基因（Avr）產(chǎn)物識(shí)別可以產(chǎn)生過敏反應(yīng)（Hypersensitive response,HR），因此，理論上可以利用病原菌無毒基因鑒別寄主所含相應(yīng)抗病基因。目前已在晚疫病菌中鑒定了數(shù)個(gè)無毒基因（Avr1-R1、Avr2-R2、Avr3a-R3a、Avr3b-R3b和Avr4-R4等），這些無毒基因產(chǎn)物與其對(duì)應(yīng)抗病基因產(chǎn)物識(shí)別可以產(chǎn)生典型HR反應(yīng)[13]。本氏煙草農(nóng)桿菌注射瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)（Agro-infiltration）已成功用于馬鈴薯抗性（R）基因與病原物無毒（Avr）基因間的相互作用研究[14]。但在馬鈴薯上進(jìn)行農(nóng)桿菌注射瞬時(shí)表達(dá)還存在一定困難，主要表現(xiàn)在基因型依賴性，有些材料不適合注射，有些材料注射后沒有反應(yīng)。作為一種探索性工作，本研究利用Agro-infiltration技術(shù)將幾個(gè)已知晚疫病菌無毒基因在不同馬鈴薯材料葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，根據(jù)HR反應(yīng)發(fā)生情況，期望快速、準(zhǔn)確鑒定馬鈴薯栽培品種及育種材料所含抗病基因，為利用抗病品種合理布局防治晚疫病和抗病育種奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯材料

馬鈴薯鑒別寄主材料LBR-R1,2,3,4和10種薯由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)過催芽在塑料大棚內(nèi)種植。栽培品種‘華恩1號(hào)’、‘青薯168’、‘會(huì)-2’、‘鄭薯5號(hào)’和‘鄂馬鈴薯3號(hào)’及育種材料‘93008’、‘93011’和‘93014’葉片采自馬鈴薯實(shí)驗(yàn)室溫室種植材料。

1.2 無毒基因瞬時(shí)表達(dá)載體

含有Avr1，Avr2，Avr3a，Avr4和Avr10晚疫病菌無毒基因的雙元表達(dá)載體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯實(shí)驗(yàn)室提供，無毒基因插入雙元表達(dá)載體pCB-302-3中。含有p19質(zhì)粒的表達(dá)載體用于防止外源基因沉默。pCB-302-3空載體為陰性對(duì)照，含有Avr3a/R3a或Vnt1/AvrVnt1基因?qū)Φ妮d體為陽性對(duì)照。所有質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株GV3101中。

1.3 農(nóng)桿菌活化、擴(kuò)大培養(yǎng)和注射用農(nóng)桿菌菌液準(zhǔn)備

（1）活化：將含有相應(yīng)無毒基因載體的保存菌液在含有Rif和Kan（50 mg/L）LB固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L）平板上劃線活化，36～48 h后挑選單菌落，在含有相應(yīng)抗生素的1 mL LB液體培基中于28℃，250 r/min培養(yǎng)24 h。

（2）擴(kuò)大培養(yǎng)：取10 μL上述培養(yǎng)菌液，加入含有相應(yīng)抗生素的5 mL YEB液體培基（胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物1 g/L，牛肉浸膏5 g/L，MgSO4·7H2O，0.5 g/L）的離心管中，于28℃，250 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

（3）注射菌液準(zhǔn)備：將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液4 000 r/min離心10 min收集菌體，后加入等體積MMA（10 mmol/L MES(2-N-嗎啡啉乙磺酸)，10 mmol/L MgCl2，200 mmol/L AS（乙酰丁香酮），pH 5.7）懸浮液，懸浮后離心，4 000 r/min離心10 min；倒掉多余MMA，加入1/2體積的MMA，再次懸浮；檢測(cè)600 nm下的OD值，用MMA稀釋到試驗(yàn)所需OD600值；加入含p19載體的農(nóng)桿菌，室溫靜置2 h左右用于注射。

1.4 馬鈴薯葉片注射

選擇較幼嫩（出苗后40 d）健康的馬鈴薯復(fù)葉，事先在葉片上標(biāo)注注射位點(diǎn)，用2 mL的一次性注射器吸取菌液，在劃定位置上按壓注射，注意不要損傷葉片，以免影響HR反應(yīng)的辨別；每個(gè)處理至少做3次重復(fù)，復(fù)葉葉柄插入裝有無菌水的三角瓶中，然后將三角瓶放入大塑料框中，用塑料膜覆蓋置于（22±2）℃的房間，12 h光照。每天葉面噴水霧一次，3 d后觀察葉片HR發(fā)生情況，記錄并拍照。

1.5 馬鈴薯基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增

馬鈴薯材料基因組DNA小量抽提采用CTAB法。

用于R基因PCR特異擴(kuò)增的引物根據(jù)已有報(bào)道設(shè)計(jì)，具體見表1。PCR體系（20 μL）：ddH2O 15.9 μL，dNTP(10 μmol/L)0.3 μL，10×Buffer 2 μL，Primer F (10 μmol/L)0.3 μL，Primer R(10 μmol/L)0.3 μL，Taq酶0.2 μL，DNA模板1 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸1～2 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。退火溫度和延伸時(shí)間根據(jù)具體引物確定。

表1 R基因特異引物序列Table 1R gene specific PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 瞬時(shí)表達(dá)體系的優(yōu)化

農(nóng)桿菌濃度是影響瞬時(shí)表達(dá)效果的關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)首先在馬鈴薯鑒別寄主‘LBR-R3’葉片上分別注射不同OD600值（0.5，1.0和1.5）的含有Avr3a載體、陰性和陽性對(duì)照載體的農(nóng)桿菌（添加含有p19載體農(nóng)桿菌），觀察注射后馬鈴薯葉片的HR反應(yīng)。結(jié)果顯示在注射8 d后，3個(gè)濃度陽性對(duì)照和Avr3a注射點(diǎn)都出現(xiàn)明顯HR反應(yīng)，但是當(dāng)OD600值為1.5時(shí)，個(gè)別陰性對(duì)照也會(huì)出現(xiàn)比較弱的HR反應(yīng)，而OD600值為0.5，1.0時(shí)陰性對(duì)照病均未出現(xiàn)HR反應(yīng)。表明OD600值為0.5菌液濃度適合在馬鈴薯上瞬時(shí)表達(dá)，濃度高時(shí)可能引起假象。圖1顯示鑒別寄主‘LBR-R3’葉片用OD6000.5農(nóng)桿菌液注射不同天數(shù)后HR反應(yīng)發(fā)生情況。

2.2 5個(gè)病原菌Avr基因在含有相應(yīng)R基因鑒別寄主上的表型

為了鑒別Avr1，Avr2，Avr3a，Avr4和Avr10 5個(gè)病原無毒基因在含有相應(yīng)抗病基因的鑒別寄主上能否誘發(fā)HR反應(yīng)，本研究分別在5個(gè)鑒別寄主上用OD6000.5的農(nóng)桿菌液進(jìn)行葉片注射。結(jié)果顯示注射后3～7 d,Avr1，Avr2，Avr3a和Avr4在相應(yīng)鑒別寄主上能夠誘發(fā)HR反應(yīng)，但Avr10沒有誘發(fā)HR反應(yīng)（圖2）。

圖1 OD6000.5農(nóng)桿菌菌液(含有Avr3a)注射鑒別寄主‘LBR-R3’葉片不同天數(shù)后HR表型Figure 1HR development on potato‘LBR-R3’leaves after agro-infiltrating with 0.5 OD600Agrobacterium suspensions(containing Avr3a)

圖2 無毒基因Avr1、Avr2、Avr3a、Avr4和Avr10在相應(yīng)鑒別寄主上誘發(fā)的HR反應(yīng)Figure 2HR trigged by transient expressing Avr1,Avr2,Avr3a,Avr4 and Avr10 on R gene diagnose potato materials

表2 馬鈴薯鑒別寄主上的HR發(fā)生頻率Table 2HR frequency appeared on corresponding‘LBR-R’plant leaves

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了無毒基因在相應(yīng)鑒別寄主上HR的發(fā)生頻率（表2），結(jié)果顯示陽性對(duì)照在所有馬鈴薯材料上均出現(xiàn)HR，陰性對(duì)照均未出現(xiàn)HR。從表2可以看出，Avr1,Avr2,Avr3a和Avr4均在對(duì)應(yīng)的‘LBR-R’上產(chǎn)生HR；Avr10未出現(xiàn)HR。Avr2，Avr3a重復(fù)性最好，為100%，Avr1次之，Avr4重復(fù)性最差。結(jié)果表明在有足量重復(fù)的前提下，利用這些病原無毒基因、采用農(nóng)桿菌注射法檢測(cè)寄主含有相應(yīng)抗性基因是可靠的。

2.3 馬鈴薯栽培品種及育種材料葉片無毒基因農(nóng)桿菌注射結(jié)果

為了檢測(cè)這5個(gè)晚疫病菌無毒基因能否在栽培品種和育種材料上激發(fā)HR反應(yīng)，從而判斷這些品種可能含有的抗病基因，選取栽培品種‘華恩1號(hào)’、‘早大白’、‘會(huì)-2’、‘中薯3號(hào)’和‘鄂馬鈴薯3號(hào)’、‘鄭薯5號(hào)’及育種材料‘93008’、‘93011’和‘93014’葉片進(jìn)行了3次重復(fù)農(nóng)桿菌注射試驗(yàn)。結(jié)果表現(xiàn)出三種類型（圖3）：A.陽性對(duì)照出現(xiàn)HR,空白未出現(xiàn)HR，表明這些馬鈴薯材料（‘鄂馬鈴薯3號(hào)’，‘93008’、‘93011’和‘93014’）適合農(nóng)桿菌注射（圖3A）。B.所有葉片注射點(diǎn)均產(chǎn)生明顯的壞死斑，表明這些材料（‘華恩1號(hào)’、‘早大白’和‘會(huì)-2’）對(duì)農(nóng)桿菌侵染表現(xiàn)很敏感（圖3B），不適合采用農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)來鑒定其所含晚疫病抗性基因。C.注射點(diǎn)均未產(chǎn)生明顯的HR(圖3C)，表明此類馬鈴薯材料（‘中薯3號(hào)’、‘鄭薯5號(hào)’）對(duì)農(nóng)桿菌侵染表現(xiàn)很不敏感，這類材料也不適合采用農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)來鑒定其所含晚疫病抗性基因。

‘鄂馬鈴薯3號(hào)’經(jīng)相應(yīng)無毒基因鑒定可能含有抗病基因R1、R2、R3、R4和R10，育種材料‘93008’可能含有抗病基因R2、R3和R4，育種材料‘93011’和‘93014’可能含有抗病基因R2和R3（圖3A）。

圖3 不同馬鈴薯品種(材料)葉片注射無毒基因后的表型Figure 3Phenotype on different potato leaves after infiltration with different Avr genes

2.4 R基因特異性引物PCR檢測(cè)

為了檢驗(yàn)無毒基因農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)鑒定結(jié)果是否與分子檢測(cè)一致，本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的5對(duì)晚疫病抗病基因特異引物序列合成PCR擴(kuò)增引物（表1）。以抽提的馬鈴薯基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示R2、R2 family和R4 3對(duì)基因特異引物無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。R1、Rpi-abpt和R3a基因特異引物可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的帶型。馬鈴薯材料‘93011’、‘93014’和品種‘早大白’能夠擴(kuò)增出R1片段（1 400 bp）的條帶（圖4A），‘鄂馬鈴薯3號(hào)’和‘93011’能夠擴(kuò)增出Rpi-abpt（686 bp）片段（圖4B）；馬鈴薯材料‘93011’和品種‘早大白’能夠擴(kuò)增出R3a片段（980 bp）（圖4C）。盡管本研究使用文獻(xiàn)報(bào)道的R基因特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且擴(kuò)增出與目標(biāo)片段大小一致的產(chǎn)物，但由于沒有對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，因此，不能準(zhǔn)確判斷擴(kuò)增出的片段就是對(duì)應(yīng)R基因的片段，也有可能是其等位基因產(chǎn)物。

圖4 R1、R2、R3a和R4基因在馬鈴薯材料中的PCR鑒定Figure 4PCR amplification in different potato materials using R gene specific primers

表3 農(nóng)桿菌注射結(jié)果與基因特異引物PCR結(jié)果比較Table 3Comparison of agro-infiltration andRgene specific primers PCR amplification results

2.5 兩種方法的一致性比較

為了比較農(nóng)桿菌注射與R基因特異引物PCR結(jié)果之間的異同，將兩種方法的結(jié)果進(jìn)行了歸類（表3）。由表3可看出，對(duì)于鑒別寄主‘LBR-R1’和‘LBR-R3’，病原無毒基因Avr1和Avr3a農(nóng)桿菌注射結(jié)果與PCR結(jié)果一致。Avr2和Avr4盡管農(nóng)桿菌注射結(jié)果為陽性，但PCR沒有擴(kuò)增出目標(biāo)帶。對(duì)于馬鈴薯品種和育種材料，Avr2和Avr3a農(nóng)桿菌注射在4個(gè)材料（‘鄂馬鈴薯3號(hào)’、‘93008’、‘93011’和‘93014’）中出現(xiàn)陽性的頻率較高，但是無相應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。材料‘93011’、‘93014’和‘早大白’PCR擴(kuò)增出R1目標(biāo)帶，但是Avr1注射為陰性。由此可見，兩種方法鑒定結(jié)果存在不一致性。

3 討論

明確現(xiàn)有馬鈴薯品種含有的晚疫病抗病基因，對(duì)于合理利用品種抗性防治馬鈴薯晚疫病具有重要意義。馬鈴薯晚疫病抗性基因的鑒定一般采用接種含有已知無毒基因的晚疫病菌小種，通過抗性反應(yīng)來推斷其是否含有相應(yīng)抗性基因，這種方法費(fèi)工費(fèi)時(shí)。目前，中國絕大多數(shù)栽培品種所含晚疫病抗病基因種類不清楚，本研究利用晚疫病菌無毒基因農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)探索鑒別馬鈴薯品種含有的抗病基因的方法，以期為利用該方法鑒定馬鈴薯栽培品種及育種資源晚疫病抗性基因奠定基礎(chǔ)。

從研究結(jié)果（表2）來看，Avr1、Avr2、Avr3a和Avr4均能夠在對(duì)應(yīng)的鑒別寄主上產(chǎn)生HR，表明這4個(gè)無毒基因注射結(jié)果是可靠的。但是，不同無毒基因注射點(diǎn)出現(xiàn)HR的頻率有一定差異。如果注射點(diǎn)有足夠數(shù)量，利用該方法鑒定馬鈴薯材料所含抗病基因還是可靠的。農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)時(shí)菌液濃度是一個(gè)重要參數(shù)，從本研究結(jié)果來看，0.5 OD600是比較理想的濃度。農(nóng)桿菌本身作為一種植物病原菌，很容易引起馬鈴薯系統(tǒng)抗性，因此，濃度太高時(shí)可能導(dǎo)致注射點(diǎn)出現(xiàn)壞死斑，造成假象。由于不同馬鈴薯材料的葉片厚薄和致密程度差別很大，有些馬鈴薯材料很難注射；本研究結(jié)果顯示葉片生理狀態(tài)也是一個(gè)顯著影響農(nóng)桿菌注射效果的關(guān)鍵因素，不同葉齡的葉片敏感性不同，充分展開的幼嫩葉片容易注射，HR出現(xiàn)的時(shí)間也比較快，老葉很不敏感，不適宜農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)。另外發(fā)現(xiàn)有些馬鈴薯材料即使幼葉也不能產(chǎn)生HR反應(yīng)?？梢娹r(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)在馬鈴薯材料上存在明顯的基因型和葉齡依賴性。

理論上馬鈴薯現(xiàn)有品種抗性基因的鑒定也可利用已知抗病基因特異引物和分子標(biāo)記進(jìn)行PCR鑒定，但是到目前為止，能夠用于進(jìn)行抗病基因分子診斷的實(shí)用基因特異引物和分子標(biāo)記并不多[17]。本研究利用文獻(xiàn)報(bào)道的基因特異引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在鑒別寄主上只有Avr1和Avr3a農(nóng)桿菌注射結(jié)果與PCR結(jié)果一致。其余無毒基因農(nóng)桿菌注射結(jié)果與PCR結(jié)果并不一致，有的無毒基因農(nóng)桿菌注射結(jié)果為陽性，PCR結(jié)果為陰性，有的無毒基因農(nóng)桿菌注射結(jié)果為陰性，PCR結(jié)果為陽性。反映了這兩種方法的局限性和復(fù)雜性。PCR結(jié)果也有不確定的因素，一則抗病基因往往與無功能的假基因或同源體成族出現(xiàn)，即便是基因特異引物也有可能出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增，例如有可能擴(kuò)增出R基因的等位基因；二則即便是同一抗病基因，在不同馬鈴薯材料中可能存在堿基序列變化，如果堿基序列變異位置位于引物結(jié)合區(qū)域，也可能導(dǎo)致不能擴(kuò)增。另外，馬鈴薯材料中也有可能存在多個(gè)識(shí)別同一無毒基因產(chǎn)物的蛋白。綜上所述，無毒基因農(nóng)桿菌注射和基因特異引物PCR擴(kuò)增鑒定馬鈴薯材料所含抗病基因都存在不足之處。若將Avr基因農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)和抗病基因特異引物PCR擴(kuò)增結(jié)合起來，則會(huì)提高鑒定的準(zhǔn)確性。如果兩種方法一致，鑒定的準(zhǔn)確性會(huì)更可靠；即使不一致，至少兩種方法能夠提供互補(bǔ)的有價(jià)值信息，可以幫助我們判斷馬鈴薯材料可能含有那些抗病基因。

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《中國馬鈴薯》雜志約稿函

《中國馬鈴薯》雜志是目前全國唯一的馬鈴薯專業(yè)科技期刊，國際刊號(hào)：ISSN 1672－3635，國內(nèi)刊號(hào)：CN 23－1477/S，郵發(fā)代號(hào)：14－167，國內(nèi)外公開發(fā)行。它以繁榮我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)為辦刊宗旨，積極報(bào)道國內(nèi)外有關(guān)馬鈴薯的學(xué)術(shù)研究、科研動(dòng)態(tài)和各種實(shí)用技術(shù)的最新消息。該刊由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國作物學(xué)會(huì)主管，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國作物學(xué)會(huì)馬鈴薯專業(yè)委員會(huì)主辦?！吨袊R鈴薯》（原名《馬鈴薯雜志》）創(chuàng)刊于1987年。2000年經(jīng)申請(qǐng)報(bào)國家新聞出版總署審批，更名為《中國馬鈴薯》，同年改為大16開本，并增加彩色廣告。2001年《中國馬鈴薯》經(jīng)報(bào)黑龍江省科委及省新聞出版局批準(zhǔn)，將原來的季刊改為雙月刊。

《中國馬鈴薯》立足國內(nèi)，并刊登一些其他國家作者的英文稿件。它集學(xué)術(shù)性和技術(shù)性于一體，是馬鈴薯科研、生產(chǎn)、經(jīng)銷單位和用戶之間信息交流的一個(gè)平臺(tái)?！吨袊R鈴薯》不同于其他園藝類期刊，刊登的文章全部是有關(guān)馬鈴薯的，主要欄目包括：遺傳育種、栽培生理、病蟲防治、土壤肥料、產(chǎn)業(yè)開發(fā)、品種介紹、綜述及其他。

該刊于2008年1月1日起開始執(zhí)行作者在線投稿，進(jìn)一步提高了工作效率和辦公自動(dòng)化水平，方便作者查詢。歡迎專業(yè)委員會(huì)各位委員及廣大讀者踴躍投稿，投稿時(shí)請(qǐng)登錄《中國馬鈴薯》稿件遠(yuǎn)程處理系統(tǒng)。

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《中國馬鈴薯》雜志編輯部

2014年8月25日

Identification of Late Blight Resistance R Genes of Potato by Transient Expressing of Phytophthora infestans Avirulence Genes
Using Agro-infiltration

ZHOU Jing,ZHANG Ziying,LU Yuan,TIAN Zhendong＊,XIE Conghua
(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology(HAU),Ministry of Education;National Center for Vegetable Improvement(Central China);
Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070,China)

Late blight,caused by Phytophthora infestans,is a devastating disease of potato.It is important to distinguish what kind of R contained in potato cultivar or potato breeding materials for potato late blight resistant breeding and control late blight through management of different R genes.According to the‘gene-for-gene’hypothesis,the interaction between pathogenavirulencegenes（Avr）andresistantgenes（R）willleadtohypersensitiveresponse（HR）inpotato.So,itispossible to distinguish host R gene by Avr gene expression in potato leaves.In this study,efforts were made to distinguish potato R genes by transient expressing P.infestansAvr gene in potato leaves using agro-infiltration methods.The result revealed that 0.5 optical density at 600(OD600)was suitable for potato agro-infiltration.Agro-infiltration mediatedAvr expression efficiency depended on potato genotype and leaf age.Full expanded younger leaves were fit forAgro-infiltration mediated transientAvr gene expression.Transient expressing Avr1,Avr2,Avr3a and Avr4 in leaves of diagnose potato material which containscorresponding R genes led to HR.Identification results of both agro-infiltration method and R gene specific primers PCR amplification were not consistent in some potato genotypes,reflecting that both methods have some defects.The desirable resultscouldbeobtainedbycombiningthetwomethods.

potato;late blight;avirulence gene;resistant gene;transient expression;agro-infiltration

S532

A

1672－3635（2014）04-0217-08

2014-07-02

國家“863”項(xiàng)目（2013AA102603）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171603）；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2013年大學(xué)生科技創(chuàng)新基金（SRF 2013222）。

周晶（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)轳R鈴薯抗病分子生物學(xué)。

田振東，教授，從事馬鈴薯分子生物學(xué)研究，E-mail:tianzhd@mail.hzau.edu.cn。