結(jié)核性腦膜炎結(jié)核分枝桿菌檢測方法的研究進(jìn)展

文安 張昆南

結(jié)核性腦膜炎(tubercular meningitis，TBM)是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)非化膿性炎性疾病，其臨床表現(xiàn)不典型。傳統(tǒng)的TBM診斷金標(biāo)準(zhǔn)為腦脊液抗酸染色陽性、MTB培養(yǎng)陽性。2009年南非開普敦會(huì)議通過的TMB診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]認(rèn)為，除上述兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)外，采用PCR方法檢測到MTB的DNA也為TBM確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一。

1 腦脊液涂片抗酸染色

齊爾-尼爾森(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法檢測抗酸桿菌(acid-fast bacillus，AFB)要求腦脊液中MTB的細(xì)菌數(shù)量達(dá)5000～50000個(gè)/mL，由于絕大多數(shù)患者腦脊液中MTB數(shù)量不足，陽性率僅為10%～20%[2]。為此，Thwaites等[3]改進(jìn)了此方法，其對(duì)132例臨床診斷TBM患者腰穿抽取6 mL以上腦脊液，以3000g離心15 min沉淀細(xì)菌，鏡檢AFB觀察時(shí)間大于30 min，其AFB陽性檢出率達(dá)到58%。然而，現(xiàn)有研究認(rèn)為腰穿抽取腦脊液6 mL對(duì)一些患兒會(huì)存在危險(xiǎn)[4]，且鏡檢時(shí)間大于30 min對(duì)于忙碌的檢驗(yàn)人員難以接受。此外，Kennedy等[5]采用多次腰穿取腦脊液涂片行抗酸染色檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)52例TBM患者接受1次腰穿腦脊液檢查AFB檢出率為37%，接受4次檢查者AFB檢出率可提高到83%。盡管如此，多次行腰穿增加了醫(yī)生的負(fù)擔(dān)及腰穿并發(fā)癥的潛在風(fēng)險(xiǎn)，患者也難以接受。

近年來，Das等[6]采用金胺酚染色熒光顯微鏡觀察，能夠較Ziehl-Neelsen法AFB檢出率提高5%～10%。Fennelly等[7]將含有20 000～40 000個(gè)/mL MTB的溶液通過一張直徑13 mm、孔徑0.4 μm的聚碳酸酯濾膜過濾濃縮細(xì)菌(SMFs)后，采用金胺酚染色后用熒光顯微鏡觀察，其AFB檢出率提高到89%。我國學(xué)者采用TritonX-100處理腦脊液后，利用細(xì)胞離心涂片機(jī)將細(xì)菌濃縮后置玻片上行Ziehl-Neelsen染色，其AFB檢出率為100%，且多為胞內(nèi)分枝桿菌，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的抗酸染色法[8]。這些改進(jìn)的MTB檢測方法較傳統(tǒng)染色法檢出率顯著提高，但目前研究樣本量較少，仍需增大樣本進(jìn)行證實(shí)。

2 MTB培養(yǎng)

腦脊液中培養(yǎng)出MTB是確診TBM的最權(quán)威方法，現(xiàn)對(duì)目前主要的MTB培養(yǎng)方法進(jìn)行介紹。

2.1固體培養(yǎng)法傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基包括羅氏、Ogawa培養(yǎng)基等，藥敏試驗(yàn)種類多，便于指導(dǎo)臨床抗結(jié)核藥物的選擇，在發(fā)展中國家廣泛使用。但此類方法耗時(shí)長，即使在條件適宜時(shí)采用改良羅氏(L-J)培養(yǎng)法培養(yǎng)MTB平均耗時(shí)亦達(dá)3周，藥物敏感性試驗(yàn)另需3～4周，同時(shí)L-J培養(yǎng)法缺乏敏感性和特異性，使得這種培養(yǎng)方法無法為臨床及時(shí)診斷提供有效幫助[9]。

2.2液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)基中MTB生長速度快，藥敏試驗(yàn)時(shí)間短，現(xiàn)已逐漸取代傳統(tǒng)的L-J培養(yǎng)法。目前普遍采用的有BACTEC、MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)和顯微鏡觀察藥物敏感性檢測技術(shù)(MODS)。

2.2.1BACTEC快速培養(yǎng)系統(tǒng)：Baveja等[10]采用此方法對(duì)100例TBM患兒腦脊液進(jìn)行L-J培養(yǎng)法、BACTEC培養(yǎng)、PCR檢測，結(jié)果顯示BACTEC培養(yǎng)及PCR檢測均為MTB陽性的22例經(jīng)改良L-J培養(yǎng)法培養(yǎng)陽性者僅6例(陽性率27.3%)。Venkataswamy等[11]分別用BACTEC 460TB快速培養(yǎng)系統(tǒng)與傳統(tǒng)L-J培養(yǎng)法培養(yǎng)腦脊液，結(jié)果顯示BACTEC培養(yǎng)系統(tǒng)MTB陽性率為61%，L-J培養(yǎng)法陽性率僅為7%。這些研究結(jié)果提示BACTEC培養(yǎng)法較傳統(tǒng)L-J培養(yǎng)法明顯提高了MTB陽性檢出率。

2.2.2MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)：張娟等[12]對(duì)比研究了MGIT960系統(tǒng)與L-J培養(yǎng)法檢測MTB的效果，MGIT960系統(tǒng)培養(yǎng)出現(xiàn)陽性結(jié)果的時(shí)間(報(bào)陽時(shí)間)平均為9.5 d，顯著短于L-J培養(yǎng)法的31.5 d，該作者提出MGIT960系統(tǒng)可能是目前最為理想的快速M(fèi)TB培養(yǎng)系統(tǒng)。吳學(xué)兵等[13]也采用MGIT系統(tǒng)對(duì)1598例肺結(jié)核患者的痰液進(jìn)行培養(yǎng)，新發(fā)患者痰液培養(yǎng)陽性率為32%，平均報(bào)陽時(shí)間為13.63 d；復(fù)診患者陽性率為9.3%，報(bào)陽時(shí)間為22.94 d，此研究結(jié)果表明抗結(jié)核治療后MTB減少，檢出率下降。

2.2.3MODS技術(shù)：Caviedes等[9]建立的MODS技術(shù)是一種基于液態(tài)培養(yǎng)方法的顯微鏡觀察藥物敏感性檢測技術(shù)，該技術(shù)能夠同時(shí)進(jìn)行MTB培養(yǎng)及其藥物敏感性檢測，其所需時(shí)間不超過2周。Caws等[14]在Caviedes的基礎(chǔ)上將MODS技術(shù)應(yīng)用于TBM的診斷，他們對(duì)156例臨床擬診TBM患者的腦脊液分別進(jìn)行Ziehl-Neelsen抗酸染色、MODS、分枝桿菌生長指示管(MGIT法)、L-J培養(yǎng)法等檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)陽性率MODS技術(shù)為64.9%，MGIT法是70.2%，L-J培養(yǎng)法是70.2%，Ziehl-Neelsen抗酸染色陽性率是52.6%；但是MODS法中位報(bào)陽時(shí)間則顯著縮短至6 d，MGIT 法為15.5 d，L-J培養(yǎng)法為24 d。黃自坤等[15]對(duì)63例TBM的腦脊液分別進(jìn)行MODS和改良L-J培養(yǎng)法培養(yǎng)，結(jié)果MODS的陽性率為54%，遠(yuǎn)高于改良L-J培養(yǎng)法的20.6%。Ha等[16]收集32例TBM患兒腦脊液進(jìn)行MODS和MGIT培養(yǎng)檢測，結(jié)果顯示MTB檢測敏感性和特異性分別為42.3%、100%和39.7%、94.4%，平均報(bào)陽時(shí)間為8 d和13 d，表明MODS培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間也明顯短于MGIT培養(yǎng)。我國學(xué)者采用MODS法檢測胸腔積液和腦脊液中MTB，其檢出敏感性為20.5%和37.5%，特異性均為100%，平均報(bào)陽時(shí)間為14 d和9 d，而采用傳統(tǒng)L-J培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間為32 d和31 d[17]。

2.3其他培養(yǎng)法Bhattacharya等[18]研究出一種雙層介質(zhì)培養(yǎng)基，分別與羅氏培養(yǎng)基、Middle brook 7HI0(7HI0)及Kirchner’ s培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d時(shí)雙層介質(zhì)培養(yǎng)法MTB陽性率為81.7%，最早報(bào)陽時(shí)間為48 h，其陽性率顯著提高并縮短報(bào)陽時(shí)間。還有學(xué)者用孔徑為0.45 μm的濾膜對(duì)腦脊液進(jìn)行過濾，再用濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，明顯提高了MTB檢出陽性率[19]。與傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)相比，液態(tài)培養(yǎng)技術(shù)明顯提高了MTB培養(yǎng)陽性率，縮短了報(bào)陽時(shí)間，具有快速、操作簡單、價(jià)廉等優(yōu)勢，值得在廣大的基層醫(yī)院推廣和應(yīng)用。

3 MTB聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)

Mete分析顯示PCR技術(shù)診斷TBM敏感性可達(dá)到56%，特異性可達(dá)到98%[20]。目前其他類型的PCR技術(shù)也逐步應(yīng)用于MTB的檢測。

3.1多重PCR技術(shù)多重PCR(multiplex PCR)技術(shù)能夠在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)多個(gè)目的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，具有低成本、高效率等特點(diǎn)。Kusum等[21]利用多重PCR技術(shù)對(duì)210例腦脊液標(biāo)本(其中18例為確診TBM)同時(shí)擴(kuò)增protein b、MPB 64，確診TBM組的敏感性達(dá)94.4%，特異性為100%。利用多重PCR技術(shù)檢測多個(gè)目的基因較早期使用的PCR技術(shù)明顯提高了對(duì)MTB的診斷敏感性[22-23]。

3.2巢式PCR技術(shù)巢式PCR技術(shù)(Nest-PCR)使用兩對(duì)PCR引物對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，較常規(guī)PCR顯著增加了循環(huán)次數(shù)，使得目的基因更易被檢測，提高了檢測的敏感性。Huang等[24]利用巢式PCR技術(shù)對(duì)MTB rpoB、MPB-64、IS6110基因進(jìn)行擴(kuò)增，檢測MTB的敏感性達(dá)86%，特異性達(dá)100%。Nandagopal等[25]擴(kuò)增MTB IS6110特異性基因片段，結(jié)果敏感性達(dá)100%，特異性為95.1%。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，巢式PCR技術(shù)簡化了操作步驟，降低了交叉污染的機(jī)會(huì)，減少了假陽性。

3.3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP) LAMP是一種在恒溫的條件下即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的DNA進(jìn)行特異、高效擴(kuò)增的技術(shù)。與常規(guī)PCR和熒光定量PCR技術(shù)不同的是，LAMP不需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，操作簡單，具有快速、高靈敏、價(jià)廉等優(yōu)勢，尤其適合經(jīng)濟(jì)條件一般和一些非專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室使用 。采用LAMP技術(shù)檢測痰涂片MTB陽性的痰液標(biāo)本可以獲得98%的敏感性和94%的特異性[26]。劉云等[27]采用LAMP技術(shù)檢測結(jié)核性胸腔積液，MTB陽性率為61.7%。有研究者應(yīng)用LAMP和巢式PCR技術(shù)同時(shí)對(duì)MTB ISS6110基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果巢式PCR技術(shù)診斷敏感性為52.9%，特異性為90%，而LAMP敏感性和特異性分別為88.23%、80%，所需條件為63°C，反應(yīng)時(shí)間1 h。上述研究表明與其他PCR技術(shù)相比， LAMP技術(shù)明顯縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了TBM診斷的敏感性[28]。Yang等[29]的研究表明LAMP技術(shù)檢測MTB的敏感性高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，特別適用于涂片和培養(yǎng)陰性的樣本。

3.4利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(XpertMTB/RIF) Xpert MTB/RIF技術(shù)是一種基于巢式PCR技術(shù)發(fā)展而來的基因擴(kuò)增技術(shù)，在2 h內(nèi)能夠同時(shí)檢測MTB及其對(duì)利福平的耐藥性，2010年世界衛(wèi)生組織(WHO)將其推薦用于結(jié)核病的診斷。近來Xpert MTB/RIF已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷，其診斷肺結(jié)核(痰涂片陰性，培養(yǎng)陽性)標(biāo)本的敏感性為76.9%，特異性為99%，檢測利福平耐藥的敏感性為94.4%，特異性為98.3%[30]。Hillemann等[31]應(yīng)用Xpert MTB/RIF技術(shù)對(duì)521份人體體液標(biāo)本(腦脊液19份)進(jìn)行檢測，結(jié)果腦脊液檢測結(jié)果顯示TBM診斷敏感性為77.3%，特異性為100%。另外有研究報(bào)道Xpert MTB/RIF檢測腦脊液標(biāo)本MTB的敏感性27%～86%，特異性99%～100%[32]。Alvarez-Uria等[33]對(duì)比Xpert MTB/RIF技術(shù)和熒光顯微鏡鏡檢對(duì)MTB的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示Xpert MTB/RIF對(duì)MTB的檢出率是熒光顯微鏡檢的12倍。然而，Xpert MTB/RIF價(jià)格昂貴，短期內(nèi)難于廣泛推廣和應(yīng)用。雖然PCR技術(shù)對(duì)TBM檢出率最高、耗時(shí)也較短、所需腦脊液量少，但其容易受外界干擾，檢測結(jié)果存在一定的假陽性和假陰性，僅憑1次結(jié)果有時(shí)難于作出準(zhǔn)確診斷，需結(jié)合臨床資料綜合判斷。

此外，增加患者腰穿次數(shù)、增加腦脊液所測容量、濃縮腦脊液等以提高M(jìn)TB含量，在此基礎(chǔ)上采用簡單、易行、方便推廣的ELISA方法能夠提高M(jìn)TB的檢測敏感性和控制非特異性。然而，目前相關(guān)的研究較少，難于將其推廣用于臨床MTB的檢查。本文作者的研究組采用基于腦脊液濃縮技術(shù)的dot-ELISA法[34]和雙抗夾心ELISA法[35]檢測MTB，其敏感性分別為93.1%和78.26%，特異性分別為92.5%和96.42%。

雖然近年來腦脊液MTB的檢出技術(shù)已經(jīng)取得了進(jìn)步，然而由于MTB在腦脊液中含量低，致使目前的檢測敏感性仍不高，總體上并未顯著提高M(jìn)TB的診斷率。相信隨著研究的不斷深入，將會(huì)有更為簡單、方便、易于推廣的新方法用于早期MTB的診斷。

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