病毒宏基因組及其在鼠類腸道病毒中的研究進展

曹婧

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病毒宏基因組及其在鼠類腸道病毒中的研究進展

曹婧

671000 大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，Email：275824198@qq.com

當(dāng)傳統(tǒng)的序列測定方法還在測定某種單一種類的基因組特征時，宏基因組學(xué)（Metagenomics）卻能超越種族的界限，通過單一種來探索變化多樣的微生物群落。這種方法提供了一個通過已知單一樣本來了解整個生物群體多樣性的全局觀，完全不受培養(yǎng)物需求的限制[1-5]。通過不懈的努力，我們發(fā)現(xiàn)在這一領(lǐng)域里病毒群落在生態(tài)系統(tǒng)中就像海洋一樣變化多端[1, 6]。病毒宏基因組可以用于描述現(xiàn)存自然環(huán)境中的病毒菌群[1, 7-13]，也可以描述哺乳動物糞便中的病毒[14-17]、細胞培養(yǎng)中的病毒[18-19]、呼吸道抽出物中的病毒[20]以及血液中的病毒[21-22]。

1 病毒宏基因組學(xué)概述

宏基因組學(xué)是近年來新興的從基因組角度高通量分析在特定環(huán)境中所有微生物遺傳組成的學(xué)科。病毒宏基因組能夠探知整個生物圈中大部分的生物群體的基因多樣性，并且能夠消除傳統(tǒng)病毒鑒定方法，例如 PCR 或微數(shù)列的局限性。與傳統(tǒng)的宏基因組得到 DNA 全序列的方法相反，在病毒宏基因組的方法中，最初的病毒核酸提純就墊定了病毒序列是否能測出的基礎(chǔ)。病毒宏基因組能夠了解病毒群體的構(gòu)建，并且能發(fā)現(xiàn)新的基因和病毒。

2 主要技術(shù)路線

2.1 樣品制備

2.1.1 提取核酸 理論上，任何種類的樣品都可以被宏基因組學(xué)分析，包括海水[7]、血液[21]、馬糞[16]、莖株[17]、海洋沉積物[9]、珊瑚組織[23-24]以及溫泉[25]。如果我們想把病毒的 DNA 或 RNA 隔離出來單獨研究，特別是想提取某一有代表性的小片段時，常常會有些困難。因為病毒基因組的長度相對較短，經(jīng)常會被細菌或真核生物的核苷酸干擾。因此移除非病毒核酸是非常必要的[26]。這樣我們就要集中樣本中的病毒顆粒，樣本必須經(jīng)過混合、過濾、超速離心三個步驟。為了保證在病毒制備過程中不損失病毒，在樣本的混合、過濾、氯仿處理后，要用 SYBR-金染色法來檢測病毒顆粒的剩余量[26]。

2.1.2 DNA 酶處理 DNA 酶消化后通常用氯仿處理法來移除受污染的 DNA。氯仿使線粒體、細菌和真核生物的膜破裂，從而釋放無病毒的 DNA 去進行下一步的核酸酶處理[27-28]。但是氯仿處理液可能會破壞保護包膜病毒的類脂膜，使它們的 DNA 被 DNA 酶消化[21]。此外，DNA 酶處理并非每次都能完全地消除樣本中的無病毒 DNA[26]。提取核酸后，DNA 可能需要通過隨機引物來進行放大處理[29-30]。用 whole transcriptome amplification（WTA）試劑盒能通過病毒 RNA 合成 cDNA[31]。

2.1.3 分離病毒 由 Allen 和他的研究伙伴們引進的單病毒基因組可以在測序前有選擇地隔離病毒[32]。Brussaard 等[33]最先提出單病毒基因組可以通過流式細胞儀將病毒分類。不同大小的 DNA 被瓊脂糖膠固定住，然后用多重置換擴增法（multiple displacement amplification）來擴增。在流式細胞術(shù)和多重置換擴增法中，也可以增加一個單病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄步驟。

2.2 高通量測序

早先的宏基因組測序法都與鳥槍法文庫有關(guān)，并且通過 Sanger 酶的雙脫氧測序法來獲得整個 DNA 內(nèi)容物的直接序列。這種方法可以探索海洋環(huán)境中的新噬菌體[34]。1977 年首次記載的 Sanger 技術(shù)是測序的標準方法[35]。新一代測序的發(fā)展提供了兼具速度、自動化、高通量的測序平臺，Sanger 技術(shù)只能從一百個因子中選取一個來測序，而新技術(shù)卻可以從百萬因子中選取一個。

新一代的測序平臺如 Illumina/Solexa 測序技術(shù)和羅氏 454 測序已經(jīng)更多地應(yīng)用到病毒宏基因組測序上。Illumina/Solexa 測序技術(shù)的基礎(chǔ)是測序合成的化學(xué)作用，將樣本的 DNA 片段和寡核苷酸連接物連接。連接物在載體中扮演一個引物的角色，作用是將 DNA 多聚酶和可逆的終止子核苷酸結(jié)合，每一個都用不同的熒光染料標記。一個有代表性的測序可以產(chǎn)生 18 G的數(shù)據(jù)，讀出的核苷酸的平均長度在 75 ~ 100 bp[36]。例如甘薯桿狀 DNA 病毒屬（sweet potato badnavirus）和甘薯玉米線條病毒屬（sweet potato mastrevirus）就是通過 Illumina/Solexa 測序平臺發(fā)現(xiàn)的[37]。

現(xiàn)在為了發(fā)現(xiàn)和鑒定新病毒，最常使用的就是羅氏公司生產(chǎn)的 454 測序儀。這種平臺經(jīng)常用來鑒定未被記錄過的真菌病毒，例如紅火蟻病毒 3（solenopsis invicta virus 3）[38]、Merino Walk 病毒和新的沙粒病毒[39-40]。為了測序，必須把 DNA 變成片段，連接在被生物素酶化的特殊連接子上。DNA/連接子的合成片段連接在一個鋪滿抗生蛋白鏈菌素的串珠狀固定凹上，這個固定凹能將 DNA 鎖在一小滴水和PCR 碎片里，然后保存在油乳膠中。第一輪擴增中的每一個片段都是為了制造測序反應(yīng)的模板。為了能夠測序，在退火時將引物與模板的連接子部分合成，然后用 DNA 多聚酶將核苷酸結(jié)合，以便使互補的DNA更容易延伸。某些光感產(chǎn)品可以測量這一過程中釋放的焦磷酸鹽的量[41-42]。在DNA多聚酶介導(dǎo)DNA合成的過程中，羅氏 454 法把焦磷酸鹽的釋放作為核苷酸結(jié)合的結(jié)果。電荷耦合器件（charge-coupled device）相機可以捕捉光信號，然后將光信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字數(shù)據(jù)[43-44]。454 測序最合適的范圍：大概可以讀取一百萬個平均長度在 350 ~ 450 bp 的核苷酸，總量在 0.4 G 左右。

2.3 生物信息學(xué)分析

在對病毒序列進行分類指令時有一個內(nèi)部難題：用來建立系統(tǒng)樹的所有病毒中并沒有一個普遍對應(yīng)的核苷酸成分——某個因子同時也能討論病毒是否屬于生命樹[45]。在大多數(shù)的宏基因組研究中，同源性搜索通過比對儲存于本地數(shù)據(jù)庫或是公共數(shù)據(jù)庫中記錄在案的序列后，總是對高通量測序產(chǎn)生的序列有所疑問。更巧的是，若比對未知病毒序列，同源性搜索便會拒絕 GenBank 中的已知序列。

關(guān)于宏基因組庫的分析，要求對于有爭議的病毒片段能夠快速地計算和正確地分析。為了保證生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)都是高質(zhì)量的，讀取的數(shù)據(jù)都必須是經(jīng)過典型處理的。處理的方法就是移除所有背景序列，包括在過濾、氯仿、DNase I 處理后仍殘留的宿主和細菌的DNA[46-48]。我們從相同生物體的類似種中得到的每一個序列都是合成序列，合成序列的讀取需要與嚴格的參數(shù)組合才能產(chǎn)生毗連序列群。使用一個嚴格的匯編參數(shù)是避免序列抗體嵌合的關(guān)鍵。然后將毗連序列群序列用 BLAST100 或 USEARCH101 來與 GenBank 中無多余核苷酸的數(shù)據(jù)庫進行比對。如果用一個只包含病毒序列的數(shù)據(jù)庫來記錄這些，將不能鑒別未知的細菌、古細菌或者真核生物的序列，并且將導(dǎo)致對未知片段的過高評價。

由于不同研究會產(chǎn)生越來越多的數(shù)據(jù)，需要記錄不同的病毒宏基因組，但是由于缺乏下游數(shù)據(jù)分析的標準規(guī)則，交叉宏基因數(shù)據(jù)分析法變得越來越重要[49-50]。具體方法就是要做好病毒宏基因組研究的相關(guān)報告，包括記錄：①測序平臺和版本號；②在原始數(shù)據(jù)庫登錄的原始序列數(shù)據(jù)；③關(guān)于生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)，包括同源性搜索工具和用于生物分類學(xué)分配的數(shù)據(jù)和它們的版本；④已知病毒和以前未知病毒的對比，清楚地體現(xiàn)這個新病毒究竟是屬于已經(jīng)收錄的種中的一個新菌株還是完全不同的病毒；⑤如果需要的話，加上因果性證據(jù)。

3 鼠類腸道病毒宏基因組的研究

人類和鼠類頻繁的交互作用使兩者有著共同的動物傳染病。鼠類是眾所周知的天然宿主，它能儲存為數(shù)眾多的動物源性病毒，這些病毒可以使人類患上嚴重的疾病。鼠攜帶病毒種類包括了痘病毒科（）、皰疹病毒科（）、腺病毒科（）、多瘤病毒科（）、細小病毒科（）、反轉(zhuǎn)錄病毒科（）、嗜肝 DNA 病毒科（）、副黏病毒科（）、沙粒病毒科（）、黃病毒科（）、布尼亞病毒科（）、星狀病毒科（）、微 RNA 病毒科（）和冠狀病毒科（）等 10 多個病毒科。我們用宏基因組這種無偏倚的方法去了解鼠類糞便中眾多的病毒。Phan 等[51]最近用宏基因組學(xué)的方法，對美國捕獲的 105 只鼠類標本進行了腸道病毒研究，共獲得 26 846 條病毒序列（> 100 bp），包括圓環(huán)病毒科（）、雙生病毒科（）、矮縮病毒科（）、濃核病毒科（）、細小病毒科、擬態(tài)病毒科（）、乳頭瘤病毒科（）、星狀病毒科、虹彩病毒科（）、多分體 DNA 病毒科（）、桿狀病毒科（）、雙組分 RNA 病毒科（）、微 RNA 病毒科、雙順反子病毒科（）、傳染性軟腐病病毒（）、腺病毒科、星狀病毒科（）、野田村病毒科（）、Nora 病毒、冠狀病毒科等 20 多科的病毒，其中還發(fā)現(xiàn)新的鼠乳頭瘤病毒、圓環(huán)病毒、博卡病毒（Bocavirus）、微小核糖核酸病毒、微 RNA 病毒、星狀病毒、腺病毒和腺聯(lián)病毒等。用宏基因組這種方法可以大大地提升我們對鼠類中的真核病毒多樣性的認識。結(jié)合宏基因組學(xué)、隨機 PCR 和 454 高通量測序等技術(shù)，分析不同鼠類種群中腸道病毒群基因組組成、豐度和動態(tài)變化，可以豐富我們對自然環(huán)境中未知病毒的認識，為預(yù)防和控制一些可能發(fā)生的新發(fā)病毒性疾病的暴發(fā)和流行提供科學(xué)的指導(dǎo)。

4 展望

病毒宏基因組是一個能探索病毒生物學(xué)世界的新工具，并且這一領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展對其他領(lǐng)域也有很多益處?，F(xiàn)在科學(xué)家們在研發(fā)可以用來治療疾病以及用于生物技術(shù)等方面的新病毒酶。病毒宏基因組在監(jiān)測病毒病原體方面也有著巨大的優(yōu)勢，這對公眾健康和食品安全也十分重要。昆蟲可以通過傳播媒介把目標病毒傳給人類和植物，宏基因組在現(xiàn)有的領(lǐng)域可以了解病毒的循環(huán)并且能夠提早發(fā)現(xiàn)、鑒別病毒病原體。此外，從人類糞便中得到的宏基因組數(shù)據(jù)也可作為一種新的指示劑來鑒別糞便污染的問題，對水的質(zhì)量進行檢測?？偠灾《竞昊蚪M提供了科學(xué)的方法去探索廣闊環(huán)境中的病毒，這樣就可以了解病毒的多樣性，了解病毒的進化過程，也能作為一種新的探測方法應(yīng)用在社會生活中。

[1] Breitbart M, Salamon P, Andresen B, et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(22):14250-14255.

[2] Tyson GW, Chapman J, Hugenholtz P, et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature, 2004, 428(6978):37-43.

[3] Venter JC, Remington K, Heidelberg JF, et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science, 2004, 304(5667): 66-74.

[4] Tringe SG, von Mering C, Kobayashi A, et al. Comparative metagenomics of microbial communities. Science, 2005, 308(5721): 554-557.

[5] Hallam SJ, Putnam N, Preston CM, et al. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science, 2004, 305(5689):1457-1462.

[6] Culley AI, Lang AS, Suttle CA. Metagenomic analysis of coastal RNA virus communities. Science, 2006, 312(5781):1795-1798.

[7] Angly FE, Felts B, Breitbart M, et al. The marine viromes of four oceanic regions. PLoS Biol, 2006, 4(11):e368.

[8] Bench SR, Hanson TE, Williamson KE, et al. Metagenomic characterization of Chesapeake Bay virioplankton. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(23):7629-7641.

[9] Breitbart M, Felts B, Kelley S, et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proc Biol Sci, 2004, 271(1539):565-574.

[10] Culley AI, Lang AS, Suttle CA. Metagenomic analysis of coastal RNA virus communities. Science, 2006, 312(5781):1795-1798.

[11] Desnues C, Rodriguez-Brito S, Rayhawk S, et al. Biodiversity and biogeography of phages in modern stromatolites and thrombolites. Nature, 2008, 452(7185):340-345.

[12] Dinsdale EA, Edwards RA, Hall D, et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature, 2008, 452(7187):629-632.

[13] Fierer N, Breitbart M, Nulton J, et al. Metagenomic and small-subunit rRNA analyses reveal the genetic diversity of bacteria, archaea, fungi, and viruses in soil. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(21):7059-7066.

[14] Breitbart M, Haynes M, Kelley S, et al. Viral diversity and dynamics in an infant gut. Res Microbiol, 2008, 159(5):367-373.

[15] Breitbart M, Hewson I, Felts B, et al. Metagenomic analyses of an uncultured viral community from human feces. J Bacteriol, 2003, 185(20):6220-6223.

[16] Cann AJ, Fandrich SE, Heaphy S. Analysis of the virus population present in equine faeces indicates the presence of hundreds of uncharacterized virus genomes. Virus Genes, 2005, 30(2):151-156.

[17] Zhang T, Breitbart M, Lee WH, et al. RNA viral communityin human feces: prevalence of plant pathogenic viruses. PLoS Biol, 2006, 4(1):e3.

[18] Jones MS 2nd, Harrach B, Ganac RD, et al. New adenovirus species found in a patient presenting with gastroenteritis. J Virol, 2007, 81(11): 5978-5984.

[19] Kapoor A, Victoria J, Simmonds P. A highly divergent picornavirus in a marine mammal. J Virol, 2008, 82(1):311-320.

[20] Allander T, Tammi MT, Eriksson M, et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(36):12891-12896.

[21] Breitbart M, Rohwer F. Method for discovering novel DNA viruses in blood using viral particle selection and shotgun sequencing. Biotechniques, 2005, 39(5):729-736.

[22] Jones MS, Kapoor A, Lukashov VV, et al. New DNA viruses identified in patients with acute viral infection syndrome. J Virol, 2005, 79(13):8230-8236.

[23] Marhaver KL, Edwards RA, Rohwer F. Viral communities associated with healthy and bleaching corals. Environ Microbiol, 2008, 10(9): 2277-2286.

[24] Vega Thurber R, Willner-Hall D, Rodriguez-Mueller B. Metagenomic analysis of stressed coral holobionts. Environ Microbiol, 2009, 11(8): 2148-2163.

[25] Schoenfeld T, Patterson M, Richardson PM, et al. Assembly of viral metagenomes from yellowstone hot springs. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(13):4164-4174.

[26] Thurber RV, Haynes M, Breitbart M, et al. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat Protoc, 2009, 4(4):470-483.

[27] Willner D, Furlan M, Schmieder R, et al. Microbes and health sackler colloquium: metagenomic detection of phage-encoded platelet- binding factors in the human oral cavity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 108 Suppl 1:4547-4553.

[28] Lee S, Hallam SJ. Extraction of high molecular weight genomic DNA from soils and sediments. J Vis Exp, 2009(33). pii:1569.

[29] Dean FB, Nelson JR, Giesler TL, et al. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification. Genome Res, 2001, 11(6):1095-1099.

[30] Pinard R, de Winter A, Sarkis GJ, et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through highthroughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics, 2006, 7:216.

[31] Tomlins SA, Mehra R, Rhodes DR, et al. Whole transcriptome amplification for gene expression profiling and development of molecular archives. Neoplasia, 2006, 8(2):153-162.

[32] Allen LZ, Ishoey T, Novotny MA, et al. Single virus genomics: a new tool for virus discovery. PLoS One, 2011, 6(3):e17722.

[33] Brussaard CP, Marie D, Bratbak G. Flow cytometric detection of viruses. J Virol Methods, 2000, 85(1-2):175-182.

[34] Finkbeiner SR, Li Y, Ruone S, et al. Identification of a novel astrovirus (astrovirus VA1) associated with an outbreak of acute gastroenteritis. J Virol, 2009, 83(20):10836-10839.

[35] Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 1977, 74(12): 5463-5467.

[36] Ansorge WJ. Next-generation DNA sequencing techniques. N Biotechnol, 2009, 25(4):195-203.

[37] Kreuze JF, Perez A, Untiveros M, et al. Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses. Virology, 2009, 388(1):1-7.

[38] Valles SM, Hashimoto Y. Isolation and characterization of Solenopsis invicta virus 3, a new positive-strand RNA virus infecting the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Virology, 2009, 388(2):354-361.

[39] Palacios G, Druce J, Du L, et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N Engl J Med, 2008, 358(10):991-998.

[40] Palacios G, Savji N, Hui J, et al. Genomic and phylogenetic characterization of Merino Walk virus, a novel arenavirus isolated in South Africa. J Gen Virol, 2008, 91(Pt 5):1315-1324.

[41] Meyer M, Stenzel U, Hofreiter M. Parallel tagged sequencing on the 454 platform. Nat Protoc, 2008, 3(2):267-278.

[42] Meyer M, Stenzel U, Myles S, et al. Targeted high-throughput sequencing of tagged nucleic acid samples. Nucleic Acids Res, 2007, 35(15):e97.

[43] Nyrén P. The history of pyrosequencing. Methods Mol Biol, 2007, 373:1-14.

[44] Hyman ED. A new method of sequencing DNA. Anal Biochem, 1988, 174(2):423-436.

[45] Rohwer F, Edwards R. The Phage Proteomic Tree: a genomebased taxonomy for phage. J Bacteriol, 2002, 184(16):4529-4535.

[46] Schmieder R, Edwards R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics, 2011, 27(6):863-864.

[47] Schmieder R, Edwards R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLoS One, 2011, 6(3):e17288.

[48] Schmieder R, Lim YW, Rohwer F, et al. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC Bioinformatics, 2010, 11:341.

[49] Field D, Garrity G, Gray T, et al. The minimum information about a genome sequence (MIGS) specification. Nat Biotechnol, 2008, 26(5): 541-547.

[50] Raes J, Foerstner KU, Bork P. Get the most out of your metagenome: computational analysis of environmental sequence data. Curr Opin Microbiol, 2007, 10(5):490-498.

[51] Phan TG, Kapusinszky B, Wang C, et al. The fecal viral flora of wild rodents. PLoS Pathog, 2011, 7(9):e1002218.

2014-04-01

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.011