利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別油茶品種

陳贏男，張新葉，戴曉港

(南京林業(yè)大學(xué) 林木遺傳與基因工程重點實驗室，江蘇 南京 210037)

油茶CamelliaL.是世界四大木本油料樹種之一，也是我國最重要的木本油料經(jīng)濟(jì)作物，其壽命長，具有一次種植、多年受益的特點，穩(wěn)定收獲期可長達(dá)80 a以上[1]。近年來，我國南方大力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，全國現(xiàn)有油茶種植面積達(dá)到333萬hm2[2]。在油茶產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展過程中，造林種苗是否為優(yōu)良品種，與優(yōu)良品種的選育一樣，均是油茶林優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的基礎(chǔ)。為確保油茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，急需建立一套真實、簡便、快速、可靠的油茶品種遺傳真實性鑒定技術(shù)，用于對油茶種苗生產(chǎn)的監(jiān)督檢查，對新品種的認(rèn)定，以及對育種工作者知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)。

植物品種遺傳真實性鑒定的關(guān)鍵是所依賴的技術(shù)手段。植物品種鑒別所采用的方法主要是依據(jù)植物的形態(tài)特征[3]，但植物品種間在形態(tài)上的差異，特別是苗期的差異，往往并不十分顯著。尤其是油茶這類世代周期長的物種，形態(tài)上的差異一般到了成熟期才能表現(xiàn)出來，大多數(shù)品種根本無法從幼苗的形態(tài)上進(jìn)行鑒別。自20世紀(jì)80年代以來，現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為植物新品種的鑒定提供了準(zhǔn)確可靠的技術(shù)手段[4]。分子標(biāo)記是以基因組DNA為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，是指能反映生物個體或種群間基因組差異的特征DNA片段，也稱DNA指紋圖譜。分子標(biāo)記技術(shù)直接以植物基因組DNA為分析對象，從根本上克服了環(huán)境的影響，同時也不受基因表達(dá)調(diào)控的限制，在DNA水平上進(jìn)行品種遺傳真實性鑒定不但可靠性高，而且大大提高了檢測效率。常見的分子標(biāo)記有RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制片段長度多態(tài)性)、RAPD(random ampli fi ed polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性)、AFLP(ampli fi ed fragment length polymorphism擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)、SSR(simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列或微衛(wèi)星序列)、ISSR(inter-simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列間隔)等[5-6]。通過DNA指紋技術(shù)鑒別生物個體已經(jīng)成為一項成熟的技術(shù)，并在許多植物新品種鑒別中得到了廣泛應(yīng)用[4]，該技術(shù)也成功應(yīng)用于油茶的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定等方面的研究[7-9]。

微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)是利用所研究物種自身的基因組序列開發(fā)而來，具有高度的特異性，同時微衛(wèi)星序列又是基因組中變異速率最快的序列[10]，微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度的多態(tài)性。因此，在各標(biāo)記類型中，微衛(wèi)星標(biāo)記是用于植物品種真實性鑒定的最為適宜的標(biāo)記技術(shù)[11]。本研究中利用本實驗室開發(fā)的油茶微衛(wèi)星引物數(shù)據(jù)庫，篩選出擴(kuò)增譜帶清晰，且多態(tài)性高的微衛(wèi)星引物，并對這些引物用于油茶品種鑒定的實際效應(yīng)進(jìn)行了針對性試驗，提供了一個油茶品種鑒定的操作實例。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所使用的油茶品種是通過南京林業(yè)大學(xué)南方林木種子檢驗中心聯(lián)系南方幾省區(qū)的林木種苗站獲得，所收集的品種嫁接苗于南京林業(yè)大學(xué)溫室中培養(yǎng)，摘取頂部幼嫩葉片用于基因組DNA提取。DNA提取方法參照Murray和Thomson的CTAB 法[12]。

1.2 微衛(wèi)星引物選取、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

微衛(wèi)星引物選自Shi等[13]報道的油茶微衛(wèi)星引物數(shù)據(jù)庫(引物序列見ftp://202.119.210.10.)。根據(jù)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增位點所含重復(fù)序列的長度，選取1 000對油茶微衛(wèi)星引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行了合成。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星可分為2大類：長度不小于20bp的SSR為第1類，長度為12～20bp的為第2類[14]。與第2類SSR相比，第1類SSR具有更高的多態(tài)性[15]。這一規(guī)律是Weber最早于人類的微衛(wèi)星試驗數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，并已在很多生物體中得到證實[16-17]。本研究中選取的油茶微衛(wèi)星引物其擴(kuò)增位點所含重復(fù)序列的長度均不小于20bp。利用合成的引物對浙江紅花油茶和湘林1號的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳對這1 000對SSR引物進(jìn)行初步篩選，首先篩選出有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABI-9700熱循環(huán)儀上進(jìn)行。PCR總反應(yīng)體系為15μL，反應(yīng)體系包括：模板DNA 25 ng，上、下游引物各20 ng(FAM標(biāo)記)，200μmol/L dNTP，0.5 U Taq聚合酶，1.5μL 10×buffer(含 100μmol/L Tris-HCl，pH 值8.3，500mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2和 10g/L BSA)，用無菌去離子水補(bǔ)充反應(yīng)體積到15μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；然后94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸5min。

隨機(jī)挑選來自8個不同地點的油茶，提取基因組DNA，用8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳對有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物進(jìn)行多態(tài)性篩選。聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測的具體操作步驟如下：制備8％聚丙烯酰胺凝膠；室溫下聚合2h后，將凝膠板固定于電泳槽上，用1×TBE沖洗膠孔，并在55℃保溫箱中低壓預(yù)電泳30min；取1μL PCR產(chǎn)物，按1∶9的比例與上樣緩沖液(9μL去離子甲酰胺＋1μL 10mg/mL溴酚蘭)混合；94℃變性10min，結(jié)束后迅速置冰上冷卻；點樣，200 V恒壓在55℃保溫箱中電泳1h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行凝膠硝酸銀染色，具體過程如下：將凝膠放入脫色盤中，用去離子水在脫色搖床上緩慢洗滌2min；將凝膠轉(zhuǎn)入盛1％硝酸銀溶液的脫色盤中，在脫色搖床上緩慢搖動，染色30min；用去離子水快速清洗凝膠2次后，轉(zhuǎn)入盛顯色液的脫色盤中，在脫色搖床上緩慢搖動，顯色約10min，當(dāng)凝膠上顯出清晰的DNA條帶時，取出凝膠用去離子水漂洗2次后，置燈箱上拍照。

對引物擴(kuò)增位點的變異頻率用多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)指數(shù)進(jìn)行估算。

式中，CPI為某SSR引物擴(kuò)增位點的多態(tài)信息含量；n為某SSR引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)；Pi為該位點第i個等位基因的頻率[18]。

根據(jù)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增位點的多態(tài)信息含量指數(shù)和聚丙烯凝膠電泳譜帶篩選出電泳指紋清晰、基因型容易判定、多態(tài)性信息含量高的引物組合，應(yīng)用于以下油茶品種的鑒別實例。

1.3 油茶品種鑒別實例

該鑒別實例目的是利用篩選出的油茶微衛(wèi)星引物從送檢材料中識別出目標(biāo)品種。送檢人員將樣品編號，但編號與品種名稱的對應(yīng)順序不告知檢驗人員。在送檢的9份樣品中只有1份為‘岑軟3號’，其它樣品為隨機(jī)選取的不同品種。要在送檢樣品中鑒別出哪份為‘岑軟3號’，并由送檢人員確定檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確。在試驗過程中采用標(biāo)準(zhǔn)的‘岑軟3號’為對照，為驗證PCR反應(yīng)的重復(fù)性，對照設(shè)置2個重復(fù)。利用篩選出的引物對包括對照在內(nèi)的11份樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星引物篩選

微衛(wèi)星引物擴(kuò)增位點多態(tài)性篩選結(jié)果顯示，不同引物擴(kuò)增等位基因數(shù)為2～13個，PIC指數(shù)的變化范圍在0.245～0.900之間，平均PIC指數(shù)為0.673。根據(jù)聚丙烯凝膠電泳譜帶和引物擴(kuò)增位點的PIC指數(shù)，選取10對電泳指紋清晰、基因型容易判定、多態(tài)性信息含量高的引物組合，用于油茶品種的遺傳真實性鑒定。將這些組合分別命 名 為：NJFUC-601，NJFUC-53，NJFUC-57，NJFUC-251，NJFUC-833，NJFUC-600，NJFUC-787，NFJUCID-273，NJFUC-243，NJFUC-653。對應(yīng)引物的PIC指數(shù)分別為：0.70，0.85，0.94，0.98，0.94，0.88，0.94，0.94，0.96，0.95。引物具體序列見表1。

表1 所篩選用于油茶品種遺傳真實性鑒定的微衛(wèi)星引物序列Table 1 SSR primers sequences used for identifying the authenticity of cultivars in Camellia L.

2.2 送檢樣品品種鑒別

首先從表1所列引物中隨機(jī)選用了引物NJFUC-243對送檢樣品進(jìn)行了DNA指紋分析，產(chǎn)生的指紋見圖1A。從結(jié)果可以看出，當(dāng)利用引物NJFUC-243進(jìn)行檢測時，共有4份樣品和對照基因型一致。圖1A中泳道1、2為對照‘岑軟3號’的聚丙烯酰胺凝膠電泳指紋圖，其它泳道為待檢樣品，其中泳道6、9、10、11的樣品和對照‘岑軟3號’的指紋圖相同。利用該引物首先將候選樣品縮減至4個。然后隨機(jī)選取了第2對引物NJFUC-57進(jìn)一步檢測，產(chǎn)生的指紋見圖1B，結(jié)果顯示候選樣品中只剩其中的1個樣品(泳道6)和對照基因型一致。所以樣品6號為‘岑軟3號’，其它樣品均排除為‘岑軟3號’的可能。根據(jù)送檢樣品記錄，檢驗結(jié)果與實際情況完全吻合。結(jié)果證實了篩選出的油茶品種微衛(wèi)星引物在此類分析中的有效性。

3 結(jié)論與討論

圖1 NJFUC-243(A)及NJFUC-57(B)在對照及送檢樣品中產(chǎn)生的指紋圖Fig.1 Fingerprint map of submitted sample and control generated by NJFUC-243(A) and NJFUC-57(B)

應(yīng)用分子標(biāo)記對植物品種進(jìn)行遺傳真實性鑒定需要考慮以下因素：(1)簡便、快速，易于在實際檢驗工作中推廣使用；(2)標(biāo)記針對待檢物種有高度特異性，使檢測結(jié)果不受內(nèi)源和外源微生物或病原菌影響；(3)標(biāo)記擴(kuò)增基因位點多態(tài)性高，可以利用較少的引物組合達(dá)到較高的檢測精度?？紤]上述要求，微衛(wèi)星標(biāo)記是目前不同標(biāo)記類型中，用于植物品種遺傳真實性鑒定的可靠而又高效的標(biāo)記技術(shù)。微衛(wèi)星DNA也稱簡單重復(fù)序列，是由長度為1～6bp串聯(lián)重復(fù)序列組成，微衛(wèi)星是基因組中變異最為迅速的序列，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同[10]。微衛(wèi)星標(biāo)記是基于PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的標(biāo)記，微衛(wèi)星標(biāo)記分析相對于基于分子雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記要簡便、快速得多[19]。同時微衛(wèi)星引物是由待檢物種的基因組序列開發(fā)而來，具有極高的種屬特異性，這樣即使樣品中含有不同的內(nèi)源和外源微生物或病原菌污染，檢測結(jié)果也不會受到干擾。這一優(yōu)點是RAPD或AFLP等這類隨機(jī)標(biāo)記所不具備的。

雖然微衛(wèi)星標(biāo)記具有上述優(yōu)點，但在凝膠電泳中有些引物會產(chǎn)生“影子”譜帶，影響結(jié)果判讀，因此篩選能夠產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定指紋圖的引物，是利用該技術(shù)進(jìn)行遺傳鑒別的關(guān)鍵。在本研究中從大量引物中篩選出可應(yīng)用于油茶遺傳鑒別的引物。油茶不同品種間同一位點的SSR重復(fù)次數(shù)存在差異，造成了品種間等位位點的長度多態(tài)性。根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，通過擴(kuò)增片段的電泳分離，可以分辨不同微衛(wèi)星位點的等位基因。理論上，用1個引物對1個2倍體材料進(jìn)行擴(kuò)增時，最多能檢測到2個等位基因，但從圖1中看出，每個引物產(chǎn)生的指紋圖大多超過2條譜帶，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是大多數(shù)油茶為多倍體，其倍性變異在2倍體到8倍體之間[20-22]。指紋圖上的譜帶數(shù)與油茶品種的染色體倍性有關(guān)。

在本試驗過程中，采用了聚丙烯酰胺凝膠電泳，并給出了詳細(xì)的試驗程序，利用文中的方法，降低了實際檢驗中對儀器的要求，同時減少了檢驗成本，可以在普通實驗室中推廣應(yīng)用。本文中的檢測實例，利用的是已知樣品進(jìn)行驗證性試驗。因此，通過排除法使用少數(shù)即可實現(xiàn)目標(biāo)。但送檢樣品未知時，如需確定品種的真實性，則需要進(jìn)行大樣本抽樣，通過試驗確定不同等位基因在群體中的頻率。如果有了不同微衛(wèi)星位點在群體中的等位基因頻率信息，根據(jù)不同品種在不同微衛(wèi)星位點上的等位基因頻率，就可以估算出采用多個引物進(jìn)行檢測時，2個樣本在多個位點上出現(xiàn)相同基因型的概率。這樣就可以在實際檢驗中給出品種遺傳真實性鑒定準(zhǔn)確性的概率。

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