玉米酒精糟（DDGS）中抗生素檢測的研究

■程傳民 柏 凡 李 云 魏 敏 馮 婭 王宇萍

（農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（成都）四川省飼料工作總站，四川成都610041）

中國是抗生素使用大國，也是抗生素生產(chǎn)大國，抗生素不僅能殺滅細(xì)菌而且對霉菌、支原體、衣原體等其它致病微生物也有良好的抑制和殺滅作用，但同時(shí)也引起藥物殘留、細(xì)菌耐藥性等負(fù)面問題，對動(dòng)物、人和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害。2010年美國食品藥品管理局（FDA）報(bào)導(dǎo)，46個(gè)玉米酒精糟樣本中有4個(gè)樣品檢出12種抗生素當(dāng)中的一種或多種。為了了解我國玉米酒精糟中抗生素的含量情況，對79個(gè)樣品先采用酶聯(lián)試劑盒進(jìn)行初篩，再通過液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用儀對國產(chǎn)26個(gè)和進(jìn)口24個(gè)針對6種我國常見抗生素氨芐青霉素、青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、土霉素、鏈霉素進(jìn)行了定性、定量檢測。

1 酶聯(lián)試劑盒的檢測結(jié)果

使用酶聯(lián)試劑盒，對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素族、鏈霉素和雙氫鏈霉素進(jìn)行了測定，β-內(nèi)酰胺類酶聯(lián)試劑盒（REAGEN公司）最低檢出限為1.4 μg/kg，同時(shí)可檢測：氨芐青霉素、青霉素G、羥氨芐青霉素、氯唑西林(鄰氯青霉素)、苯甲異惡唑青霉素；四環(huán)素族酶聯(lián)試劑盒（R-Biopharm公司）最低檢出限為15 μg/kg，同時(shí)可檢測：四環(huán)素、羅利環(huán)素、金霉素、地美環(huán)素、土霉素和強(qiáng)力霉素，鏈霉素和雙氫鏈霉素酶聯(lián)試劑盒（R-Bio?pharm公司）最低檢出限為5.0 μg/kg.同時(shí)可檢測：鏈霉素和雙氫鏈霉素。按照試劑盒飼料中抗生素檢測操作說明進(jìn)行了79個(gè)樣品的檢測，3種抗生素檢測率分別為：75.9%、83.5%和62.0%，檢測結(jié)果見表1。

表1 酶聯(lián)試劑盒檢測結(jié)果

2 按現(xiàn)有飼料中抗生素的方法檢測結(jié)果

根據(jù)GB/T 23385-2009飼料中氨芐青霉素的測定采用高效液相色譜法，檢出限為1.0 mg/kg。GB/T 22259-2008飼料中土霉素的測定采用高效液相色譜法，檢出限為0.5 mg/kg。DB13/T 1384.3-2011飼料中鏈霉素的測定，檢出限為0.02 mg/kg。對國產(chǎn)26個(gè)和進(jìn)口24個(gè)DDGS樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果全部未檢出。上述3種方法檢出限較高，DDGS中抗生素的含量可能低于方法的檢出限，為了進(jìn)一步了解DDGS中抗生素的情況，進(jìn)行了參照畜產(chǎn)品及最新報(bào)道中抗生素的液質(zhì)方法的檢測。

3 參照畜產(chǎn)品及最新報(bào)道中抗生素的液質(zhì)方法檢測結(jié)果

3.1 β-內(nèi)酰胺類的測定，提取：稱取樣品5 g，準(zhǔn)確加入25 ml提取液（乙腈80%），振蕩后離心。凈化：C18依次經(jīng)過3 ml乙腈和5 ml水活化。取上清液10 ml過C18柱同時(shí)收集于15 ml玻璃離心管內(nèi)，擠干，于40℃下氮?dú)獯抵馏w積小于1 ml，加水定容至1 ml。過0.22 μm濾膜后，供液質(zhì)聯(lián)用儀測定。液相參考條件：色譜柱：SB C18（50×2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相：乙腈和0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫。流速：0.3 ml/min。質(zhì)譜參考條件：電噴霧離子源；正離子掃描。檢測方式；多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：350℃;干燥氣流量：13 L/min；霧化氣壓力40 psi。檢測藥物母離子定性、子離子對及碰撞誘導(dǎo)解離電壓、碰撞能量見表2。

表2 4種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

采用上述方法，對國產(chǎn)26個(gè)和進(jìn)口24個(gè)DDGS樣品進(jìn)行了β-內(nèi)酰胺類的檢測，全部樣品均未檢出氨芐青霉素、青霉素G、阿莫西林、苯唑西林，但發(fā)現(xiàn)很多單個(gè)通道峰面積很大的樣品，懷疑是β-內(nèi)酰胺類的降解產(chǎn)物。

3.2 土霉素的測定，提?。悍Q取5 g樣品，加入30 ml鹽酸溶液（0.05 M）。振蕩提取后離心。上清液備用。凈化：用甲醇和水5 ml依次活化HLB小柱。取10 ml備用液過柱，用水5 ml淋洗，加壓抽干。用甲醇3 ml洗脫。洗脫液用氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇水1 ml溶解殘余物，過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。液相參考條件：色譜柱：SB C18（50×2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相∶乙腈和0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫。流速：0.3 ml/min。質(zhì)譜參考條件：電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：350℃;干燥氣流量：13 L/min；霧化氣壓力40 psi。檢測藥物母離子、子離子對及碰撞誘導(dǎo)解離電壓、碰撞能量見表3。

表3 土霉素的質(zhì)譜參數(shù)

采用上述方法，對國產(chǎn)26個(gè)和進(jìn)口24個(gè)DDGS樣品進(jìn)行了土霉素的檢測，全部樣品均未檢出土霉素。也未發(fā)現(xiàn)單個(gè)通道中有峰面積較大的色譜峰出現(xiàn)。在酶聯(lián)檢測四環(huán)素族的檢測率較高的情況下，懷疑含有其他四環(huán)素族的抗生素。

3.3 鏈霉素的測定，提取：稱取5 g樣品，加入10 mM磷酸二氫鉀緩沖溶液（含0.4 mM EDTA和2%三氯乙酸）20 ml。振蕩提取后離心。取上清液10 ml調(diào)其pH值至7.5～8.0備用。凈化：用甲醇和水5 ml依次活化CBX小柱，取全部備用液過柱，用水5 ml淋洗，加壓抽干。用10%乙酸甲醇溶液3 ml洗脫。洗脫液用氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相1 ml溶解殘余物，過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。液相參考條件：色譜柱：正相色譜柱SiL。流動(dòng)相：乙腈和0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫。流速：0.3 ml/min。質(zhì)譜參考條件：電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測。干燥氣溫度：350℃;干燥氣流量：13 L/min；霧化氣壓力40 psi。檢測藥物母離子、子離子對及碰撞誘導(dǎo)解離電壓、碰撞能量見表4。

表4 鏈霉素的質(zhì)譜參數(shù)

采用上述方法，對國產(chǎn)26個(gè)和進(jìn)口24個(gè)DDGS樣品進(jìn)行了鏈霉素的檢測，全部樣品均未檢出鏈霉素。也未發(fā)現(xiàn)單個(gè)通道中有峰面積較大的色譜峰出現(xiàn)。在酶聯(lián)檢測鏈霉素的檢測率較高的情況下，懷疑含有其他氨基糖苷類的抗生素。

4 結(jié)論

DDGS中3類抗生素的酶聯(lián)試劑盒檢出率均較高，使用現(xiàn)有的儀器方法沒有檢測出DDGS中含有氨芐青霉素、青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、土霉素、鏈霉素。由檢測方法等原因本研究對其他抗生素沒有進(jìn)行儀器檢測。是否含有其它抗生素有待進(jìn)一步研究。

建議，我國能給出在DDGS發(fā)酵過程中可以用的抗生素的種類范圍、使用限量以及使用規(guī)范。在美國，僅僅批準(zhǔn)了維吉尼亞霉素作為DDGS生產(chǎn)中可用的輔助劑，而且給出了0.5 mg/kg的添加限量。建立DDGS中抗生素的多組分檢測，可以快速的檢測出DDGS中的抗生素。

（參考文獻(xiàn)12篇，刊略，需者可函索）