水產(chǎn)養(yǎng)殖中多糖的非特異性免疫研究

■ 叢方地 王慶奎 周文禮 邢克智

（天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津300384）

1 水產(chǎn)養(yǎng)殖中的免疫多糖

來自于動(dòng)物、植物和微生物的一些多糖及結(jié)合多糖可顯著提高水產(chǎn)幼苗的成活率，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的健康生長，增強(qiáng)它們的抗病能力，而且生產(chǎn)成本低廉、綠色安全，非常有利于精益化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。因此，多糖的研究在國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中受到高度重視。由于多糖的多種生理功能主要源于其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫作用，所以研究工作集中在免疫多糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用及作用機(jī)理[2]。日本、美國、德國、俄羅斯等國對(duì)于免疫多糖的研究仍處于領(lǐng)先地位，我國主要對(duì)中草藥多糖的非特異免疫進(jìn)行了研究[3]，并且在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究較多[4]。這是因?yàn)槲覈兄凭玫闹胁菟帒?yīng)用和研究歷史，這為提取多糖、研究多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生理作用提供了得天獨(dú)厚的條件[5]。盡管國內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中免疫多糖的研究已有一定的基礎(chǔ)，但是研究范圍和深度，如多糖質(zhì)量控制和作用機(jī)理等“瓶頸”問題，仍需繼續(xù)探索[6]。為此，我們分析了免疫多糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中的研究現(xiàn)狀，展望了多糖非特異性免疫機(jī)理研究的趨勢(shì)，希望對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖科學(xué)的健康發(fā)展有所裨益。

2 多糖的非特異性免疫特性研究

多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生理作用，主要體現(xiàn)在其誘導(dǎo)增加機(jī)體的免疫因子數(shù)量和活力上[7]。飼喂適量香菇多糖可顯著提高羅非魚的非特異性免疫能力[8]，黃芪多糖可明顯提高異育銀鯽血清中溶菌酶和超氧化物歧化酶活性[9]。口服實(shí)驗(yàn)證明，海藻硫酸多糖和殼聚糖能有效改善刺參體內(nèi)氧化酶和水解酶系統(tǒng)[10]，黑鯛腸道菌株產(chǎn)胞外多糖能使黑鯛血液的紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量和血紅素濃度、淋巴細(xì)胞比率均有顯著升高[11]。經(jīng)注射實(shí)驗(yàn)，黃芪多糖可使刺參體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶活性及補(bǔ)體C3含量均有顯著增高[12]，殼聚糖、酵母多糖、牛蒡寡糖等也能顯著提高刺參體腔液中超氧化物歧化酶和溶菌酶活性[13]，滸苔多糖可顯著提高扇貝體內(nèi)超氧化物歧化酶和溶菌酶活性[14]。通過飼喂或體腔注射，當(dāng)歸多糖能顯著促進(jìn)石斑魚頭腎白細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)石斑魚對(duì)愛德華菌的抵抗能力[15]；云芝蛋白多糖能激活羅非魚頭腎巨噬細(xì)胞，顯著增強(qiáng)其抵抗愛德華菌的能力[16]。采用浸潤或注射，酵母細(xì)胞壁多糖能明顯提高羅氏沼蝦重要臟器組織中超氧化物酶、酸性磷酸化酶、多酚氧化酶等的活性[17]。通過離體培養(yǎng)，黃芪多糖和香菇多糖對(duì)鯉魚免疫細(xì)胞有明顯誘導(dǎo)激活作用[18]。這些研究中，在有效的劑量范圍內(nèi)，均需要一定的免疫激活時(shí)間，并且激活后能保持一定的有效期，這正是非特異性免疫的特征。但多糖使用方式、激活時(shí)間和有效激活量各有差異，因此多糖的非特異性免疫激活研究尚需要進(jìn)一步的細(xì)化和比較，將經(jīng)驗(yàn)性的資料轉(zhuǎn)化為規(guī)律性的科學(xué)理論。

3 多糖非特異性免疫作用途徑

多糖非特異性免疫機(jī)理的深入研究在于發(fā)現(xiàn)多糖在分子水平上的非特異性免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，研究細(xì)胞因子的激活途徑和多糖與受體的作用[19]。在飼喂實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)脂多糖引起錦鯉頭腎細(xì)胞中白介素IL-1β和腫瘤壞死因子TNF-α的mRNA的表達(dá)，相應(yīng)地引起頭腎巨噬細(xì)胞活性和血清溶菌酶殺菌能力的增強(qiáng)[20]。體外實(shí)驗(yàn)也表明，香菇和黃芪多糖作用頭腎巨噬細(xì)胞后，都能顯著增強(qiáng)IL-1β的體外誘導(dǎo)表達(dá)，從而顯著促進(jìn)鯉外周血淋巴細(xì)胞的增殖[21]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，添加在魚飼料中的大分子量堿溶性根枝藻多糖，能夠通過細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)鼠源巨噬細(xì)胞（J774A.1）內(nèi)白介素IL-1基因的表達(dá)[22]；凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞的蛋白激酶抑制劑研究進(jìn)而反證了脂多糖通過蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)非特異性細(xì)胞免疫的激活[23]。而這種細(xì)胞內(nèi)免疫激活傳導(dǎo)信號(hào)源于多糖與其細(xì)胞受體的結(jié)合，部分魚類的甘露糖受體全長或部分序列已經(jīng)被克隆出來[24]，櫛孔扇貝的脂多糖鐘樣受體信號(hào)通路的關(guān)鍵成分與功能已經(jīng)被系統(tǒng)地研究，發(fā)現(xiàn)了該受體所依賴的特定接頭分子[25]。但是，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中多糖非特異性免疫作用途徑的研究還非常有限，需要繼續(xù)研究多糖受體通路及細(xì)胞內(nèi)免疫信號(hào)傳導(dǎo)途徑的多樣性，這對(duì)于闡明多糖的生理機(jī)制具有重要而深遠(yuǎn)的科學(xué)意義。

4 多糖非特異性免疫影響因素

多糖種類、劑量、作用對(duì)象與條件等都影響多糖非特異性免疫作用。如，赤芝、灰樹花、香菇的胞內(nèi)多糖，通過注射和飼喂實(shí)驗(yàn)，都能顯著提高日本沼蝦的巨噬細(xì)胞活力和免疫相關(guān)酶活力，但其中以灰樹花多糖的效果最好；并且發(fā)現(xiàn)，體長4.0～4.5 cm的蝦，每只注射6 μl濃度為l%的多糖溶液為宜；而且給對(duì)蝦注射時(shí)，其抗菌酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶等活力的提高更顯著[26]。在腹腔注射史氏鱘的研究中，殼聚糖相對(duì)于水蘇糖、酵母聚糖和米糠脂多糖，能更有效地提高血液中淋巴細(xì)胞α-醋酸萘酯酶和溶菌酶活性[27]。在中華鱉餌料中添加酵母細(xì)胞壁多糖時(shí)，以每千克鱉重1 g左右為宜，如超過1.5 g時(shí)，反而對(duì)中華鱉的免疫刺激作用會(huì)逐漸降低[28]；又如，在銀鯽飼料中添加過量云芝多糖時(shí)，銀鯽白細(xì)胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、血清超氧化物歧化酶活性和補(bǔ)體C3、C4的含量反而低于對(duì)照組[29]。酸堿條件也會(huì)影響多糖的作用，在堿性條件下（pH值10），酵母多糖可使刺參腸道內(nèi)噬菌指數(shù)、溶菌酶活性、酸性磷脂酶活性增加，而噬菌率與堿性磷脂酶的活性無明顯改變；在酸性條件下（pH值5.5），刺參腸道內(nèi)噬菌指數(shù)變化不明顯，而溶菌酶、酸性磷脂酶及堿性磷脂酶活性增加[30]。多糖非特異性免疫的影響因素反映了多糖作用的復(fù)雜性，同時(shí)也暗示今后還要在多糖的理想用量、復(fù)合使用和使用條件等方面做更廣泛的研究，這也是對(duì)多糖非特異免疫機(jī)理研究的重要內(nèi)容之一。

5 多糖非特異性免疫的廣譜性

除了常見的愛德華菌[15]，免疫多糖能有效提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)其他多種致病菌的非特異性免疫能力。如，蘆薈多糖能刺激花鱸、石斑魚、紅鰭笛鯛、卵圓鯧鲹及美國紅魚產(chǎn)生對(duì)S.iniae海水株HD-1攻毒菌的非特異性免疫應(yīng)答，分析發(fā)現(xiàn)動(dòng)物血清溶菌酶含量明顯提高[31]。點(diǎn)狀念珠藻胞外多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有比較明顯的抑制效果[32]。投喂鯽魚灰樹花多糖藥餌，其離體白細(xì)胞吞噬活性，吞噬細(xì)胞殺滅腸形點(diǎn)狀氣單胞菌、鰻弧菌、金黃色葡萄球菌活性都有顯著提高[33]。甘草多糖對(duì)嗜水氣單細(xì)胞菌等6種常見水生動(dòng)物致病菌的抑殺效果良好[34]。此外，多糖還具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒及促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長、提高肌肉品質(zhì)、改善腸道功能、調(diào)節(jié)微生物種群等多種功效[35]。并有采用免疫多糖有效提高南美白對(duì)蝦的抗病力、防治南美白對(duì)蝦紅體綜合癥的成功實(shí)驗(yàn)實(shí)例[36]。這些研究表明，多糖的非特異免疫是廣譜性的，其研究空間廣大。更多的研究可以從多角度對(duì)多糖的非特異免疫機(jī)理進(jìn)行探索，有助于更充分地闡明多糖的生理機(jī)制。

6 多糖非特異性免疫相關(guān)研究

多糖非特異性免疫相關(guān)研究主要在于促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長的研究。如，除了能夠提高水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫能力，飼喂黃芪多糖可以顯著地促進(jìn)齊口裂腹魚的生長[37]和改善異育銀鯽的肌肉品質(zhì)[38]；云芝多糖可使羅非魚增重率和特定生長率顯著增高[39]；酵母多糖可顯著影響黃河鯉的生長[40]；殼多糖能抑制氣單胞菌繁殖，提高蝦苗的成活率，促進(jìn)蝦苗生長[41]；水果膠質(zhì)多糖能穩(wěn)定飼料性質(zhì)，并促進(jìn)小龍蝦的增長[42]。進(jìn)而，多糖促生長的機(jī)理研究也受到了應(yīng)有的重視，在飼喂裙帶菜鹽藻依多糖的研究中發(fā)現(xiàn)，澳洲肺魚幼魚體長、體重和肌肉纖維生長都極顯著地增加，其原因在于該多糖對(duì)肌肉生長限制因子有親合并失活作用[43]；研究還發(fā)現(xiàn)香菇多糖能有效改善幼建鯉腸道菌群數(shù)量[44]，酵母多糖可使河鯰腸道的褶皺程度、肌肉層厚度和杯狀細(xì)胞數(shù)量增加[45]，這些生理變化都有助于動(dòng)物生長。此外，多糖還具有促進(jìn)免疫器官發(fā)育、減少腸道病原菌數(shù)量、促進(jìn)有益菌繁殖、提高抗應(yīng)激能力、防治疫病及增強(qiáng)動(dòng)物抵抗寄生蟲能力等功效[46]，如，混配多糖可有效改善肝功能[47]，黃芪多糖可誘導(dǎo)吉富羅非魚熱應(yīng)激蛋白基因表達(dá)，提高抗應(yīng)激能力[48]；海參體壁硫酸多糖甚至可以影響神經(jīng)干細(xì)胞的遷移和分化[49]，濕冷黃桿菌多糖蛋白可用于開發(fā)疫苗，治療細(xì)菌冷水病和虹鱒魚魚苗綜合癥[50]。上述生理變化是在多糖作出非特異免疫應(yīng)答時(shí)所表現(xiàn)出來的相關(guān)效果，也是非特異性免疫的重要特性之一。當(dāng)前主要局限于對(duì)其相關(guān)作用效果進(jìn)行研究，對(duì)其生理機(jī)制還需要進(jìn)行深入探索，以助于揭示多糖非特異性免疫的作用機(jī)理。

7 非特異性免疫與多糖結(jié)構(gòu)

盡管對(duì)免疫多糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用與機(jī)理研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但對(duì)多糖、肽聚糖和脂多糖的非特異性增強(qiáng)效應(yīng)在分子水平上的免疫機(jī)理還不夠明確[51]。為此，國內(nèi)外都非常重視多糖分子結(jié)構(gòu)與其非特異性免疫之間的構(gòu)效關(guān)系研究，所以多糖的純化和結(jié)構(gòu)分析成為了對(duì)多糖非特異免疫研究的關(guān)鍵工作之一。人們通過纖維素柱層析[52]、凝膠柱層析[53]、復(fù)合酶法[3]及溫酚法[54]等方法純化了多糖并分離了多糖的亞組分，研究了組分的總糖含量、單糖種類與比例及相應(yīng)的免疫相關(guān)性等。如，研究發(fā)現(xiàn)酵母多糖的活性與其含有較多的甘露糖相關(guān)[55]，當(dāng)歸多糖中β-吡喃環(huán)單糖殘基是其生物學(xué)活性的基礎(chǔ)[52]，分子量較大、堿溶性的根枝藻多糖組分的非特異免疫效果更好[22]，在多糖免疫鯉魚的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)帶有1～6糖苷鍵連接分支的多糖具有更好的非特異性免疫效果[4]。但是，由于單糖組成、構(gòu)型、糖苷鍵、螺旋構(gòu)象和分支情況、主鏈連接方式、分子量大小及取代基團(tuán)的性質(zhì)和取代度等諸多結(jié)構(gòu)因素都會(huì)影響多糖的免疫活性[56]，因此還需繼續(xù)深入、細(xì)致地進(jìn)行多糖構(gòu)效關(guān)系的研究工作。多糖非特異免疫構(gòu)效關(guān)系的研究，對(duì)于設(shè)計(jì)和選擇免疫多糖分子是非常關(guān)鍵的，其相關(guān)研究工作也是非常有挑戰(zhàn)性的，在將來的研究中將是免疫多糖的前沿和熱點(diǎn)。

8 免疫多糖研究的發(fā)展趨勢(shì)

綜上所述，免疫多糖資源豐富、種類繁多、綠色安全而又具有優(yōu)異的非特異性免疫活性，決定免疫多糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用前景非常廣闊。就當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖中多糖的研究現(xiàn)狀來看，關(guān)于多糖作用的效果、途徑、影響因素、廣譜性、相關(guān)性和構(gòu)效關(guān)系研究等都是多糖非特異免疫研究的重要組成部分，受到了應(yīng)有的重視并已取得了一定的研究進(jìn)展。為探明多糖的非特異性免疫機(jī)理、科學(xué)有效地開發(fā)和使用多糖免疫增強(qiáng)劑仍需繼續(xù)做好一些關(guān)鍵性的工作。①多糖的分離純化：純化多糖是研究單糖鏈接次序、多糖空間構(gòu)象和活性機(jī)理的前提，但多糖通常與眾多類似物混存于生物組織中，難以純化，所以采用新方法分離純化多糖是多糖免疫機(jī)理研究的基礎(chǔ)。②多糖與受體之間的作用：在多糖非特異性免疫機(jī)理研究中，由于受體的多樣性及模式識(shí)別的復(fù)雜性，需要選擇有代表性的研究對(duì)象，探明多糖與受體之間的分子識(shí)別機(jī)制，這是多糖免疫機(jī)理研究的核心。③多糖的選擇性制備和活性研究：多糖的選擇性制備，如發(fā)酵制備多糖[57]，可以得到相對(duì)純凈的多糖，有利于設(shè)計(jì)和簡(jiǎn)化研究，有利于多糖核心工作的研究。④多糖作用的影響因子研究：雖然多糖的使用方式、使用量、使用時(shí)段、生效時(shí)間及酸堿環(huán)境等已有了相應(yīng)的研究，但還缺乏系統(tǒng)化和規(guī)律化的研究資料，這些資料是多糖作用機(jī)理的外在體現(xiàn)，也是充分發(fā)揮多糖生理作用和科學(xué)使用多糖的重要保障。⑤多糖的非特異免疫相關(guān)性研究：多糖的促生長、改善組織器官功能等研究是多糖非特異免疫研究的重要組成部分，對(duì)于全面揭示多糖的非特異免疫作用機(jī)理是必不可少的，也是健康水產(chǎn)養(yǎng)殖所必需的研究內(nèi)容。