豆粕提取復(fù)合物對(duì)肉仔雞腸道微生物菌群的影響

■馬云洪 祁宏偉

（1.梨樹縣畜牧獸醫(yī)培訓(xùn)中心，吉林梨樹 136500；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林公主嶺 136100）

動(dòng)物腸道的菌群能夠影響食物的消化能力、抵御感染和自體免疫，任何原因引起的腸道有益菌數(shù)量減少有害菌數(shù)量增加，都會(huì)打破腸道微生態(tài)平衡，進(jìn)而阻礙動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收，影響動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能的發(fā)揮。

本試驗(yàn)探討不同添加水平的豆粕提取復(fù)合物對(duì)肉仔雞腸道菌群的影響，及其促進(jìn)肉仔雞消化代謝的機(jī)理，為豆粕提取復(fù)合物對(duì)肉仔雞腸道機(jī)能作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇健康狀況良好的1日齡Avian肉仔雞600只，按照公母各半的原則隨機(jī)分為5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30只。其中1組為對(duì)照組，只飼喂基礎(chǔ)日糧，不添加抗生素添加劑。試驗(yàn)組分為4個(gè)組，分別為250 mg/kg處理組：基礎(chǔ)日糧＋豆粕提取復(fù)合物250 mg/kg；500 mg/kg處理組：基礎(chǔ)日糧＋豆粕提取復(fù)合物500 mg/kg；750 mg/kg處理組：基礎(chǔ)日糧＋豆粕提取復(fù)合物750 mg/kg；1 000 mg/kg處理組：基礎(chǔ)日糧＋豆粕提取復(fù)合物1000 mg/kg。試驗(yàn)期為49 d，分為前、后兩期，前期0～21 d，后期22～49 d。

1.2 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧

基礎(chǔ)日糧按照肉雞生長(zhǎng)發(fā)育階段營(yíng)養(yǎng)需要自行配制?；A(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平詳見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

在試驗(yàn)前，首先對(duì)雞舍進(jìn)行徹底清潔和消毒，在試驗(yàn)期內(nèi)對(duì)雞舍每7 d消毒兩次。前期0～21日齡肉仔雞采用籠養(yǎng)方式，后期22～49日齡采用地上平養(yǎng)飼養(yǎng)方式。試驗(yàn)期間，對(duì)雞舍的溫度和濕度進(jìn)行人工控制，保持良好通風(fēng)換氣，自由飲水和采食，按肉雞標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)管理進(jìn)行。對(duì)肉仔雞進(jìn)行常規(guī)免疫，首先在7日齡時(shí)以滴鼻的方式接種雞新城疫Ⅱ系弱毒苗；10日齡和24日齡時(shí)以飲水的方式接種傳染性法氏囊疫苗；35日齡時(shí)，以飲水的方式對(duì)雞新城疫Ⅱ系毒苗進(jìn)行補(bǔ)劑。整個(gè)試驗(yàn)期間均不使用其他抗生素藥物。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 樣品的采集

試驗(yàn)雞21日齡時(shí)，每處理組任意選擇4羽，進(jìn)行屠宰，對(duì)盲腸兩端進(jìn)行結(jié)扎，放入容器中，速凍-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 盲腸微生物菌群的測(cè)定

稱取盲腸的內(nèi)容物0.5 g，加入到4.5 ml生理鹽水的試管中，混勻，作為10-1稀釋液，然后進(jìn)行梯度稀釋，直至10-8。將10-3～10-5三個(gè)稀釋度分別吸取100 μl接種與相應(yīng)的大腸桿菌的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)；將10-4～10-6三個(gè)稀釋度分別吸取100 μl接種與相應(yīng)的乳酸桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)；將10-6～10-8三個(gè)稀釋度分別吸取100 μl接種與相應(yīng)的雙歧桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.4.3 培養(yǎng)基的制備

大腸桿菌培養(yǎng)基：伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)）；乳酸桿菌培養(yǎng)基(LBS)：蛋白陳10.0 g、酵母浸膏5.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、檸檬酸銨2.0 g、硫酸鎂 0.3 g、硫酸錳 0.25 g、吐溫-80 1.0 ml、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 L。配好后加熱融化，調(diào)pH值至5.4，高壓蒸汽滅菌115℃，30 min；雙歧桿菌桿菌培養(yǎng)基（BS）：胰胨8.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母浸膏5.0 g、肝湯150 ml、葡萄糖10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、吐溫-80 1.0 ml、可溶性淀粉0.5 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水765 ml、10%的KH2PO4溶液 10 ml、A 溶液 5 ml：FeSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 10 g、MnSO40.337 g、蒸餾水250 ml。加熱溶解后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2，高壓滅菌121℃，30 min，冷卻至50℃左右時(shí)，加入L-半胱氨酸0.5 g，傾注無菌平皿，備用。

接種和計(jì)數(shù)：樣品接種時(shí)，每個(gè)稀釋度兩個(gè)平行，乳酸菌和雙歧桿菌在37℃培養(yǎng)48 h；大腸桿菌接種培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)基計(jì)數(shù)：對(duì)平皿的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后以每克盲腸內(nèi)容物的菌落數(shù)lg菌數(shù)/g表示，其具體計(jì)算公式如下：每克盲腸內(nèi)容物菌落數(shù)=lg菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×每次稀釋取樣毫克數(shù)/接種用樣品毫克數(shù)×樣品克數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用spss12.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA過程對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。

2 結(jié)果與分析

豆粕提取復(fù)合物對(duì)肉仔雞腸道微生物菌群的影響結(jié)果見表2。

表2 豆粕提取復(fù)合物對(duì)肉仔雞腸道微生物菌群的影響（lgcfu/g）

由表2可見，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組盲腸內(nèi)大腸桿菌含量均呈明顯降低（P＜0.05），隨著添加水平的增加，腸道大腸桿菌數(shù)量呈降低趨勢(shì)，但是差異不顯著(P＞0.05)；腸道乳酸菌，各試驗(yàn)組含量都有不同程度的增加，250 mg/kg組較對(duì)照組有微量的增加，但是差異不顯著(P＞0.05)，其它3組與對(duì)照組數(shù)據(jù)比較差異顯著（P＜0.05），其中以750 mg/kg組含量最高，比對(duì)照組提高了8.51%；腸道雙歧桿菌，試驗(yàn)各組的含菌量隨著豆粕提取復(fù)合物添加水平增加而呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，與對(duì)照組比較均差異顯著（P＜0.05）。相關(guān)分析表明，雙歧桿菌含量y與豆粕提取復(fù)合物添加量x呈線性相關(guān)關(guān)系，線性回歸方程為：y=0.101x+8.275，r=0.916 4。

3 討論

腸道菌群是動(dòng)物體內(nèi)最大的微生態(tài)系統(tǒng)，畜禽的腸道中存在10-14個(gè)細(xì)菌，超過有500多種細(xì)菌定植在腸道。根據(jù)微生物和動(dòng)物體的作用可以分為三類，第一類是共生性細(xì)菌，主要是轉(zhuǎn)型厭氧，這些微生物主要是乳酸菌、雙歧桿菌等；第二類是共棲的條件致病，在機(jī)體正常情況下，這類條件致病菌由于機(jī)體的對(duì)各種細(xì)菌的平衡作用其不具有致病能力，但是，當(dāng)宿主的免疫力低下等因素時(shí)，這些條件致病菌就致??；第三類是病原菌。病原菌在動(dòng)物體處于細(xì)菌等微生態(tài)平時(shí)，病菌并不能導(dǎo)致宿主患??；當(dāng)宿主的機(jī)體免疫能力下降，這些病原菌開始大量繁殖，一起患者致病。大腸桿菌為革蘭氏陰性腸道桿菌，一般情況下沒有致病性，當(dāng)宿主的腸道免疫力降低或者大腸桿菌的位置發(fā)生遷移的時(shí)候就會(huì)成為致病菌。

在正常的動(dòng)物體內(nèi)，腸道正常菌群能夠形成菌膜，能夠抑制病原菌的生長(zhǎng)。乳酸桿菌為革蘭氏陽性菌，是腸道中的正常菌群，其形態(tài)變化多樣，桿狀、短棒狀等，一般情況下鏡檢為鏈狀。其無芽孢，無鞭毛，高度耐酸。對(duì)維持腸道的正常菌群有重要的作用，乳酸桿菌還可以產(chǎn)生天然的抗生素，對(duì)腸道致病菌有明顯的抑制和殺滅作用。并與有害微生物在腸道空間競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，可以抑制有害微生物的生長(zhǎng)例如遷移的大腸桿菌、沙門氏菌等等，乳酸菌主要是通過產(chǎn)生乳酸等類抗生素作用的物質(zhì)，能夠降低腸道的pH值，維持酸性環(huán)境，抑制有害微生物。乳酸桿菌不僅對(duì)致病菌有拮抗作用，而且能黏附于腸道細(xì)胞上，起到占位性保護(hù)作用，同時(shí)乳酸桿菌還可產(chǎn)生非特異性免疫調(diào)節(jié)因子，刺激腸道局部免疫反應(yīng)。雙歧桿菌屬于革蘭氏陽性菌，菌體形態(tài)多變，但是具有典型的分叉狀形態(tài)，無芽孢，無莢膜，無鞭毛，是在機(jī)體中存在時(shí)間較長(zhǎng)的重要生理性細(xì)菌，黏附于上皮后，定植形成穩(wěn)定的膜菌群即生物屏障，發(fā)揮重要的生理作用。能夠通過降低腸道pH值或通過雙歧桿菌對(duì)不利菌在空間、營(yíng)養(yǎng)上的屏蔽競(jìng)爭(zhēng)作用，來抑制有害菌在腸道中的定植和生長(zhǎng)?？梢蕴岣邫C(jī)體的抗體水平，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬和消化能力，提高機(jī)體抗感染力，對(duì)動(dòng)物體的生長(zhǎng)發(fā)育、物質(zhì)代謝有明顯的改善作用。

4 小結(jié)

本研究中發(fā)現(xiàn)，豆粕提取復(fù)合物可以顯著抑制或者減少腸道中大腸桿菌的數(shù)量，增加雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量。由于乳酸桿菌和雙歧桿菌代謝作用產(chǎn)酸，使腸道的環(huán)境處于一個(gè)酸性環(huán)境中，可以抑制大腸桿菌等病原菌。豆粕提取物中的大豆多肽富含生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)雙歧桿菌發(fā)酵，乳酸菌和其他微生物菌種增殖。豆粕提取復(fù)合物中的大豆低聚糖可以明顯的提高雙歧桿菌的生理活性和數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)細(xì)菌菌群的數(shù)量，抑制病原菌的繁殖，提高腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收能力。