EGCG對疲勞運動大鼠學習記憶及NMDA受體NR1亞單位表達的影響*

黃誠胤，潘建華，李國泰

（重慶大學 體育學院，重慶400044）

疲勞對大腦功能的影響是神經(jīng)科學領域研究的熱點。目前大量研究證實，當人或動物處于疲勞狀態(tài)時，其大腦學習、記憶功能可受到明顯的影響［1，2］。研究表明茶葉中含有的兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫活性等作用［3，4］。同時 EGCG還是重要的天然抗氧化劑，它能透過血腦屏障，保護神經(jīng)細胞免受運動后代謝產(chǎn)物的影響，具有改善疲勞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響的作用。本實驗通過建立游泳運動訓練的疲勞動物模型，采用Morris水迷宮實驗和對新事物識別實驗，探索EGCG對疲勞大鼠的空間學習能力與新事物探究能力的影響；采用PCR和Western blot分析了正常組、疲勞組及EGCG防護組，大鼠海馬NMDA受體中NR1mRNA基因轉錄水平及蛋白水平的表達情況，探討了EGCG對海馬NMDA受體表達水平的影響以及與空間學習能力和新事物探究能力之間的關系，為日后研究EGCG改善大鼠對新事物探究能力和空間學習能力的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物建模及分組

1.1.1 動物飼養(yǎng) 本實驗選取45只，SPF級健康SD雄性大鼠，體重（160±20）g左右，動物由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（渝）2007-0003）。實驗大鼠隨機分為3組（n＝15），4～5只／籠飼養(yǎng)。

1.1.2 動物分組及模型建立 實驗分為正常對照組（A組）不施加游泳運動訓練，飼養(yǎng)條件與疲勞模型組（B組）和EGCG防護組（C組）相同。動物適應性喂養(yǎng)一周后，對疲勞模型組（B組）和EGCG防護組（C組）動物進行3 d適應性游泳訓練，每天1次，每次20 min。游泳訓練在直徑120 cm，寬50 cm，水深30 cm的容器中進行，水溫（25±2）℃。疲勞模型采用無負重的游泳方式建立，當動物游至從身體輕度下沉，水淹到耳上、過眼、鼻尖，身體下沉無力，到連續(xù)3次沒入水底，每次超過10 s視為力竭。出水后呼吸幅度深急、反應遲鈍、俯臥或端坐，被握持時，四肢下垂。第一周每日游泳至力竭1次，第二周每日游泳至力竭2次，次間隔≥3 h［5］。EGCG保護組（C組）訓練方案與疲勞模型組（B組）相同。

1.2 實驗方法

1.2.1 給藥方法 EGCG防護組（C組）按 EGCG 50 mg／（kg·d）容量灌胃，疲勞模型組（B組）與正常對照組（A組）按1 ml／（kg·d）生理鹽水灌胃。每日在大鼠游泳后30 min給藥，持續(xù)兩周。

1.2.2 通過探索偏向實驗新事物識別模型［6］讓SD大鼠在長方形木箱（105 cm×75cm×30 cm）中適應性飼養(yǎng)2～3 d。在箱內(nèi)兩側各放置一個物體，并記錄下大鼠分別在不同物體上停留的時間。實驗第1天，將大鼠熟悉的物體位置顛換，記錄大鼠在新位置物體上停留時間及占總時間的比例，目的是將其結果作為判斷大鼠對新事物探究能力的指標。

1.2.3 學習記憶功能的觀察 Morris水迷宮直徑120 cm，水深30 cm，平臺高25 cm，平臺直徑10 cm；水溫（25±2）℃，水中加入適量奶粉使水渾濁。將平臺置于迷宮某一象限對角線中點處，在整個訓練過程中平臺位置保持不變。將大鼠依次從4個象限面向池壁放入池中，每次訓練搜索時間60 s，大鼠找到平臺后使之在平臺上停留20 s，若未能在60 s找到平臺則引導其爬上平臺并停留20 s。每只大鼠每天連續(xù)接受8次定位航行實驗訓練，連續(xù)訓練3 d。水迷宮訓練結束后B組和C組動物開始接受兩周疲勞訓練。疲勞訓練結束后24 h內(nèi)，重復進行8次定向航行實驗。在此期間正常對照組（A組）動物不接受任何處理，與疲勞模型組（B組）和EGCG防護組（C組）動物同步進行定向航行實驗［7］。

1.2.4 標本的采集 采樣前SD大鼠禁食12 h，采用腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉（50 mg／kg體重）麻醉，心臟采血后，采血后立即取出腦組織，分離出海馬，并用滅菌錫泊紙包裹后迅速儲于液氮中。血樣標本于室溫靜置2 h后，分離血清（3 000 r／min，離心 10 min），提取上清液與 1.5 ml EP管中分裝標記，放置-70℃冰箱中保存。

1.2.5 PCR測定海馬組織中NMDA受體NR1亞單位表達稱取100 g海馬組織，提取總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性。采用TakaRa公司反轉錄試劑盒將 RNA逆轉錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)Genbank發(fā)布的NR1 cDNA基因序列設計引物，上游引物序列 Sense：5’-AAG GAG TGG AACGGA ATCAT-3’，下游引物序列 Anti-sense：5’-ACT TGA AGGGCT TGG AGA AC-3’，目的片段為 269 bp。內(nèi)參基因GADPH片段大小為450 bp。擴增條件為：95℃預變性15 s；95℃變性10 s；54℃退火 20 s；68℃延伸30 s，共40個循環(huán)。1.2.6 海馬組織中NMDA受體蛋白的表達 準確稱取10 g海馬組織，加入含PMSF的裂解液（按照1 ml裂解液加入10 μl PMSF），冰上靜置30 min，用勻漿器研磨組織，整個過程需在冰上操作。收集研磨的組織懸液于1.5 ml EP管中離心5 min（12 000 r／min，4℃）后小心吸取上清液。采用 BCA試劑盒（BCA proteinassay reagent kit，美國 Pierce）進行蛋白測定定量。將所需蛋白樣品加入的5×SDS蛋白上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中加熱5～8 min，進行蛋白變性。以每孔上樣量均為20μg總蛋白上樣后，進行SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離的蛋白條帶轉移至PVDF膜上。轉膜后用TBST緩沖液清洗2遍，加入封閉液37℃放置1 h。再分別加入單克隆抗體 anti—NR1（1∶100）和內(nèi)參 anti—GADPH（1∶500），放置于4℃冰箱孵育過夜；以TBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗（1∶5 000），37℃孵育1 h后，以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。最后用ECL化學發(fā)光法顯影試劑盒，顯影，定影，室溫下晾干。將膠片進行掃描后用膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量。

1.3 試劑與器材

EGCG標準品（美國Sigma公司）；戊巴比妥鈉（成都科龍化工試劑廠）；0.01 mol／L PBS、（北京中杉金橋生物技術有限公司）；裂解液 RIPA（Radio-Immunop recip itation Assay，美國Pierce）；聚丙烯酰胺凝膠（Novex，San Diego，美國 CA）；NMDANR1及GAPDH引物合成（上海 Invitrogen公司）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；Morris水迷宮實驗系統(tǒng)：北京現(xiàn)代太極電子有限公司；PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，組間顯著性差異比較采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和T-test。

2 結果

2.1 C組疲勞大鼠對新事物探究能力顯著大于B組

探索偏向實驗反應了大鼠在新事物上停留時間占總體時間的百分比。實驗對三組動物的探索偏向數(shù)據(jù)進行組間比較，三組動物探索偏向分別為45%±4%（A組），46%±6%（B組）和43%±1%（C組），三者之間差異有顯著性。在記憶保留過程中，A組動物的探索偏向為61%±6%，C組動物為56%±4%，B組為40%±3%，C組與B組間具有顯著性差異（P＜0.01），與A組間差異無顯著性。

2.2 水迷宮實驗中C組動物尋找潛伏期顯著短于B組動物

尋找潛伏期指動物進入水迷宮到找到平臺的這段時間（用s來計算）。實驗對三組動物尋找潛伏期的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)在疲勞訓練前三組動物尋找潛伏期無顯著性差異。疲勞訓練后第2天，B組和C組動物具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Impacts of EGCGon fatigue rats through abilities of learning and memory（s，ˉx±s，n＝8）

2.3 EGCG對運動疲勞大鼠海馬組織中NMDA受體NR1亞單位表達的影響

通過PCR和Western blot測定NMDA受體NR1基因轉錄表達水平和蛋白表達水平。PCR結果分別成功擴增出了269 bp片段的 NR1基因和 450 bp片段的內(nèi)參基因 GADPH。EGCG防護組（C組）中NR1基因的表達明顯增加（圖1）。同時通過Western blot檢測到EGCG防護組（C組）中目的蛋白NR1的表達也明顯增加（圖2）。

Fig.1 RT-PCR demonstrated the presence of NR1 mRNA

Fig.2 Western blot demonstrated the presence of NR1 protein

3 討論

運動性疲勞是指在運動過程中，機體的機能或工作效率不能維持在特定的水平而出現(xiàn)運動能力和身體功能暫時下降的現(xiàn)象［8］。隨著競技體育水平日益提高，運動員在訓練過程中承受的心理壓力和運動負荷增強，出現(xiàn)運動性疲勞的幾率在逐漸增加。如果運動性疲勞不能及時得到恢復，不僅影響運動員的運動能力，同時也會影響其大腦學習記憶功能，以及在運動過程中的思維和判斷能力。

N-甲基-D-門冬氨酸（NMDA）受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一類重要的興奮性氨基酸受體，屬于離子型谷氨酸受體的一個亞型，由NR1與NR2亞單位組成。其中NMDA受體通道的必需組成組分是NR1，其表達量可以間接反應NMDA受體的總量。近年來，大量來源于生物化學、電生理和藥理學等方面多項研究證明，海馬NMDA受體與新事物探究能力和空間學習記憶有關［9］。EGCG是從綠茶中提取出的一種天然的兒茶素類物質(zhì)，它易于通過血腦屏障達到腦組織中。有相關的研究報道，EGCG在海馬學習記憶方面具有一定的功效。在快速老化鼠模型（SAMP 10）中，經(jīng)EGCG處理后可以延緩腦老化、阻止腦萎縮、防止記憶衰退等功能［10］。急性施加EGCG到海馬腦片上可使高頻誘導的LTP幅度明顯增加，而慢性喂食EGCG的大鼠或小鼠可以明顯改善學習記憶能力。

為了降低實驗操作本身引起的對動物的學習能力的影響，在這一模型中沒有任何的規(guī)則，動物受到的訓練比其他模型少。在疲勞運動訓練前，三組動物新事物探究能力無顯著性差異（數(shù)據(jù)未列出），說明三組動物對兩個物體以及它們所處的位置的選擇能力均衡。接受疲勞訓練后，A組動物在新事物上停留時間與總時間之比為61%，C組動物為56%，B組為40%，說明在記憶保留過程中，EGCG可以改善疲勞動物對新事物的選擇能力，幫助它們用較多的時間去探索新事物。海馬中NMDA受體激活在動物對新事物探究中起著十分重要的作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)NMDA依賴的突觸可塑性可能是主體對新事物探究的生物學基礎［11，12］。實驗研究中我們發(fā)現(xiàn)，疲勞訓練后B組動物海馬NR1 mRNA的表達與C組相比有顯著性差異（P＜0.05），提示EGCG可以顯著改善疲勞動物NR1 mRNA的表達，提高動物對新事物探究能力。

空間學習記憶能力體現(xiàn)動物對整體環(huán)境的記憶，而Morris水迷宮正是利用動物的求生本能來達到這一目的。實驗結果表明未接受疲勞訓練前，三組間無顯著性差異。而接受疲勞訓練后C組和B組動物與A組相比具有顯著性差異（P＜0.01），說明疲勞訓練能夠降低動物空間學習記憶能力；而B組動物尋找平臺的時間明顯長于C組動物，結果有顯著性差異（P＜0.01），提示EGCG可在一定程度上改善疲勞帶來的空間學習記憶能力減退，而EGCG可能是通過調(diào)節(jié)大腦海馬NMDA受體表達而提高疲勞動物的空間學習記憶能力。

綜上，疲勞運動可誘發(fā)大鼠Morris水迷宮中尋找潛伏期的時間增加，而通過EGCG保護后的實驗組可明顯縮短大鼠Morris水迷宮尋找潛伏期的時間，同時還可以增加海馬神經(jīng)組織中NMDA受體NR1亞單位的表達，并有效增強疲勞大鼠對新事物的探究及空間學習能力。

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