小鼠主動(dòng)脈狹窄后不同時(shí)期心室肌細(xì)胞后除極和觸發(fā)活動(dòng)的變化*

焦 宏，張 勇，王曉玲

（1.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000）

主動(dòng)脈狹窄、高血壓、瓣膜性心臟病等壓力超負(fù)荷狀態(tài)下，心肌組織學(xué)肥厚性重構(gòu)，心肌細(xì)胞電生理特征的一個(gè)重要改變是動(dòng)作電位時(shí)程（action potential duration，APD）延長(zhǎng)，APD延長(zhǎng)可因早后除極（early after depolarization，EAD）、遲后除極（delayed after depolarization，DAD）產(chǎn)生觸發(fā)活動(dòng)和／或復(fù)極化的不同步產(chǎn)生興奮折返而導(dǎo)致各種類型心律失常，成為心力衰竭最重要的原因。

本實(shí)驗(yàn)利用玻璃微電極技術(shù)，記錄主動(dòng)脈狹窄誘發(fā)的心肌肥厚動(dòng)物模型小鼠左心室乳頭肌AP、EAD、DAD和觸發(fā)活動(dòng)情況，以及通過檢測(cè)低鉀或異丙腎上腺素灌流后所誘發(fā)后除極觸發(fā)活動(dòng)的情況，探討主動(dòng)脈狹窄發(fā)展過程中小鼠心律失常可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制備［1］

雄性昆明種小鼠96只（20±2 g，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，II級(jí)），隨機(jī)選60只為模型組（model group），36只對(duì)照組（control group），腹腔注射125 mg／kg氯胺酮麻醉。于胸骨左側(cè)緣沿第二肋間隙作一3 cm橫切口，鈍性分離肌肉，打開胸腔，暴露主動(dòng)脈弓，左頸總動(dòng)脈（第一分支）和左鎖骨下動(dòng)脈（第二分支）間穿線備用，平行放置27-gauge（直徑0.4 mm）針頭，主動(dòng)脈弓及墊針一并進(jìn)行結(jié)扎，抽出針頭后使主動(dòng)脈狹窄65%～70%，即主動(dòng)脈狹窄動(dòng)物（模型組）。對(duì)照組手術(shù)同上，但不結(jié)扎主動(dòng)脈弓。隨機(jī)選用術(shù)后2周、5周、9周和13周動(dòng)物各8只進(jìn)行心臟乳頭肌細(xì)胞內(nèi)電位記錄。

1.2 玻璃微電極技術(shù)測(cè)定乳頭肌的動(dòng)作電位后除極、觸發(fā)活動(dòng)

小鼠腹腔注射125 mg／kg氯胺酮麻醉后，迅速打開胸腔，取出心臟，浸于混合氣（95%O2，5%CO2）飽和的冷Krebs-Henseleit（K-H）液，分離乳頭肌。將乳頭肌用不銹剛針固定在玻璃浴槽底部的硅膠上?；旌蠚怙柡偷?K-H液（36.0±0.5）℃恒速灌流，流速為 4 ml／min。穩(wěn)定 1 h后，給予刺激：波寬 1 ms，頻率1 Hz，電壓強(qiáng)度為閾刺激的1.5倍。微電極推進(jìn)器將尖端電阻10～30 MΩ的玻璃電極（內(nèi)充3 mol／L KCl）緩慢推進(jìn)乳頭肌細(xì)胞內(nèi)，記錄細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位（AP）及自發(fā)的后除極（包括EAD和DAD）和觸發(fā)活動(dòng)。選用狀態(tài)良好的乳頭肌細(xì)胞，低鉀（1 mmol／L KCl）或者含有異丙腎上腺素（20 nmol／L）溶液分別灌流后記錄誘發(fā)EAD，DAD以及觸發(fā)活動(dòng)情況。

1.3 溶液組成

K-H液 （mmol／L）：118 NaCl，25 NaHCO3，4.7 KCl，1.6 MgSO4，2.5 CaCl2，1.2 KH2PO4和 10 glucose（pH 7.4）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 主動(dòng)脈狹窄發(fā)展過程中小鼠乳頭肌細(xì)胞動(dòng)作電位APD90的變化

與control組比較，小鼠乳頭肌動(dòng)作電位APD90在model組2周和5周未見明顯改變，而model組9周（79.2±0.9 ms vs 61.4±0.5 ms）和 13周（108.5±0.7 ms vs 63.2±0.4 ms）出現(xiàn)明顯延長(zhǎng)（圖 1）。

2.2 主動(dòng)脈狹窄發(fā)展過程中小鼠乳頭肌自發(fā)性EAD和DAD的變化

圖2示model組13周小鼠乳頭肌自發(fā)性EAD和DAD原始圖。在記錄的30 min時(shí)間內(nèi)，model組9周和13周動(dòng)物出現(xiàn) EAD（發(fā)生率分別為：20.2%，34.3%）和 DAD（發(fā)生率分別為：15.3%，38.1%），而control組以及model組2周和5周動(dòng)物未出現(xiàn)EAD和 DAD（圖 3）。

Fig.1 Summary data for APD at 90%repolarization（APD90）in control and model mice at 2，5，9 and 13 weeks APD：Action potential duration

Fig.2 Spontaneous EADs（a）and DADs（b）in model mice at 13 week

Fig.3 Summary data for incidence of spontaneous EADs and DADs in model mice at 2，5，9 and 13 weeks EAD：Early after depolarization；DAD：Delayed after depolarization

2.3 主動(dòng)脈狹窄發(fā)展過程中小鼠乳頭肌低鉀或異丙腎上腺素觸發(fā)EAD和DAD的改變

與control組比較，model組異丙腎上腺素或低鉀誘發(fā)EAD和DAD的發(fā)生率（異丙腎上腺素：16.2%，36.2%，49.1%和 65.8%；低鉀：35.6%，54.8%，70.12%和 89.5%），顯著增高，并且 model組動(dòng)物的發(fā)生率隨著時(shí)間進(jìn)行性增加（圖4、圖5）。

Fig.4 Incidence of EADs and DADs induced by 20 nmol／L isoproterenol（Isop）in control and model mice at 2，5，9 and 13 weeks

Fig.5 Incidence of EADs and DADs induced by 1 mmol／L KCl in control and model mice at 2，5，9 and 13 weeks

3 討論

心律失常發(fā)生的原因包括沖動(dòng)產(chǎn)生異常和沖動(dòng)傳導(dǎo)異常。后除極（after depolarization）指在心肌細(xì)胞動(dòng)作電位繼0相除極后所發(fā)生的除極，其振幅較小，頻率較快，膜電位不穩(wěn)定［2］。后除極誘發(fā)的觸發(fā)活動(dòng)是異常沖動(dòng)產(chǎn)生的重要原因。一旦這種振蕩性除極引起可擴(kuò)布的動(dòng)作電位，則產(chǎn)生異常沖動(dòng)的發(fā)放，即觸發(fā)活動(dòng)（triggered activity，TA）。根據(jù)后除極發(fā)生的時(shí)間不同，分為EAD和DAD［3］。

EAD，DAD產(chǎn)生的觸發(fā)活動(dòng)與L-型鈣通道開放和鈣超載相關(guān)，EAD具有慢頻率依賴性，APD延長(zhǎng)將增加EAD的發(fā)生率。EAD產(chǎn)生的觸發(fā)活動(dòng)可易化期外收縮并加劇復(fù)極離散度（TDR），從而易于發(fā)展為折返性心律失常。近年來的研究認(rèn)為，EAD是尖端扭轉(zhuǎn)型（torsades de pointes，TdP）室性心動(dòng)過速的始動(dòng)因素，折返使 TdP得以維持［4，5］。早后除極活動(dòng)參與了許多先天性長(zhǎng) QT綜合征（如 LQT2，LQT3，LQT6）或獲得性長(zhǎng) QT綜合征（心肌肥厚，心衰，減少IKr電流藥物）相關(guān)的多樣性室性心動(dòng)過速的形成［6］。DAD具有快頻率依賴性，DAD誘發(fā)導(dǎo)致的觸發(fā)活動(dòng)通常是心動(dòng)過速型心律失常的基礎(chǔ)。后除極觸發(fā)活動(dòng)常常被缺氧、缺血、心肌梗死、洋地黃類藥物、β-腎上腺素受體激動(dòng)劑、高頻刺激、細(xì)胞外高鈣和低鉀等所誘發(fā)，觸發(fā)活動(dòng)已被公認(rèn)為心律失常的重要機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)利用傳統(tǒng)的玻璃微電極技術(shù)，觀察了主動(dòng)脈狹窄后左心室乳頭肌動(dòng)作電位APD、EAD、DAD和觸發(fā)活動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)后除極和觸發(fā)活動(dòng)的產(chǎn)生因病理階段的不同而不同。主動(dòng)脈狹窄后心肌肥厚階段乳頭肌的APD90沒有改變，同時(shí)也沒有看到自發(fā)性EAD或DAD；主動(dòng)脈狹窄后心衰階段乳頭肌的APD90明顯延長(zhǎng)，伴有大量自發(fā)性 EAD、DAD以及觸發(fā)活動(dòng)；體外灌流低鉀或者異丙腎上腺素后，可以誘發(fā)出大量的EAD、DAD以及觸發(fā)活動(dòng)，主動(dòng)脈狹窄后心衰階段的發(fā)生率明顯高于心肌肥厚階段。異丙腎上腺素作為β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，通過激活腺苷酸環(huán)化酶，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，繼而激活cAMP依賴性蛋白激酶，鈣通道或相關(guān)蛋白磷酸化而增加 Ca2＋電流［7，8］。Ca2＋內(nèi)流增加，可延長(zhǎng)心肌細(xì)胞復(fù)極時(shí)間，從而引起EAD。細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載進(jìn)而導(dǎo)致肌漿網(wǎng)自發(fā)性Ca2＋釋放增多，引起DAD。心肌肥厚、心衰時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鈣代謝異常，尤其是心衰時(shí)肌漿網(wǎng)的Ca2＋-ATP酶及RyR功能異常，導(dǎo)致舒張期鈣超負(fù)荷和收縮期鈣離子釋放不足（收縮下降），推測(cè)此時(shí)心室肌細(xì)胞 IKr，IKs，IK1，ICa-L，INaL等多種通道的異常導(dǎo)致產(chǎn)生 EAD、DAD以及觸發(fā)活動(dòng)［9，10］。

主動(dòng)脈狹窄心肌肥厚早期階段沒有記錄到自發(fā)性EAD可能是此時(shí)乳頭肌的APD90沒有明顯延長(zhǎng)的結(jié)果，自發(fā)性DAD的缺失，推測(cè)此時(shí)細(xì)胞內(nèi)沒有明顯Ca2＋超載現(xiàn)象。但是與同期的假手術(shù)組相比，主動(dòng)脈狹窄后心衰階段低鉀或者異丙腎上腺素明顯誘發(fā)出大量EAD、DAD以及觸發(fā)活動(dòng)，說明主動(dòng)脈狹窄后心肌肥厚階段仍然處于電生理的不穩(wěn)定期，該階段心律失常的發(fā)生可能存在其他機(jī)制［11，12］。

在實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)，3相EAD很多，2相EAD極少，是否因?yàn)樾∈蟮男穆屎芸欤珹PD短，沒有明顯平臺(tái)期，所以EAD主要表現(xiàn)為3相EAD。希望以后在大動(dòng)物心肌肥厚導(dǎo)致的心衰模型上繼續(xù)探討2相EAD和3相EAD在心律失常發(fā)生中的不同作用?？赡艿慕忉屖牵鲃?dòng)脈狹窄后心肌由肥厚到心衰的病理進(jìn)展中，心肌細(xì)胞EAD，DAD以及觸發(fā)活動(dòng)逐漸增多，心肌細(xì)胞的電不穩(wěn)定性逐漸增加。

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