檳榔堿對2型糖尿病大鼠肝臟胰島素抵抗的作用*

凌宏艷，姚起鑫，亓竹青，楊絲絲，何劍琴，張愷芳，胡 弼

（1.南華大學(xué)生理學(xué)教研室，2.南華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)博士后流動站，湖南衡陽421001）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，目前其發(fā)病機(jī)理尚不十分明確。以肝糖輸出過多為主要表現(xiàn)的肝臟胰島素抵抗，是T2DM發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。檳榔堿是從天然植物檳榔中提取的生物堿，研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿體外給藥能抑制口腔角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)白介素和腫瘤壞死因子的表達(dá)，下調(diào)氧化低密度脂蛋白和高糖所致血管內(nèi)皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，具有抗動脈粥樣硬化的作用［1-3］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿能改善2型糖尿病大鼠糖、脂代謝紊亂，然而其機(jī)制仍不清楚［4］。

組成型雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）與孕甾烷 X受體（pregnane X receptor，PXR）被稱為“外源物感受器”，二者主要在肝中表達(dá)，在外源性物質(zhì)及類固醇類化合物的代謝與清除過程中起著重要作用。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)CAR、PXR在調(diào)節(jié)糖、脂代謝和炎癥中發(fā)揮重要作用，或許成為肥胖和T2DM治療的靶標(biāo)［5-8］。因此，我們推測檳榔堿在整體動物模型上可能通過激活CAR或PXR，降低肝臟糖代謝相關(guān)酶和炎癥因子表達(dá)，改善肝臟胰島素抵抗。

1 材料與方法

1.1 材料

檳榔堿購自Sigma公司；D-果糖購自上海生工生物技術(shù)有限公司；豬油為市售；胰島素檢測試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；即用型PCR擴(kuò)增試劑盒購自Fermentas公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；蛋白檢測試劑盒來自上海碧云天生物公司；抗AKT、P-Akt和GLUT4抗體購于細(xì)胞信號公司。

1.2 2型糖尿?。═2DM）大鼠模型的復(fù)制及實(shí)驗(yàn)分組

清潔級雄性Wistar大鼠45只，體重（200±20）g，由本校實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供。大鼠分籠飼養(yǎng)（每籠4只），置于溫度（22士 2）℃，光照 12／24 h，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。取8只作正常對照組：普通飼料喂養(yǎng)，另37只采用高果糖高脂飼料［9］（按熱卡計(jì)算：果糖占75%，脂肪占12%，蛋白質(zhì)占13%）喂養(yǎng)。第12周末大鼠禁食12 h后，稱重，尾靜脈采血，HITACH自動生化分析儀檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），同位素法測定空腹血胰島素水平（fasting insulin，F(xiàn)SI），當(dāng)空腹血糖≥7.0 mmol／L為造模成功［10］。剔除建模失敗的5只大鼠，將建模成功的32只大鼠繼續(xù)以高果糖高脂飼料喂養(yǎng)，隨機(jī)分為 T2DM組、T2DM＋不同濃度的檳榔堿（0.5，1，5 mg／kg）處理組（T2DM＋Are，8只／組）：以腹腔注射的方式按照分組每天給予不同劑量的檳榔堿處理，連續(xù)4周。正常對照組繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)。

1.3 樣本處理

第16周末，各組大鼠禁食12 h后稱重，并按體重給予戊巴比妥鈉（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，股動脈取血分離血清，用于血生化指標(biāo)檢測。另取部分肝組織迅速冷凍于-80℃冰箱，用于RT-PCR及Western blot檢測。

1.4 血生化指標(biāo)檢測

空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），甘油三酯（triglyceride，TG），總膽固醇（total cholesterol，TC），高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL），低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL）由南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科HI-TACH717全自動生化分析儀測定?？崭寡逡葝u素（fasting insulin，F(xiàn)SI）水平按照試劑盒要求檢測。

1.5 RT-PCR檢測

肝臟總RNA抽取采用TRizol一步法，按試劑盒要求操作，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下：CAR（447 bp）：5’-TACCTGTTCAGCCATCACC-3’，5′-ACCGCATCTTCCATCTTGT-3′；PXR（357 bp）：5’-ATG TCT GAT GCC GCT GTG GA-3’，5′-GCT CTT GGA GGG AGG TTG GT-3′；G6Pase（157 bp）：5′-TCC TGG ACA CTG ACT ATT ACA-3′，5′-CCA CGA AAG ATA GCG AGA-3′；PEPCK（218 bp）：5′-CGC TGG ATG TCAGAAGAGG-3′，5′-GCAGTGAGTTCCCACCGTAT-3′；TNF-α（371 bp）：5’-ACA ACC AAC TGG TGG TAC CA-3’，5′-AAG TAC TTGGGCAGG TTG AC-3′；IL-6（512 bp）：5’-CCA CCA TGCCAT GGA GAA G-3’，5′-ATA TTT GGT CTG AGC ATG GTC AAG-3′；GAPDH（308 bp）：5′-TCA ACG GCA CAG TCA AGG-3′，5′-GGC TAA GCA GTT GGTGGT-3′；GAPDH（568 bp）：5′-AAGCCCATCACC ATCTTC CA-3′，5′-CCT GCC TCA CCA CCT TCT TG-3′。反應(yīng)條件如下：94℃，5 min；94℃，40 s；59℃，30 s；72℃，30 s（32 cycles），72℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以GAPDH為內(nèi)參，定量分析各基因的相對表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測大鼠肝內(nèi)AKT，p-AKT蛋白及GLUT4蛋白的表達(dá)

提取肝臟蛋白質(zhì)，BCA微量蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，取蛋白樣品30μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、加入抗AKT、p-AKT蛋白或 GLUT4抗體孵育，洗滌后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，孵育，充分洗滌后與ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光后掃描，用圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 檳榔堿對2型糖尿病大鼠體重、血糖、血脂和血胰島素的影響

與正常組大鼠相比，T2DM組大鼠體重、FBG、FSI、TG、TC和LDL水平顯著性上升，而高密度脂蛋白（HDL）水平顯著性降低；1，5 mg／kg檳榔堿處理組能顯著逆轉(zhuǎn)上述改變（P＜0.05）。而 0.5 mg／kg檳榔堿處理組對上述指標(biāo)無顯著影響（表1），因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中剔除該組。

Tab.1 Effects of arecoline on body weight，fasting blood glucose，blood lipid and insulin levels in T2DM rats（ˉx±s，n＝8）

2.2 檳榔堿對2型糖尿病大鼠肝臟PXR和CAR mRNA的影響

與正常對照組相比，T2DM組大鼠肝PXR、CAR表達(dá)降低。1，5 mg／kg檳榔堿處理后，PXR、CAR mRNA表達(dá)顯著增加（圖1）。

Fig.1 Effects of arecoline on mRNA level of PXR and CAR in T2DM rats（ˉx±s，n＝8）

2.3 檳榔堿對 2型糖尿病大鼠肝臟 G6Pase，PEPCK和炎癥因子表達(dá)的影響

與正常對照組相比，T2DM組大鼠肝臟G6Pase、PEPCK、TNF-α和 IL-6 mRNA表達(dá)增加，1，5 mg／kg檳榔堿能顯著降低這些基因的表達(dá)（圖2）。

2.4 檳榔堿對2型糖尿病大鼠肝臟AKT，p-AKT蛋白及GLUT4蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組相比，T2DM組大鼠肝p-AKT蛋白及GLUT4蛋白表達(dá)降低。1，5 mg／kg檳榔堿可提高p-AKT蛋白及GLUT4蛋白表達(dá)（圖3）。

3 討論

肝臟是機(jī)體能量代謝的主要器官，也是胰島素作用的重要靶器官。肝臟胰島素抵抗主要指胰島素抑制肝糖輸出能力減弱，是糖尿病等代謝綜合征發(fā)病的主要環(huán)節(jié)，因此改善肝臟胰島素抵抗可能是治療T2DM的環(huán)節(jié)之一。

Fig.2 Effects of arecoline on mRNA level of G6Pase，PEPCK，TNF-αand IL-6 in T2DM rats（ˉx±s，n＝8）

肝糖輸出包括糖異生和糖原分解兩部分，其中糖異生占重要地位［11］，這兩個過程均可被胰島素抑制。當(dāng)胰島素抵抗時，二個過程均增加；糖異生增加引起的內(nèi)源性葡萄糖生成增多，是糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因。葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是調(diào)節(jié)糖代謝的兩個關(guān)鍵酶，其中以G6Pase尤為重要，它催化了肝糖原分解和糖異生的最后一步反應(yīng)，在肝臟兩條產(chǎn)糖途徑都起作用；PEPCK則催化糖異生的第1步反應(yīng)［12］。越來越多的實(shí)驗(yàn)證明糖異生的過度活化與其關(guān)鍵酶PEPCK和G6Pase過表達(dá)有關(guān)，并且二者的表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)中高果糖高脂飼料誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型中PEPCK和G6Pase顯著高表達(dá)，檳榔堿可抑制這兩個基因的表達(dá)，提示：檳榔堿可通過抑制PEPCK和G6Pase的表達(dá)、減少糖異生，改善肝胰島素抵抗。

Fig.3 Effects of arecoline on protein level of phosphorylated-AKT and GLUT4 in T2DM rats（ˉx±s，n＝8）

檳榔堿作為一種外源性化合物進(jìn)入體內(nèi)，需要肝臟“外源性化合物感受器”PXR、CAR負(fù)責(zé)對其代謝、解毒。近年來研究發(fā)現(xiàn)CAR、PXR與控制糖脂代謝及炎癥表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子間存在交叉對話，對機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)代謝尤其是肝臟的物質(zhì)代謝和炎癥具有重要意義［5-8］。如：CAR或 PXR能直接與 FoxO1結(jié)合，阻止后者結(jié)合到糖異生基因PEPCK和G6Pase，起到降糖作用；PXR、CAR還能通過NF-κB途徑抑制TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子的表達(dá)［13］，而炎癥因子具有明顯誘導(dǎo)胰島素抵抗作用［14］。為此，在本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)分別設(shè)置了低劑量（0.5，1，5 mg／kg）、中劑量（10 mg／kg，20 mg／kg）、高劑量（50 mg／kg）檳榔堿處理T2DM大鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中高劑量（10 mg／kg，20 mg／kg，50 mg／kg）檳榔堿腹腔注射，大鼠數(shù)天后出現(xiàn)流涎、犬坐、豎毛、戰(zhàn)栗等毒性反應(yīng)，且出現(xiàn)時間與嚴(yán)重程度隨劑量增大而加重；而1 mg／kg和5 mg／kg檳榔堿處理T2DM大鼠，無毒副作用，且能顯著降低血糖，因此，在隨后的機(jī)制探討中，我們只選用1 mg／kg和5 mg／kg檳榔堿處理大鼠，觀察檳榔堿對大鼠肝 PXR，CAR，炎癥因子 TNF-α、IL-6表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：1，5 mg／kg檳榔堿能顯著提高T2DM大鼠肝臟PXR和CAR表達(dá)，降低TNF-α、IL-6的表達(dá)，而檳榔堿對正常大鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)無顯著影響（結(jié)果未顯示）。

研究顯示：胰島素誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位異常是IR的重要特征，其中Akt在促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)位中起著重要作用［15］。因此本實(shí)驗(yàn)檢測了檳榔堿對大鼠肝臟胰島素信號通路中p-AKT和GLUT4表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：1，5 mg／kg檳榔堿能顯著提高T2DM大鼠肝臟p-AKT和GLUT4蛋白表達(dá)水平。提示：檳榔堿可能通過促進(jìn)大鼠肝臟GLUT4的轉(zhuǎn)位改善T2DM大鼠肝臟IR。

綜上所述：檳榔堿一方面可能通過 PXR、CAR影響糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)；另一方面可能通過PXR、CAR抑制T2DM大鼠肝臟炎性因子的表達(dá)，最終促進(jìn)大鼠GLUT4的轉(zhuǎn)位來改善T2DM大鼠肝臟IR；然而檳榔堿對脂質(zhì)影響的具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

［1］ 張 偉，周壽紅，凌宏艷，等.檳榔堿抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及其機(jī)制［J］.中國動脈硬化雜志，2009，17（4）：269-172.

［2］ 石翠格，胡 剛，汪 海.天然藥物檳榔堿對氧化低密度脂蛋白致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究［J］.科學(xué)技術(shù)與工程，2007，7（12）：24-28.

［3］ 段智變，汪 海.高糖致內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子基因的過度表達(dá)以及檳榔堿的調(diào)節(jié)作用［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2006，11（1）：27-32.

［4］ 姚起鑫，亓竹青，王 光，等.檳榔堿改善2型糖尿病大鼠糖、脂代謝紊亂［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（11）：1477-1481.

［5］ Gao J，He J，Zhai YG，et al.The constitutive androstane receptor is an anti-obesity nuclear receptor that improves insulin sensitivity［J］.J Biol Chem，2009，284（38）：25984-25992.

［6］ Jiang M，Xie W.Role of the constitutive androstane receptor in obesity and type 2 diabetes：a case study of the endobiotic function of a xenobiotic receptor［J］.Drug Metab Rev，2013，45（1）：156-163.

［7］ Spruiell K，Richardson RM，Cullen JM，et al.Role of pregnane X receptor in obesity and glucose homeostasis in male mice［J］.J Biol Chem，2014，289（6）：3244-3261.

［8］ Kittayaruksakul S，Zhao W，Xu M，et al.Identification of three novel natural product compounds that activate PXR and CAR and inhibit inflammation［J］.Pharm Res，2013，30（9）：2199-2208.

［9］ Reaven GM，Hwang IS，H oH.Fructose-induced insulin resistance and hyperten sion in rats［J］.Hypertension，1987，10（5）：512-516.

［10］郭嘯華，劉志紅，李 恒，等.高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型及其腎病特點(diǎn)［J］.中國糖尿病雜志，2002，10（5）：290-294

［11］趙惠中，蕭建中，楊文英，等.肝臟胰島素抵抗與肝糖輸出調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)系［J］.中華肝臟病雜志，2006，14（1）：45-48.

［12］Goto M，Yoshioka T，Battelino T，et al.TNFalpha decreases gluconeogenesis in hepatocytes isolated from 10-day-old rats［J］.Pediatr Res，2001，49（4）：552-557.

［13］ Zhou C，Tabb MM，Nelson EL，et al.Mutual rep ression between steroid and xenobiotic recep tor and NF-kappaB signaling pathways links xenobiotic metabolism and inflammaion［J］.J Clin Invest，2006，116（8）：2280-2289.

［14］張利華，張 薇，韋廣洪，等.α-亞麻酸對糖尿病大鼠炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（1）：64-67.

［15］Van DE，Govers R，James DE.Akt activation is required at a late stage of insulin-induced GLUT4 translocation to the plasma membrane［J］.Mol Endocrinol，2005，19（4）：1067-1077.