清營瀉瘀方聯(lián)合力肽對腸缺血再灌注損傷大鼠腸屏障的保護作用

陳 江，方孫陽，吳志明

浙江紹興醫(yī)院普外科（紹興312030）

我們在臨床實踐發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注損傷急性期以熱邪和毒邪為主，表現(xiàn)為熱毒熾盛，采用清營瀉瘀方，清熱解毒，涼血瀉瘀，臨床應(yīng)用效果顯著。前期實驗發(fā)現(xiàn)[1]，清營瀉瘀方與大承氣方相比，其對腸缺血再灌注損傷大鼠腸屏障有顯著的保護作用。本實驗以此為基點，研究清營瀉瘀方聯(lián)合力肽對腸缺血再灌注大鼠腸屏障的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量（280±10）g，清潔級。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物公司提供。清潔級動物房飼養(yǎng)，20～24℃，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物 戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司。中藥清營瀉淤方：水牛角片30 g，益母草30 g，生大黃15 g（后下），芒硝12 g，黨參15 g，甘草10 g。中藥大承氣方：生大黃12 g（后下），厚樸24 g，枳實12 g，芒硝6 g（沖）。采用配方顆粒制成濃度為1∶1藥液(含生藥1 g/mL)，滅菌處理后4℃冰箱內(nèi)保存。配方顆粒劑由江蘇天陰藥業(yè)有限公司提供。力肽由無錫華瑞制藥有限公司提供。

1.3 主要試劑及儀器 TNF-α和IL-10的試劑盒分由美國Biosouce International Inc和R＆D Systems Inc公司提供。D-乳酸試劑盒為美國Synthecon公司產(chǎn)品，D-乳酸脫氫酶(D-LDH)購于美國Sigma公司。芬蘭Labsystems Dragon Wellscan MK2型酶標(biāo)儀。

1.4 動物模型的制備 1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。上腹部正中切口（長約2 cm）入腹，分離腸系膜上動脈及其周圍組織，在腸系膜上動脈根部用動脈夾鉗夾，觀察2 min。待確定腸系膜上動脈血流被阻斷（腸壁蒼白，血管無搏動），縫合傷口。45 min后開腹，打開動脈夾，恢復(fù)腸系膜上動脈血液供應(yīng)（腸壁變紅，血管搏動），再關(guān)腹。整個手術(shù)過程中，腹腔內(nèi)滴加37℃生理鹽水5 mL，保持血流動力學(xué)的穩(wěn)定，并注意保暖。

1.5 動物分組及給藥方法 將72只大鼠隨機分為假手術(shù)組8只、模型組、中藥組（清營瀉瘀方）、西藥組(力肽)、合用組(清營瀉瘀方聯(lián)合力肽)各16只，后四組按造模后處死時間再分別分為再灌注后2 h組和再灌注后24 h組（每組8只）。術(shù)前2 d分別給予生理鹽水、清營瀉瘀方和力肽灌胃（2.2 mL/只/d），最后1 d灌胃在術(shù)前30 min。按組別分于再灌注后2 h和24 h處死，取末端回腸組織作病理切片；所采血樣3000 r，離心20 min，分離血清和血漿，置-70℃超低溫冰箱中保存。

1.6 檢測指標(biāo)及其方法 組織病理學(xué):將回腸末端組織固定于中性福爾馬林溶液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片HE染色后光鏡下觀察組織學(xué)變化。血清中TNF-α和IL-10的測定采用酶標(biāo)儀進行測定，按照試劑盒使用說明所規(guī)定的操作規(guī)程和結(jié)果判定方法進行。血漿D-乳酸采用改良的酶學(xué)分光光度法檢測。將血漿加入試管，與含4.6 mmol/L NAD+的碳酸鹽緩沖液混合。待測管加入50μL D-乳酸脫氫酶，空白管加入50μL蒸餾水，以空白管調(diào)零于340 nm處測定吸光度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察 腸黏膜病理采用Chiu評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1，結(jié)果見表2。光鏡下，假手術(shù)組回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯變化（圖1）；模型組腸I/R后2 h后呈急性炎癥改變：黏膜和黏膜下層充血、水腫和糜爛，固有層有多量中性粒細胞浸潤，部分可見黏膜上皮壞死脫落（圖2）；中藥組和西藥組亦可見上述表現(xiàn)，但損傷程度較模型組明顯減輕（P＜0.01），合用組優(yōu)于中藥組（P＜0.05）（圖3～圖5）。腸I/R后24 h，各組腸黏膜結(jié)構(gòu)基本修復(fù)，治療組與模型組無明顯差別（P＞0.05）。

表1 腸黏膜損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 各組間大鼠腸黏膜Chiu評分（±s）

表2 各組間大鼠腸黏膜Chiu評分（±s）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05，aa P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.05，bb P＜0.01；與西藥組比較，c P＜0.05，cc P＜0.01與中藥組比較，d P＜0.05，dd P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組西藥組中藥組合用組n8 8 8 8 8再灌注2 h 0.63±0.52bb、cc、dd 4.13±0.83aa、cc、dd 3.25±0.46aa、bb、dd 2.38±0.52aa、bb、cc 1.63±0.52aa、bb、cc、d再灌注24 h 0.63±0.52bb、cc、dd 2.13±0.64aa 2.00±0.76aa 1.75±0.71aa 1.50±0.53a

2.2 血清TNF-α和IL-10含量變化 腸I/R后2 h，與假手術(shù)組相比，模型組血清中TNF-α水平明顯升高（P＜0.01）；中藥組和合用組TNF-α水平均較模型組明顯降低（P＜0.01）；IL-10的表達在各組間無差別。腸I/R后24 h，與假手術(shù)組相比，模型組血清中TNF-α和IL-10水平均明顯升高（P＜0.01）；中藥組和合用組TNF-α水平較模型組降低；中藥組和合用組IL-10水平均較模型組明顯降低（P＜0.01）見表3。

圖1 假手術(shù)組(HE,×40)

圖2 模型組腸I/R后2 h(HE,×40)

圖3 中藥組腸I/R后2 h(HE,×40)

圖4 西藥組腸I/R后2 h(HE,×40)

圖5 合用組腸I/R后2 h(HE,×40)

2.3 血漿中D－乳酸含量的變化 腸I/R后2 h，與假手術(shù)組相比，模型組血漿中D-乳酸水平明顯升高（P＜0.01）；中藥和西藥組D-乳酸水平較模型組均明顯降低（P＜0.01），中藥組優(yōu)于西藥組（P＜0.05）.腸I/R后24 h，與假手術(shù)組相比，模型組血漿中D-乳酸水平明顯升高（P＜0.01）；中藥組D-乳酸水平較模型組降低（P＜0.05）見表4。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，邪和瘀是諸血管病發(fā)生的主要原因，以邪為主因，由邪（致病因子）致瘀（血栓），繼而傷正（缺血或郁血）。因此，邪盛致生新瘀則病急，邪祛但留舊瘀則病緩。盡管活血化瘀類中藥如丹參等具有改善腹腔臟器的血液循環(huán)，防止血栓形成的作用，但是僅適用于慢性缺血階段，如果不擇時機，不辨病邪的全程重用，反可使療效降低，病程延長。我們在臨床實踐發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注損傷急性期以熱邪和毒邪為主，表現(xiàn)為熱毒熾盛，灼傷營血而生瘀，治療上以清熱解毒，涼血瀉瘀為主，療效顯著。

表3 各組間大鼠血清TNF-α和IL-10含量比較（±s D，pg/mL）

表3 各組間大鼠血清TNF-α和IL-10含量比較（±s D，pg/mL）

注：與假手術(shù)組比較，aa P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.05，bb P＜0.01；與西藥組比較，c P＜0.05，cc P＜0.01；與中藥組比較，d P＜0.05，dd P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組西藥組中藥組合用組n 8 8 8 8 8 TNF-α IL-10再灌注2 h 90.77±4.41bb、dd 143.21±18.19aa、dd 115.86±18.27 104.17±6.40aa、bb 92.41±18.35bb再灌注24 h 90.77±4.41bb、dd 114.88±13.73aa、d 110.64±8.93aa 102.83±13.90b 94.16±10.60bb、cc再灌注2 h 16.14±4.22 19.93±6.40 16.46±4.89 17.35±2.89 16.29±4.67再灌注24 h 16.14±4.22bb、cc 49.04±13.17aa、c、dd 37.57±13.61aa、b、dd 22.83±8.31bb、cc 21.87±6.51bb、cc

表4 各組間大鼠血漿中D乳酸含量的比較（±s D：mg/L）

表4 各組間大鼠血漿中D乳酸含量的比較（±s D：mg/L）

注：與假手術(shù)組比較，aa P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.05，bb P＜0.01；與西藥組比較，c P＜0.05，cc P＜0.01；與中藥組比較，d P＜0.05，dd P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組西藥組中藥組合用組n8 8 8 8 8再灌注2 h 3.60±0.69bb、cc、dd 14.13±2.09aa、cc、dd 11.84±1.42aa、bb、d 10.38±1.41aa、bb、c 8.69±0.92aa、bb、cc、d再灌注24 h 3.60±0.69bb、cc、dd 9.93±1.03aa、c、dd 8.94±0.74aa、b 8.54±0.54aa、bb 7.49±0.67aa、bb、cc、dd

清營瀉瘀方是上海市名老中醫(yī)奚九一教授的臨床經(jīng)驗方劑，重用益母草、水牛角片作為清熱涼血解毒之主藥，具有清熱解毒、涼血行瘀、利水消腫的功效。此外根據(jù)“六腑以通為用”，“胃氣以降為順”的原則，還著重使用了通腑瀉下類藥物大黃和芒硝，蕩滌腸胃宿垢、致病菌和毒素，消除腸道麻痹造成的腸道瘀滯狀態(tài)，使病人在最短的時間內(nèi)排便、排氣，減少腸道有害物質(zhì)的吸收，減少腸道細菌移位。同時能夠通過調(diào)節(jié)前列腺素I2(PGI2)與血栓素B2(TXB2)之間的平衡，保證組織器官的微循環(huán)，改善腸道組織血液灌流，降低毛細血管的通透性，維護腸道黏膜屏障的正常功能，從而降低血中內(nèi)毒素水平，預(yù)防MODS的發(fā)生。其中大黃為必用藥物，近來研究證明，大黃對胃腸黏膜有明顯保護的作用[2]。它可提高膿毒癥患者胃腸黏膜內(nèi)pH值，改善胃腸道血流灌注，緩解胃腸黏膜缺血缺氧。動物實驗也表明，其可促進胃腸黏膜內(nèi)杯狀細胞增生，清除氧自由基，抑制細菌移位。內(nèi)毒素休克大鼠給予大黃治療可明顯降低內(nèi)毒素所致胃腸道微血管通透性，抑制腸道內(nèi)毒素吸收，機制可能與大黃抑制內(nèi)毒素休克大鼠血漿和腸壁血小板活化因子及磷脂酶A2(PLA2)的生成有關(guān)。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注損傷過程中，大黃能提高缺血再灌注損傷腸道熱休克蛋白（HSP70）表達[3]。HSP70有免疫調(diào)節(jié)、炎癥調(diào)節(jié)、抗氧化、抗細胞凋亡及改善組織代謝等作用。Singleton KD等[4]發(fā)現(xiàn)，使用熱休克因子表達抑制劑槲皮素等來阻止HSPs的表達后，谷氨酰胺介導(dǎo)的保護腸道，促進腸功能恢復(fù)的作用則大大減弱。可見大黃對腸道的保護作用與多種機制相關(guān)。

TNF-α作為促炎介質(zhì)中的首動因子及致炎損傷網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)，在腸缺血再灌注損傷中起著重要的作用，它可誘發(fā)IL-1、IL-6、IL-8、血小板活化因子（PAF）、前列腺素和白三烯等的分泌，由此產(chǎn)生炎癥連鎖反應(yīng)，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征。IL-10是一種有效的抗炎介質(zhì)，可拮抗TNF-α，產(chǎn)生保護作用，但產(chǎn)生過多可引起免疫抑制。李文雄等[5]對32例膿毒癥患者進行研究，檢測其血清TNF-α、IL-10濃度并計算IL-10/TNF-α比值，發(fā)現(xiàn)血清IL-10水平或IL-10/TNF-α比值高的膿毒癥患者，預(yù)后差。我們的研究表明，清營瀉瘀方聯(lián)合力肽在腸I/R早期能夠降低大鼠血清促炎介質(zhì)TNF-α的表達水平，晚期能夠降低抗炎介質(zhì)IL-10的表達水平，阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)，提高機體的免疫功能。

D-乳酸是腸道固有細菌的代謝終產(chǎn)物，由于其他哺乳動物機體各組織既不能產(chǎn)生D-乳酸也沒有快速代謝分解D-乳酸的酶系統(tǒng)，所以外周血D-乳酸主要來源于腸道，而其在肝內(nèi)不被分解，故其水平可反映腸道機械屏障的功能狀態(tài)。大多研究[6-7]表明，急性腸缺血引起的腸黏膜損傷可使血D-乳酸濃度迅速升高，并且D-乳酸含量與內(nèi)毒素濃度呈顯著正相關(guān)。清營瀉瘀方通過蕩滌腸胃宿垢、致病菌和毒素，降低炎癥介質(zhì)的含量而消除腸道瘀滯狀態(tài)，減少腸道有害物質(zhì)的吸收，減少腸道細菌移位，保護腸屏障功能，減少腸道細菌和內(nèi)毒素移位。

腸缺血再灌注損傷是多種因素參與的復(fù)雜病理過程，而目前單一的藥物治療往往無法奏效，所以只有全面考慮，盡可能地打斷多種環(huán)節(jié)的影響，才有可能取得突破性的進展。中西醫(yī)結(jié)合保護腸I/R損傷有著很大的發(fā)展空間，但其應(yīng)用方式、劑量、副作用及長期療效尚不肯定，缺乏嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床實驗設(shè)計及大樣本的對比研究，值得做進一步研究。我們應(yīng)針對腸道缺血再灌注損傷的發(fā)病機制，對中西藥物結(jié)合的藥理作用做更進一步的研究，在臨床方面進行較大規(guī)模的前瞻、多中心研究，采用循證醫(yī)學(xué)的方法對中西醫(yī)結(jié)合保護腸缺血再灌注方面的最終療效進行客觀的評價，并進一步研制開發(fā)出更為有效的藥物，從而為早期防治創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS的研究開辟新的途徑。

[1]吳志明，陳江，儲修峰，等．清營瀉瘀方對腸缺血再灌注損傷大鼠的保護作用及機制[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2010，(16)5：557-560.

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