核桃青皮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其分子機(jī)制的探討

張仲衛(wèi)，鄢文強(qiáng)，李彩霞，王冬濱，李志剛，司傳領(lǐng)，孔 棣

1.天津醫(yī)科大學(xué)（天津300070）

2.天津市南開(kāi)醫(yī)院（天津300100）

3.天津科技大學(xué)（天津300222）

食管癌是一種常見(jiàn)腫瘤，治療以手術(shù)為主，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，化療效果不理想。有研究表明，核桃青皮提取物可抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)理是直接殺傷腫瘤細(xì)胞[1]。本研究觀察了核桃青皮粗提取物和核桃青皮提取物沒(méi)食子酸、乙酸乙酯、紫杉葉素、7-D-芹菜糖-兒茶酚對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和CyclinD1蛋白表達(dá)的影響，從而為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療食管癌的中藥提取物提供理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 食管癌細(xì)胞株EC9706，KYSE150（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺癌研究所提供）。

1.2 主要試劑與儀器 二甲基亞楓（上海生工）、小牛血清（GIBCO公司）、RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)、胰蛋白酶（Hyclone公司），四甲基偶氮唑鹽(MTT)（美國(guó)Sigma公司）。CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），倒置顯微鏡（Leica公司），KHB st-360免疫檢測(cè)酶標(biāo)儀（上?？迫A）。BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），鼠抗人β-actin多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗人cyclinD1多克隆抗體（cell signaling，USA），（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠Ig-G二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藥物提取 核桃青皮用95%的乙醇萃取4次，風(fēng)干得到微細(xì)粉末即為核桃青皮粗提物。將核桃青皮粗提物結(jié)合其水性殘留物，在真空下濃縮，然后依次分餾，得到亞組分核桃青皮提取物沒(méi)食子酸、乙酸乙酯、紫杉葉素、7-D-芹菜糖-兒茶酚[2]。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌細(xì)胞株EC9706和KYSE 150分別常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清、0.1 mg/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT法檢測(cè)核桃青皮粗提物和核桃青皮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期食管癌細(xì)胞株EC9706和KYSE150分別用0.25%胰蛋白酶消化后，以每孔5×103個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 uL培養(yǎng)24 h后，分別換含不同濃度核桃青皮粗提物、沒(méi)食子酸、乙酸乙酯、紫杉葉素和7-D-芹菜糖-兒茶酚的培養(yǎng)液，各組分的終濃度分別為10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL，160μg/mL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后，棄上清，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10μL，繼續(xù)孵育4 h，之后棄去上清液，每孔加入150μL的DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。按下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=（對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值×100%。

1.3.4 Western Blot檢測(cè)食管癌細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)水平 以1×105個(gè)/mL濃度將EC9706和KYSE150分別接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞貼壁后分別換含50μg/mL核桃青皮粗提物、沒(méi)食子酸、乙酸乙酯的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加100μL含PMSF的RIPA裂解液，快速刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，置冰上裂解30 min。于4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清備用。BCA蛋白定量后，取35μg蛋白與上樣緩沖液混勻，恒壓下電泳，待溴酚藍(lán)至分離膠底部時(shí)，停止電泳。半干轉(zhuǎn)膜23 min。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜2 h。一抗(β-actin 1:200或CyclinD1 1∶1000，均用1×TBST稀釋)4℃結(jié)合過(guò)夜，1×TBST室溫洗膜;二抗(羊抗兔二抗工作濃度為1∶5000)室溫孵育1.5 h，洗膜后加ECL避光孵育5 min，化學(xué)發(fā)光影像分析儀進(jìn)行顯影，采圖，用Quantity one圖像處理軟件分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果均以(x±s)表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組均數(shù)間比較用方差分析，均以P＜0.05為差異顯著的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 核桃青皮提取物對(duì)EC9706及KYSE150細(xì)胞增殖的抑制率 核桃青皮粗提物和4種提取物中的沒(méi)食子酸和乙酸乙酯對(duì)EC9706和KYSE150細(xì)胞均有抑制作用，當(dāng)濃度增加至80μg/mL時(shí)，對(duì)KYSE150的抑制率分別為82.75%、90.51%、88.36%，對(duì)EC9706的抑制率分別為85.54%、87.21%、85.17%。而紫杉葉素、7-D-芹菜糖-兒茶酚對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。如圖1、圖2所示。

圖1 不同濃度核桃青皮提取物對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的抑制率

圖2 不同濃度核桃青皮提取物對(duì)KYSE150細(xì)胞增殖的抑制率

2.2 核桃青皮粗提物和兩種有效核桃青皮提取物對(duì)EC9706和KYSE150細(xì)胞增殖的抑制作用 核桃青皮粗提物、沒(méi)食子酸和乙酸乙酯濃度為10～160μg/mL時(shí)均能抑制食管癌細(xì)胞株EC9706和KYSE150的增殖，高濃度核桃青皮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表1，表2及表3。

表1 核桃青皮粗提物對(duì)EC9706和KYSE150細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=5)

表1 核桃青皮粗提物對(duì)EC9706和KYSE150細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=5)

注：與陰性對(duì)照組比較，a P＜0.05，b P＜0.01

核桃青皮粗提物濃度（μg/mL）0 10 20 40 80 160 A 490 EC9706 0.602±0.031 0.534±0.038a 0.476±0.055a 0.315±0.043b 0.109±0.014b 0.072±0.002b KYSE150 0.973±0.045 0.764±0.068a 0.509±0.033b 0.230±0.035b 0.148±0.052b 0.064±0.009b

表2 沒(méi)食子酸對(duì)EC9706和KYSE150細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=5)

表2 沒(méi)食子酸對(duì)EC9706和KYSE150細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=5)

注：與陰性對(duì)照組比較，a P＜0.05，b P＜0.01

核桃青皮沒(méi)食子酸（gallic acid）濃度（μg/mL）0 10 20 40 80 160 A 490 EC9706 0.590±0.024 0.481±0.046a 0.333±0.026a 0.226±0.033b 0.075±0.005b 0.069±0.008b KYSE150 0.951±0.013 0.911±0.045 0.770±0.041a 0.288±0.028b 0.090±0.003b 0.105±0.007b

表3 乙酸乙酯對(duì)EC9706和KYSE150細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=5)

表3 乙酸乙酯對(duì)EC9706和KYSE150細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=5)

注：與陰性對(duì)照組比較，a P＜0.05，b P＜0.01

核桃青皮乙酸乙酯（ETOAC）濃度（μg/mL）0 10 20 40 80 160 A 490 EC9706 0.588±0.032 0.502±0.034a 0.444±0.015b 0.254±0.055b 0.087±0.012b 0.081±0.007b KYSE150 1.016±0.005 0.849±0.074b 0.759±0.038b 0.225±0.010b 0.117±0.004b 0.102±0.012b

2.3 食管癌細(xì)胞KYSE150和EC9706 CyclinD1蛋白表達(dá) 各組蛋白表達(dá)情況如圖3，灰度值統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

3 討論

圖3 KYSE150和EC9706細(xì)胞經(jīng)3種藥物（核桃青皮粗提物，沒(méi)食子酸和乙酸乙酯）處理后CyclinD1的表達(dá)

圖4 CyclinD1蛋白在不同組別間表達(dá)的比較

我國(guó)食管癌發(fā)病率為19.24/10萬(wàn)，在癌癥發(fā)病構(gòu)成中排列第6位；同期食管癌死亡率為15.39/10萬(wàn)，在癌癥死亡原因中列第4位[3]。胡桃屬植物具有抗腫瘤作用[4]。核桃青皮家族核桃楸在治療食道癌、肝癌、腸癌均有明顯效果[5]，青龍衣（核桃青皮）膠囊含藥血清對(duì)人胃腺癌SGC-7901、肺癌A-549、乳腺癌MCF-7細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，對(duì)人胃腺癌SGC-7901荷瘤裸鼠具有一定的體內(nèi)抑瘤作用[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察了核桃青皮粗提物和4種核桃青皮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706和KYSE150增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：核桃青皮粗提物和核桃青皮提取物沒(méi)食子酸、乙酸乙酯均能抑制食管癌細(xì)胞的增殖，且抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性。

細(xì)胞增殖是通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，而細(xì)胞周期的有序運(yùn)行是通過(guò)相關(guān)基因的嚴(yán)格監(jiān)視和調(diào)控的。其中G1/S是細(xì)胞周期中最重要的調(diào)控點(diǎn)而CyclinD1在G1/S期起重要作用，它對(duì)G1期的調(diào)控是通過(guò)對(duì)抑癌基因蛋白pRb的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，pRb在G 1期處于低磷酸化狀態(tài)（功能狀態(tài)），通過(guò)與發(fā)動(dòng)S期的重要分子如轉(zhuǎn)錄因子E2F等結(jié)合，抑制進(jìn)入S期所需蛋白的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞停滯于S期，當(dāng)外源性增殖分裂信號(hào)與相應(yīng)受體結(jié)合后，通過(guò)信號(hào)傳遞促進(jìn)CyclinD1基因表達(dá)，使CyclinD1蛋白與CDK4/6結(jié)合使之活化，以CDK4/6為催化亞基、CyclinD1為調(diào)節(jié)亞基形成激酶復(fù)合體[7]，并結(jié)合pRb，在催化亞基CDK4/6作用下，對(duì)功能狀態(tài)下的pRb進(jìn)行磷酸化，使之失活并釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F脫離pRb蛋白后發(fā)揮強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，激活A(yù)-DNA聚合酶c-myc、cdc-2等的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞越過(guò)G1/S限制點(diǎn)進(jìn)入S期。在生理狀態(tài)下[8]，細(xì)胞進(jìn)入S期后CyclinD1迅速分解。如果CyclinD1基因激活，則CyclinD1持續(xù)高表達(dá)，將導(dǎo)致G1期縮短，提前進(jìn)人S期，使細(xì)胞增殖失控，最終形成腫瘤。我們利用western blot檢測(cè)核桃青皮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞CyclinD1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)核桃青皮粗提取物和核桃青皮提取物沒(méi)食子酸、乙酸乙酯都能降低CyclinD1在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖。

近年研究發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤治療中植物原料藥比化學(xué)合成藥更具優(yōu)勢(shì)[4]，我們的研究提示核桃青皮粗提物和核桃青皮提取物沒(méi)食子酸、乙酸乙酯都有可能成為臨床抗食管癌新藥。

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