紅細(xì)胞（微）嵌合體血型鑒定新方法的建立及初步應(yīng)用

孫 禾 謝作聽 俞石芳

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江溫州 325000）

·臨床與檢驗(yàn)·

紅細(xì)胞（微）嵌合體血型鑒定新方法的建立及初步應(yīng)用

孫 禾 謝作聽 俞石芳

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江溫州 325000）

目的建立紅細(xì)胞（微）嵌合體血型鑒定的新方法并對(duì)其進(jìn)行初步應(yīng)用。方法建立4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)試管法用于檢測(cè)A／O、B／O體外模擬紅細(xì)胞微嵌合體和ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后患者紅細(xì)胞微嵌合體血型，同時(shí)將其與常規(guī)鹽水介質(zhì)試管法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)法A／O嵌合體模型組中A型紅細(xì)胞、B／O嵌合體模型組中B型紅細(xì)胞最低檢測(cè)限均為1∶12800，ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后患者標(biāo)本檢到B抗原；常規(guī)鹽水介質(zhì)試管法A／O嵌合體模型組中A型紅細(xì)胞以及B／O嵌合體模型組中B型紅細(xì)胞最低檢測(cè)限均為1∶100，ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后患者未檢到B抗原。結(jié)論4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)試管法對(duì)紅細(xì)胞（微）嵌合體血型的最低檢測(cè)限明顯小于常規(guī)鹽水介質(zhì)試管法，可用于ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后紅細(xì)胞血型的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

紅細(xì)胞；微嵌合體；血型鑒定

ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植（allo－HSCT）后，患者體內(nèi)可形成ABO血型紅細(xì)胞（微）嵌合體，由于嵌合體的動(dòng)態(tài)變化與造血干細(xì)胞移植后患者病情的發(fā)展是相關(guān)的，因此定期監(jiān)測(cè)嵌合體是評(píng)估患者預(yù)后和選擇針對(duì)性治療策略的重要依據(jù)［1］，有助于臨床更好了解移植效果［2－3］。常規(guī)鹽水介質(zhì)試管法是檢測(cè)紅細(xì)胞嵌合體的常用方法之一，但由于其檢測(cè)靈敏度較低［4－5］，故該法并不適用于紅細(xì)胞微嵌合體的檢測(cè)。為此，本文建立了4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)試管法并用于紅細(xì)胞微嵌合體檢測(cè)，取得令人滿意的結(jié)果，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 觀察組 收集2013年7月2日入住本院ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后1例患兒，男，7歲，因急性單核細(xì)胞白血病于4個(gè)月前行同胞異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)（A供AB）；當(dāng)前血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果ABO正定型A型，反定型AB型，抗體篩查試驗(yàn)結(jié)果陰性。

1.1.2 嵌合體模型組 另隨機(jī)收集多人混合A型健康獻(xiàn)血員洗滌后血細(xì)胞比容10mL（由10份A型 RhD陽性供血者洗滌后血細(xì)胞比容等量混合而成，以下簡(jiǎn)稱混合A型紅細(xì)胞）、多人混合B型健康獻(xiàn)血員洗滌后血細(xì)胞比容10mL（由10份B型RhD陽性供血者洗滌后血細(xì)胞比容等量混合而成，以下簡(jiǎn)稱混合B型紅細(xì)胞）、多人混合O型健康獻(xiàn)血員洗滌后血細(xì)胞比容40mL（由40份O型RhD陽性供血者洗滌后血細(xì)胞比容等量混合而成，以下簡(jiǎn)稱混合O型紅細(xì)胞）。

1.2 試劑與儀器 抗A、抗B定型試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20121121，效價(jià)均為512），A、B、O型健康獻(xiàn)血員紅細(xì)胞（本室自制），CU－420電熱恒溫水箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、Baso2005－2離心機(jī)（臺(tái)灣Baso公司），Olympus普通光學(xué)顯微鏡（日本歐林巴斯公司）。

1.3 微嵌合體模型的構(gòu)建 （1）A／O微嵌合體：取10支試管，排成1排，依次對(duì)應(yīng)加入20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、0.15625%、0.078125%、0.0390625%混合A型懸液50μL，然后每管加入混合O型紅細(xì)胞懸液0.5mL，混勻，即可得到1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600 10種A／O嵌合體模型；（2）B／O微嵌合體：取10支試管，排成1排，依次對(duì)應(yīng)加入20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、0.15625%、0.078125%、0.0390625%混合B型紅細(xì)胞懸液50μL，然后每管加入混合O型紅細(xì)胞懸液0.5mL，混勻，即可得到1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600 10種B／O嵌合體模型。

1.4 4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)法 （1）A／O嵌合體模型組：上述10種A／O嵌合體模型管中分別加入抗A定型試劑0.5mL，混勻，于4℃吸收2小時(shí)（期間每隔15分鐘輕輕搖勻1次），用9g／L NaCl溶液洗滌4次，末次洗滌后棄上清，分別加入9g／L NaCl溶液0.5mL，混勻，于56℃水浴箱內(nèi)釋放15分鐘（期間不時(shí)輕輕搖晃），立即離心后吸取上層釋放液，等分為2份，分別加入3%混合A型紅細(xì)胞、3%混合O型紅細(xì)胞50μL，混勻，1000rpm離心1分鐘后肉眼或顯微鏡觀察結(jié)果（肉眼未見凝集者以顯微鏡結(jié)果為準(zhǔn)）；（2）B／O嵌合體模型組：上述10種B／O嵌合體模型管分別加入抗B定型試劑0.5mL，混勻，于4℃吸收2小時(shí)（期間每隔15分鐘輕輕搖勻1次），用9g／L NaCl溶液洗滌4次，末次洗滌后棄上清，分別加入9g／L NaCl溶液0.5mL，混勻，于56℃水浴箱內(nèi)釋放15分鐘（期間不時(shí)輕輕搖晃），立即離心后吸取上層釋放液，等分為2份，分別加入3%混合B型紅細(xì)胞、3%混合O型紅細(xì)胞50μL，余操作同A／O嵌合體模型組；（3）觀察組：分別加入患者洗滌后血細(xì)胞比容和抗B定型試劑各0.5 mL，混勻，余操作同B／O嵌合體模型組。判斷標(biāo)準(zhǔn)：若釋放液與混合O型紅細(xì)胞反應(yīng)不出現(xiàn)肉眼和顯微鏡下凝集現(xiàn)象，而與混合A（或B）型紅細(xì)胞反應(yīng)出現(xiàn)肉眼或顯微鏡下凝集現(xiàn)象，則判為檢到A（或B）抗原；若釋放液與混合A（或B）、O型紅細(xì)胞反應(yīng)均不出現(xiàn)肉眼和顯微鏡下凝集現(xiàn)象，則判為未檢到A（或B）抗原；（4）重復(fù)性試驗(yàn)：上述試驗(yàn)A／O嵌合體模型組、B／O嵌合體模型組同時(shí)進(jìn)行10份測(cè)定，觀察組因標(biāo)本量限制，只做雙份測(cè)定。

1.5 常規(guī)鹽水介質(zhì)試管法 嚴(yán)格按照試劑說明書操作，具體操作如下：（1）A／O嵌合體模型組：分別加入3%A／O嵌合體紅細(xì)胞懸液和抗A定型試劑各1滴（50μL），混勻，1000rpm離心1分鐘后肉眼或顯微鏡觀察結(jié)果（肉眼未見凝集者以顯微鏡結(jié)果為準(zhǔn)）；同時(shí)設(shè)立鹽水自身對(duì)照；（2）B／O嵌合體模型組：分別加入3%B／O嵌合體紅細(xì)胞懸液和抗B定型試劑各1滴（50μL），余操作同A／O嵌合體模型組；（3）觀察組：分別加入3%患者紅細(xì)胞懸液和抗B定型試劑各1滴（50μL），余操作同A／O嵌合體模型組。判斷標(biāo)準(zhǔn)：若待檢紅細(xì)胞鹽水自身對(duì)照不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，而與抗A（或抗B）定型試劑出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則判為檢到A（或B）抗原；若待檢紅細(xì)胞與抗A（或抗B）定型試劑不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象且鹽水自身對(duì)照結(jié)果陰性，則判為未檢到A（或B）抗原。

2 結(jié) 果

2.1 重復(fù)性試驗(yàn)評(píng)價(jià) A／O嵌合體模型組、B／O嵌合體模型組10次結(jié)果完全一致，最低檢測(cè)限均為1∶12800；觀察組兩次結(jié)果一致。

2.2 特異性試驗(yàn)評(píng)價(jià) A／O嵌合體模型組、B／O嵌合體模型組放散液與3%O型紅細(xì)胞反應(yīng)的對(duì)照組試驗(yàn)均不出現(xiàn)凝集，可排除非特異性凝集可能。

2.3 檢測(cè)靈敏度 4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)法A／O嵌合體模型組中A型紅細(xì)胞、B／O嵌合體模型組中B型紅細(xì)胞最低檢測(cè)限均為1∶12800，ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后患者標(biāo)本檢到B抗原；常規(guī)鹽水介質(zhì)試管法A／O嵌合體模型組中A型紅細(xì)胞、B／O嵌合體模型組中B型紅細(xì)胞最低檢測(cè)限均為1∶100，ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后患者標(biāo)本未檢到B抗原。

3 討 論

ABO不合異基因造血干細(xì)胞植入后到疾病復(fù)發(fā)，通常要經(jīng)歷以下幾個(gè)嵌合狀態(tài)：（1）供者紅細(xì)胞微嵌合（供者紅細(xì)胞比例＜1%）；（2）供、受者混合紅細(xì)胞嵌合（供者紅細(xì)胞比例介于5%～95%）；（3）完全供者紅細(xì)胞嵌合（供者紅細(xì)胞比例為100%）；（4）供、受者混合紅細(xì)胞微嵌合（受者紅細(xì)胞比例＜1%）；（5）供、受者混合紅細(xì)胞嵌合（受者紅細(xì)胞比例介于5%～95%）；（6）完全受者紅細(xì)胞嵌合（受者紅細(xì)胞比例為100%）。由于供、受者混合紅細(xì)胞微嵌合和混合紅細(xì)胞嵌合既可能向完全的供者紅細(xì)胞嵌合方向轉(zhuǎn)變（預(yù)示移植成功），也可能向完全受者紅細(xì)胞嵌合的方向發(fā)展（預(yù)示移植失敗或疾病復(fù)發(fā)），故對(duì)移植后患者開展紅細(xì)胞（微）嵌合體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)移植后患者轉(zhuǎn)歸的判斷以及臨床干預(yù)措施的選擇具有重要的臨床意義。

吸收放散試驗(yàn)是一種敏感、實(shí)用的血型血清學(xué)技術(shù)，目前主要用于紅細(xì)胞血型抗體純化、分離、鑒定以及紅細(xì)胞弱抗原的檢測(cè)分析。吸收是用紅細(xì)胞（抗原）在最適條件下充分吸收目標(biāo)抗體，放散則是將吸附于紅細(xì)胞上的抗體用物理或化學(xué)的方法使其脫離下來，然后再采用指示紅細(xì)胞來反映試驗(yàn)結(jié)果。吸收放散試驗(yàn)的主要目的是濃縮、純化抗體，最終達(dá)到提高檢測(cè)靈敏性和特異性（減少非特異性干擾）的目的。根據(jù)抗原抗體的特性不同，可選擇相應(yīng)的吸收放散方法。因A、B抗原與抗A、抗B IgM的最適吸收放散條件為4℃吸收56℃放散，故本文建立4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)法檢測(cè)紅細(xì)胞ABO血型（微）嵌合體。

本文結(jié)果顯示，建立的4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)試管法的最低檢測(cè)限均為1∶12800，可檢測(cè)受者或供者紅細(xì)胞構(gòu)成比＞0.01%的微嵌合體，而常規(guī)鹽水介質(zhì)試管法的最低檢測(cè)限為1∶100（1%），只能檢測(cè)受者或供者紅細(xì)胞構(gòu)成比＞1%的嵌合體，因此，4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)試管法檢測(cè)靈敏度明顯高于常規(guī)鹽水介質(zhì)試管法。David等［4］和翟菊萍等［6］曾采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)異基因造血干細(xì)胞移植患者紅細(xì)胞嵌合體，并指出流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)受者或供者紅細(xì)胞構(gòu)成比＞0.4%的微嵌合體。4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)試管法與流式細(xì)胞儀法對(duì)微嵌合體的檢測(cè)能力的比較有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)雖然較穩(wěn)定，但其價(jià)格昂貴，不適合臨床常規(guī)開展。4℃吸收56℃放散鹽水介質(zhì)試管法有較小最低檢測(cè)限，靈敏度較高，重復(fù)性較好，如能對(duì)每次參與吸收放散的細(xì)胞量和抗體量作定量規(guī)定，制定嚴(yán)格操作規(guī)程，可基本消除主觀因素影響，用于ABO不合異基因造血干細(xì)胞植患者移植后（微）嵌合體血型的早動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，亦可獲較滿意結(jié)果，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

［1］李歸寧，劉峰，胡麗華．造血干細(xì)胞移植后嵌合體分析的研究．臨床血液學(xué)雜志，2010，23（8）：502

［2］Bader P，Klingebiel T，Schaudt A，et al．Prevention of relapse in pediatric patients with acute leukemias and MDS after allogeneic SCT by early immunotherapy initiated on the basis of increasing mixed chimerism：a single center experience of 12 children．Leukemia，1999，13：2079

［3］Xiaowen Tang，Gheath Alatrash，Jing Ning，et al．Increasing Chimerism after Allogeneic Stem Cell Transplantation Is Associated with Longer Survival Time．Biol Blood Marrow Transplant，2014，20：1139

［4］David B，Bernard D，Navenot JM，et al．Flow cytometric monitoring of red blood cell chimerism after bone marrow transplantation．Transfus Med，1999，9：209

［5］Hendriks EC，de Man AJ，van Berkel YC，et al．Flow cytometric method for the routine follow－up of red cell populations after bone marrow transplantation．Br J Haematol，1997，97：141

［6］翟菊萍，顧國(guó)浩，王雪明，等．紅細(xì)胞嵌合體定量檢測(cè)及在異基因造血干細(xì)胞移植中的應(yīng)用．臨床檢驗(yàn)雜志，2011，29（3）：188