農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的研究進(jìn)展

楊麗娟，盛 坤，蔣志凱，劉朝輝，趙宗武

（新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的研究進(jìn)展

楊麗娟，盛 坤，蔣志凱，劉朝輝，趙宗武

（新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡便、成本低、實(shí)用性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化。綜述了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的敏感基因型篩選、外植體類型選擇及轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化方面的研究進(jìn)展，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥前景進(jìn)行了展望。

農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化；小麥

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，利用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥遺傳改良，增強(qiáng)小麥抗病蟲和耐逆境能力，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)，是小麥遺傳育種的研究方向之一。當(dāng)前，用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化的手段主要有基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法具有基因拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn)基因沉默相對較少、轉(zhuǎn)移的基因片段較長、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)（徐春暉等，2002）。根癌農(nóng)桿菌在土壤中含量極其豐富，能在植物組織中生長。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最為廣泛的植物轉(zhuǎn)化方法。

伴隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻遺傳轉(zhuǎn)化體系日趨成熟，單子葉植物目前也能夠用這種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化（Hamid等， 1994； Ye等， 2000）。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法具有操作簡單、成本低，受體范圍廣等特點(diǎn)，但農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也存在一定不足，如易受基因型特異性，宿主范圍的限制，再生細(xì)胞感受態(tài)與轉(zhuǎn)化細(xì)胞感受態(tài)不一致性和易導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥有待于建立并完善其高效轉(zhuǎn)化體系。

1 敏感基因型篩選

小麥高頻再生系統(tǒng)是提高轉(zhuǎn)化率的首要保證，其中受體基因型是影響轉(zhuǎn)化率的重要因素。不同小麥基因型對農(nóng)桿菌侵染的敏感程度不同，篩選對農(nóng)桿菌敏感的小麥基因型對于小麥新品種選育和功能基因組研究具有重要意義。優(yōu)良小麥品種成熟胚再生性能和農(nóng)桿菌敏感性評價為進(jìn)一步利用細(xì)胞工程和基因工程途徑改良小麥奠定了基礎(chǔ)。

Bobwhite是常用的基因型（楊云霞，2005；王艷麗2006；衣大龍，2009）。王艷麗等（2005）利用含GUS基因的C58C1農(nóng)桿菌菌系轉(zhuǎn)化83個小麥基因型的幼穗，發(fā)現(xiàn)CA9924、北農(nóng)49、西農(nóng)2611、京冬11等基因型幼穗對農(nóng)桿菌侵染比較敏感；但農(nóng)桿菌侵染后小麥幼穗切段僅僅不斷膨大，幾乎不產(chǎn)生愈傷組織，難以獲得再生植株。張彬（2006）等人以3個栽培冬小麥品種運(yùn)豐優(yōu)、臨優(yōu)145、中優(yōu)9507的成熟胚愈傷組織為外植體研究發(fā)現(xiàn)，三種小麥基因型對根癌農(nóng)桿菌的敏感性存在顯著差異，以臨優(yōu)145最敏感。后猛（2008）以100份普通小麥品種（系）和4份二倍體及四倍體小麥為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生的研究，篩選出了愈傷組織出愈率高、愈組質(zhì)量好、分化能力強(qiáng)、成苗率高的山農(nóng)2618等多個優(yōu)良基因型材料。陶麗莉（2009）根據(jù)農(nóng)桿菌侵染后胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和抗性植株再生率，從41個小麥品種中篩選到了比較適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的CB037、06SKW28、邯6172、豫麥66、新春9號、輪選987、CA8694等基因型，其胚性愈傷組織誘導(dǎo)率都在10.0%以上，抗性植株再生率均高于2.0%。李欣（2012）等研究了12個優(yōu)良小麥新品種成熟胚再生率及其對農(nóng)桿菌侵染的敏感性，認(rèn)為周麥27、揚(yáng)麥19等品種適合進(jìn)行成熟胚培養(yǎng)，周麥18、揚(yáng)麥15等品種成熟胚適合進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。楊賽奇（2012）初步根據(jù)幼胚愈傷組織的組培特性對黃淮麥區(qū)95種主流普通小麥栽培品種進(jìn)行聚類分析，將所有基因型劃分成7個類群，不同小麥基因型對農(nóng)桿菌侵染的敏感程度不同，其中有一個類群有較好的組培特性。

2 外植體類型選擇

許多外植體都被嘗試用于小麥組織培養(yǎng)再生體系，包括幼胚、成熟胚、盾片、幼穗、幼葉、分生組織、根尖等。截至目前，小麥幼胚是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的常用外植體，高效離體再生體系的建立是小麥遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵所在，外植體選擇是重要環(huán)節(jié)。小麥幼胚培養(yǎng)力高、植株再生能力強(qiáng)，被認(rèn)為是最理想的外植體材料，但小麥幼胚的取材受季節(jié)嚴(yán)格限制，而且存在著基因型單一、轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，并且農(nóng)桿菌侵染后導(dǎo)致小麥幼胚愈傷組織褐化死亡現(xiàn)象嚴(yán)重，一定程度制約了小麥基因工程育種和功能基因組研究的深入。

小麥成熟胚取材方便，不受季節(jié)、環(huán)境條件和植株發(fā)育狀況等因素的限制，個體間生理狀態(tài)一致，是開展小麥遺傳轉(zhuǎn)化較為方便的外植體。但是，小麥成熟胚植株再生率非常低，限制了成熟胚在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。但目前已有許多農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成熟胚的成功嘗試（Khurana等，2002； Patnaik等，2006； Ding等， 2009； Wang等， 2009）。

許多研究者用幼穗和花藥作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的外植體并獲得了成功。高春生（2006）等研究了在不同誘導(dǎo)和分化條件下幼穗愈傷組織誘導(dǎo)再生頻率及其差異，結(jié)果表明中部穗段是最好的外植體。陳梁鴻等（1999）利用基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼穗愈傷組織，將EPSPS基因轉(zhuǎn)入了小麥，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。趙愛菊等（2011）采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對小麥花藥愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明不同基因型的花藥培養(yǎng)力存在顯著差異，其中小麥品種石4185和冀5265是小麥花藥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的良好受體基因型。張艷敏等（2003）以石4185、石6365的花藥愈傷組織為受體，進(jìn)行了甜菜堿醛脫氫酶和膽堿氧化物酶等目的基因的轉(zhuǎn)化，PCR檢測到陽性抗性再生植株。Amoah等（2001）利用農(nóng)桿菌侵染小麥幼穗，研究了影響GUS基因在幼穗中表達(dá)的因素，但最終沒有獲得轉(zhuǎn)基因植株。黃益洪等（2002）分別以小麥幼穗和花藥為受體材料，利用不同農(nóng)桿菌菌株感染，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌菌系、小麥基因型和外植體對轉(zhuǎn)化效果均有影響，幼穗侵染后GUS基因瞬時表達(dá)率高于花藥。

多人研究結(jié)果表明農(nóng)桿菌可以侵染小麥植株（Hess等，1990； Mooney等， 1991；Langridge等，1992）。何道一等（2003）首次報道利用小麥開花期農(nóng)桿菌滴入小花的方法獲得了轉(zhuǎn)基因小麥植株。Zale等（2009）在小麥孕穗期將穗子從葉鞘中剝出，在農(nóng)桿菌菌液中浸泡1～2min，下一代經(jīng)巴龍霉素篩選和PCR、Southern檢測，證明獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

Razzaq等（2005）將萌芽的小麥種子剝?nèi)ヅ哐壳剩┞渡L點(diǎn)，細(xì)針刺傷生長點(diǎn)后利用農(nóng)桿菌侵染，獲得了陽性植株。Supartana等（2006）將小麥種子在水中浸泡1d，用蘸有農(nóng)桿菌的細(xì)針穿刺芽尖部位，2d后滅菌和春化處理，Southern雜交鑒定出5個農(nóng)藝性狀表現(xiàn)差異的轉(zhuǎn)基因株系。Zhao等（2006）以小麥莖尖為受體，獲得了帶有β-1，3-葡聚糖酶基因的抗白粉病植株。梁欣欣等（2007）利用農(nóng)桿菌感染小麥幼苗莖尖，經(jīng)在含有除草劑的培養(yǎng)基上篩選得到了抗性植株，進(jìn)一步對抗性植株進(jìn)行了PCR檢測。楊波等（2008）對不同苗齡小麥幼苗莖尖部位進(jìn)行刺傷后侵染處理30min時，其莖尖uidA基因瞬時表達(dá)率可達(dá)31%。

Risacher等（2009）描述了一種利用農(nóng)桿菌在植株上注射小麥未成熟籽粒的轉(zhuǎn)化方法，平均轉(zhuǎn)化率5%以上，30%～50%的轉(zhuǎn)化植株為單拷貝整合，轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀正常。

3 轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

3.1 建立高效轉(zhuǎn)化體系

影響轉(zhuǎn)化效率的因素有菌株染色體背景、共培養(yǎng)方式、侵染濃度和時間、共培養(yǎng)條件、受體類型和生理狀態(tài)、預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基、接種方式、感受態(tài)細(xì)胞保存條件、植物基因型、靶細(xì)胞生理狀態(tài)及對轉(zhuǎn)化植株的篩選程序、外植體處理、再生篩選體系等因素。在受體基因型和受體類型限定的情況下，篩選劑種類和劑量、預(yù)處理方式、侵染時間等成為轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的幾個重要影響因素。

Ding等（2009）利用含pBI121載體的LBA4404農(nóng)桿菌侵染小麥成熟胚，以組織化學(xué)染色檢測和分子檢測結(jié)果為依據(jù)，對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響因素進(jìn)行了探討，認(rèn)為干燥條件下共培養(yǎng)有利于農(nóng)桿菌對小麥細(xì)胞的侵染。張志清等（2006）使用川農(nóng)16、川麥32和川育16幼胚及愈傷組織，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化中幾個重要影響因素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明Kan不能抑制幼胚愈傷的生長，G418不能很好地抑制住幼胚生長，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)愈傷和繼代階段L-PPT合適的篩選濃度是2～3mg/L。

3.2 輔助措施提高轉(zhuǎn)化效率

對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行電擊，利用高壓脈沖作用使細(xì)胞膜上形成可逆性的瞬間通道，從而使外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞，操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高，電擊與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法結(jié)合使用可以提高轉(zhuǎn)化效率。接種時振蕩培養(yǎng)能打破細(xì)胞表面的氣泡，使農(nóng)桿菌與外植體的接觸面增大，有利于農(nóng)桿菌侵染。席夢利等（2007）以杉木莖段為外植體置于侵染液中浸泡進(jìn)行振蕩接種獲得了抗性芽。該方法在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的有效性尚未見報導(dǎo)，但可為提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率提供參考。于慧敏等（2005）利用GUS基因的瞬時表達(dá)研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷組織小麥遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明超聲波處理30s與適宜的菌液濃度、侵染時間等因素的作用下可使轉(zhuǎn)化效率得到明顯提高。綜合利用這些優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件，可使小麥的瞬時轉(zhuǎn)化效率提高3倍多。畢瑞明（2008）研究表明，在接種侵染過程中的負(fù)壓處理對小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)沒有顯著影響，但對小麥成熟胚的遺傳轉(zhuǎn)化卻有顯著影響，負(fù)壓處理后轉(zhuǎn)化率最高較對照組提高了10.90倍，最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)12.50%，同時能夠提高小麥成熟胚轉(zhuǎn)化效率。王旭明等（2012）報道了一種超聲波輔助的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將發(fā)芽的小麥種子經(jīng)超聲波處理20min后再經(jīng)農(nóng)桿菌浸染，4個小麥品種均得到抗性后代，而不經(jīng)超聲波處理的種子幾乎看不到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，而經(jīng)過超聲波處理的種子，幼苗基部的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成功。利用超聲波輔助的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化小麥能產(chǎn)生可遺傳的后代。

4 發(fā)展前景

目前已經(jīng)有多種目的基因以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到小麥中（薛哲勇等，2004；奚亞軍等，2004；畢瑞明等，2006；劉偉華，2006；李林等，2011；黃望啟，2012）。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法操作簡便、成本低、實(shí)用性強(qiáng)。此法可以轉(zhuǎn)移較大的DNA片段，而且所轉(zhuǎn)DNA很明確的為T-DNA左右邊界之間的序列。其基因插入的低拷貝性，有利于克服基因失活現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化比較溫和。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不需要原生質(zhì)體培養(yǎng)再生的過程，其轉(zhuǎn)化受體可以是不同的植物組織。以上諸多優(yōu)點(diǎn)，使農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成為最具競爭力的轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將代替基因槍法，成為轉(zhuǎn)基因研究的主體（周文麟等，1992）。基因槍法與農(nóng)桿菌法相結(jié)合的“Agrolistic”法，利用碳化硅纖維輔助的農(nóng)桿菌法，超聲波輔助的農(nóng)桿菌法以及農(nóng)桿菌法與病毒相結(jié)合的“Agroinfection”法等，都可不同程度提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用也必將越來越廣泛。

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S512.035.3

A

1003-4749（2014）10-0008-05

2014-08-18

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2012GB2D000266)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-3-2-35）

楊麗娟(1983-)，女，河南新鄭人，碩士，主要從事小麥分子遺傳育種工作。