光老化過程中皮膚成纖維細胞的生物學改變

楊清建, 劉天一, 畢 波

綜 述

光老化過程中皮膚成纖維細胞的生物學改變

楊清建, 劉天一, 畢 波

光老化； 成纖維細胞； 紫外線

皮膚的光老化是指皮膚長期受到日光照射所引起的損害，表現(xiàn)為皮膚粗糙、增厚、松弛，深而粗的皺紋，局部有過度的色素沉著或毛細血管擴張[1]，甚至可能出現(xiàn)各種良性或惡性腫瘤。光老化通常發(fā)生在長期暴露在日光的部位，如面部、頸部、耳朵、手背、前臂外側面和小腿等。目前普遍認為，紫外線(ultraviolet, UV)是造成皮膚光老化的重要因素[2]。實際上，日光中包含多種波長的光，其中UV是一種高能電磁波。UV按照其波長的長短，可以分為長波紫外線(UVA，波長320～400 nm)、中波紫外線(UVB，波長290～320 nm)和短波紫外線(UVC，波長<290 nm)。陽光中UV含量最多的是UVA(約占陽光的5.6%)，遠超過UVB的含量(約占陽光中的0.15%)[3]。UVA中光子的能量小，但是穿透力強，能夠達到真皮網(wǎng)狀層或更深。在皮膚白皙的人群中，日光中35%～50%的UVA，可以穿透真皮層，<10%的UVB，可以穿透真皮層[4]。UVB中光子能量大，但穿透力不強，通常大部分UVB被皮膚的表皮層吸收，僅很少部分到達真皮層。UVC因為大氣臭氧層的阻隔，到達皮膚的含量甚微。因此，筆者主要集中闡述UVA和UVB對皮膚的損傷及其機制。

1 UV輻照后成纖維細胞形態(tài)學變化

成纖維細胞是人皮膚結締組織中最重要的細胞成分。正常人的皮膚成纖維細胞數(shù)目多，胞體大，呈多突的紡錘形或星形的扁平細胞，細胞核呈規(guī)則的卵圓形，細胞輪廓不清，具有突起。電鏡下，其胞質可見豐富的粗面內質網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達的高爾基體，具有合成和分泌蛋白質的能力。成纖維細胞能夠分泌膠原蛋白原、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維等細胞外基質。在光老化皮膚結締組織中，由于成纖維細胞數(shù)量增加[5]，使其發(fā)生特征性的“星形”改變，在超微結構下會看到活躍的粗面內質網(wǎng)[6]。體外細胞培養(yǎng)時可發(fā)現(xiàn)，在經過UV輻照后，成纖維細胞體積變大，細胞形態(tài)由正常梭長型變?yōu)殇佌剐?。同時，輻照后的成纖維細胞β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)染色呈陽性[7-8]，表明細胞發(fā)生衰老。

2 成纖維細胞的細胞周期及凋亡變化

成纖維細胞在受UV輻照后，UVA輻照阻礙成纖維細胞的生長，甚至細胞死亡。給予皮膚成纖維細胞以25 J/cm2UVA輻照，會導致成纖維細胞的生存率下降。當體外培養(yǎng)的成纖維細胞經過UVA的輻照后，細胞數(shù)目將發(fā)生明顯變化[9]。給予5 J/cm2的UVA輻照量，24 h后會造成約10%的成纖維細胞死亡；若給予10 J/cm2的輻射量，則會造成50%的成纖維細胞死亡；繼續(xù)加大輻照劑量，達到20 J/cm2時，24 h后則僅有20%的成纖維細胞存活。

同時發(fā)現(xiàn)，經UV輻照后，成纖維細胞周期分布發(fā)生明顯改變。兒童成纖維細胞受輻照后，分布在G1期的比例增多，由輻照前的35%上升至53%，并伴隨著分布在S期的比例，由57%下降至34%，而分布在G2-M期沒有顯著變化[9]。在經UV輻照后成人和老年人的成纖維細胞以分布在G2-M期的細胞增多為特點。成人由4%上升至14%，老年人由8%上升至12%。值得注意的是，經5 J/cm2UVA輻照48 h之后，細胞群停留在sub G0-G1階段的成纖維細胞不足1%[9]，表明細胞未發(fā)生凋亡。UV導致的細胞衰老和凋亡在表皮更加常見，這是由于表皮吸收了大部分的UV光子能量，相同的過程也可能影響上層真皮。成纖維細胞在急性DNA損傷后或多次細胞分裂后，通常表現(xiàn)為衰老而不是凋亡。

許多針對細胞周期改變及凋亡的研究證實，UV輻照激活NF-κB轉錄因子通路，誘導促炎細胞因子如IL-1，IL-6，血管內皮生長因子VEGF和TNF-β的表達，參與免疫調節(jié)和細胞周期[5]。此外,盡管NF-κB通常被看做是生存因子(survival factor)，它在細胞阻滯和凋亡過程中也起到重要作用。Lee等[10]研究表明，NF-κB-p53通路在UVA誘導的成纖維細胞死亡及G1期阻滯中起關鍵性作用。NF-κB通過與其他的核因子結合而發(fā)揮功能。NF-κB調節(jié)Noxa表達在p53介導的細胞凋亡中是關鍵分子。此外,NF-κB復合物在與p53、BCL-3作用過程中，轉變?yōu)樾纬蒒F-κB-HDAC1復合物，這種復合物會抑制細胞周期素D1的表達，導致細胞在G1期阻滯和細胞死亡[10]。

3 細胞外基質合成及降解變化

3.1 UV輻照導致成纖維細胞膠原蛋白合成減少 UV照射損害膠原蛋白合成,主要是通過下調Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白基因的表達，使光老化皮膚合成膠原蛋白減少[11-13]。膠原蛋白基因表達受轉錄因子激活蛋白(AP-1)的調控[14]。c-jun和c-fos是轉錄因子AP-1的組成成分。由于c-fos在人體中持續(xù)表達，c-jun的表達對于AP-1的增加起主要作用。UV導致Jun-氨基端激酶(JNK)激活使c-jun合成增加[15]，以及ERK激活使c-fos合成增加，并使轉錄因子激活蛋白(AP-1)增加。AP-1通過2個機制導致Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白原合成減少：①AP-1通過綁定并螯合轉錄復合體的一部分而干擾膠原蛋白原的合成；②轉錄因子AP-1阻斷轉錄生長因子(TGF-β)發(fā)揮作用，通過螯合其中一種信號轉導蛋白而減少前膠原蛋白的合成[16-17]。 另一方面，UV使成纖維細胞Ⅱ型TGF-β受體表達減少，使TGF-β信號轉導過程受阻，從而使膠原蛋白原的合成受阻。Ⅱ型TGF-β受體mRNA在UV輻照的皮膚中的表達較受保護的皮膚表達量少[18]，而Ⅰ型TGF-β受體的表達卻不受年齡或者UV的影響[15]。Ⅱ型TGF-β受體表達降低使細胞因子TGF-β與成纖維細胞結合能力降低，導致成纖維細胞對TGF-β的反應程度降低，并導致細胞內的效應器(Smad2、Smad3、Smad4)不能夠充分磷酸化，使之不能易位進入細胞核，從而影響目標基因的轉錄。 總之，UV輻照導致的Ⅱ型 TGF-β受體數(shù)量減少及AP-1的增加共同作用使得成纖維細胞膠原蛋白原基因表達受阻，膠原蛋白原合成減少。

3.2 UV輻照使細胞外基質降解增加 在光老化過程中，成纖維細胞的再生能力下降，并伴隨著膠原合成能力的下降，但其分泌降解細胞外基質金屬蛋白酶(MMPs)的能力卻在增加[19]。UV誘導產生的MMPs，通過兩種機制[16]損害基質膠原蛋白：①直接作用于基質中的膠原蛋白，使其降解；②通過基質中MMPs降解膠原蛋白產生的中間產物，間接抑制膠原蛋白原的合成。MMPs基因表達亦受AP-1調控[2]。AP-1合成增多不僅可以減少膠原蛋白原的合成，也會使成纖維細胞合成金屬蛋白酶(MMPs)增加。Florence Hazane在研究UVA輻照對成纖維細胞基因表達的影響的實驗中表明，MMP-2(gelatinase)和MMP-3(stromelysin-1)基因一直能夠被檢測到，MMP-1(collagenase-1)基因表達亦增加[20]。在所有的金屬蛋白酶中，MMP-1是降解膠原蛋白活性最高的酶，其次是MMP-8(neutrophil collagenase)和MMP-13(collagenase-3)。其中，MMP-2和MMP-9(gelatinase B)不能直接作用于完整的膠原蛋白。以Ⅰ型膠原蛋白為例，當MMP-1和MMP-9一起使用時，Ⅰ型膠原蛋白將降解為短肽，而有趣的是，這些短肽不能抑制膠原蛋白原的合成，僅大分子量的Ⅰ型膠原蛋白的碎片能抑制膠原蛋白原的合成[16]。

4 UV輻射造成成纖維細胞改變的相關機制研究

4.1 成纖維細胞DNA損傷 以往認為皮膚成纖維細胞受到UV輻照后，造成的DNA損傷是由于DNA氧化而引起。但近期研究認為，細胞受UV輻照后的DNA損傷，是由于DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶堿基發(fā)生共價結合，生成嘧啶二聚體而導致[9,21-23]。其中，UVB輻照后主要使DNA形成胸苷酸二聚體，而UVA輻照后經過間接的氧化損傷DNA堿基的形成8-oxodGuo，導致基因突變。嘧啶二聚體的形成率約為8-oxodGuo形成率的4倍[9]。當DNA的損傷超過細胞DNA修復能力時，細胞就會衰老或凋亡[4]。

DNA聚合酶不能復制染色體末端的部分堿基,即染色體在每一輪的細胞分裂后都會縮短。在經過有限次數(shù)的細胞分裂以后，端粒將縮短至臨界長度。這時，成纖維細胞將失去分裂能力，進入衰老狀態(tài)。暴露在陽光中的皮膚，UV輻射會造成DNA損傷，并加速端粒的縮短[24-26]。Gilchrest等的研究表明[27]，在經過UV輻照后，端粒較基因組的其他部位產生的損害更大。端粒DNA的損傷通過ATM、ATR、p53以及它們的下游作用元件進行信號轉導。通過這些信號轉導導致成纖維細胞衰老。端?？s短的過程中產生的富含鳥嘌呤的單鏈碎片引起p53依賴的細胞周期阻滯[24,28]。

DNA損傷后，細胞也有應對損傷的修復機制。在應對UVA導致的DNA損傷的修復過程中，至少存在兩種修復機制，一種是應對較大損傷的核苷酸切除修復(nucleotide excision repair, NER)途徑；另外一種是應對主要由ROS導致的較小損傷的堿基切除修復(base excision repair，BER)途徑[9]。DNA的修復體系，特別是BER機制，能夠修復被氧化堿基、脫堿基位點以及DNA單鏈斷裂等。當給予5 J/cm2的UVA輻照后，成纖維細胞經過30 min的時間進行修復，大約修復15%的尾DNA損傷；經過60 min的修復，20%～40%的尾DNA被修復；經過4 h的修復，修復的尾DNA比例與60 min時相比，其差異無統(tǒng)計學意義；經過6 h的修復，成人成纖維細胞仍有40%～80%的尾DNA損傷，而老年組殘留損傷比例顯著高于兒童組(r=0.705,P<0.01)[9]。這些數(shù)據(jù)表明，DNA損傷修復的比例很低，老年人DNA損傷后修復更加困難。而盡管UVB導致DNA損傷，致使DNA中存留著大量的環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPDs)，但這并不影響遺傳物質的復制，當細胞中DNA損傷積累到一定量時，細胞就會進入細胞周期阻滯或凋亡[9]。

4.2 活性氧損傷 細胞內生色團或者光敏物質吸收UV的光子能量，并將之轉化為化學能量，造成氧化應激[29]。DNA、卟啉類化合物、尿刊酸、芳香族氨基酸等，它們吸收UV光子能量并與分子氧發(fā)生反應，產生氧自由基，如超氧化物、羥基自由基、超氧陰離子自由基，以及過氧化氫和單線氧等，統(tǒng)稱為活性氧(ROS)[30]。

光老化過程中產生過量的ROS主要來源于線粒體氧化磷酸化過程。在線粒體電子傳遞鏈生成ATP同時產生的ROS[5,31]，能夠損傷線粒體DNA(mtDNA)[32]。有體外實驗表明，成纖維細胞線粒體DNA突變，是由UVA輻照產生的單線氧的氧化機制導致[33]。線粒體DNA突變最常發(fā)生的是4977個堿基對的缺失，又稱為“共同缺失”(common deletion)，這種突變常發(fā)生在光老化皮膚中，發(fā)生概率約為受保護皮膚的10倍[4,33]。通過分析表皮層和真皮層細胞中線粒體DNA突變情況，表明線粒體DNA“共同缺失”幾乎僅存在于皮膚的真皮層細胞里[34]，由此佐證了這一理論。這種突變導致ROS的進一步增多，使細胞產生能量減少。線粒體中的ROS泄露進入細胞質及細胞外，損傷許多大分子物質，如蛋白質、脂質等，對皮膚造成進一步損傷。

成纖維細胞在經過UV輻照后，在造成細胞損傷的同時，也啟動其自身的防御功能。體內有多種防御系統(tǒng)以保護細胞大分子對抗光氧化應激[20]。比如，抗氧化分子，如谷胱甘肽、維生素等可以清除自由基，抗氧化酶，如超氧化物氧化酶(SOD)與超氧化物陰離子(O2-)發(fā)生反應，過氧化物酶與H2O2發(fā)生反應等，這些抗氧化物質對于細胞中和活性氧(ROS)的細胞毒性作用具有重要意義。研究表明，細胞對抗氧化應激的過程常常伴隨著基因表達的變化，如TXN、GSS和APEX等調節(jié)細胞氧化還原反應狀態(tài)的基因，在UVA輻照后氧化應激誘導下表達減少[20]。當細胞產生的活性氧超過細胞消除活性氧的能力時，就會造成氧化應激。嚴重的氧化應激會導致細胞凋亡或變性壞死，而有趣的是在漫長的進化過程中，細胞形成了高度有序的應對亞致死量氧化應激的途徑。

4.3 UV影響信號轉導通路 UV輻照使成纖維細胞損害的細胞機制包括細胞表面受體、蛋白酶信號轉導通路、轉錄因子和賦予皮膚張力和彈性的蛋白質合成及降解的酶等[16]。通過有核細胞和去核細胞的研究表明，UV輻射可導致核依賴的信息轉導和非核依賴的信息轉導[30]。核依賴的細胞信息轉導通過細胞核中的大分子物質，主要為DNA直接吸收UV中能量而引起，造成DNA損傷，繼而引起DNA的錯誤修復。非核依賴性信號轉導則發(fā)生在細胞膜，通過細胞表面生長因子及細胞因子受體的作用介導細胞信號轉導[30]。

ROS誘導的細胞反應機制類似于細胞外生理激動劑作用于細胞膜時產生的信號轉導過程[35]。這類似于配體激活細胞膜表面生長因子和細胞因子受體時的反應[35]。UV照射充當?shù)姆杭觿е碌倪@種生物學多型性(pleiotypic)效應，被稱為“哺乳動物UV反應”[36]。UV輻射激活的細胞傳導通路和生長因子或者細胞因子激活的細胞傳導通路具有相同的分子組成。UV可以通過產生ROS激活多種細胞表面的生長因子受體家族[5,30]，比如表皮生長因子受體(EGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)、胰島素受體(IR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)等；細胞因子如TNF-a, IL-1的受體及Fas的受體也以一種細胞膜依賴但非配體依賴的方式激活[5]。一些非受體型酪氨酸激酶(PTK)包括Src、 ZAP-70、 Pyk2 和Btk等，也能被UV輻射激活[30]。此外，UV輻照會下調Ⅱ型TGF-β受體的表達，以致TGF-β信號轉導通路受損(見3.1)。

UV激活不同的細胞表面受體導致與之對應的信號轉導通路激活。如細胞內信號轉導分子通過絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族，如ERK(extracellular regulated kinase)、P38-MAPK、及JNK/SAPK (c-jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase)等3個亞家族的MAPK級聯(lián)激活轉導以及通過PI-3 激酶/AKT(PI-3 kinase/AKT)途徑和NF-κB途徑激活[5]。在成纖維細胞中，MAPK級聯(lián)激活是多種信號通路的中心。比如，EGFR等多種細胞因子受體均需要ERK的活化來完成信號轉導過程，調節(jié)細胞增殖；JNK通路，連同ERK激活是增加MMPs分泌的重要通路[15]，JNK激活導致c-jun表達增多，它連同c-fos形成AP-1，調節(jié)MMP基因轉錄[15,37]。UV輻照致使細胞生長因子受體激活的同時，也會激活PI-3 激酶/AKT。AKT能夠與未磷酸化的轉錄因子smad3結合[30]，結合后阻礙其磷酸化和隨后的易位入核的過程，進而影響膠原蛋白原的合成。UV激活NF-κB途徑的機制與細胞因子激活NF-κB途徑的機制不同。有證據(jù)表明，UV輻照通過抑制NF-κB的抑制物IκBα的合成[38]，使IκBα合成減少，導致NF-κB途徑激活。UV激活上述各種信號轉導通路導致眾多的轉錄因子激活，進而調節(jié)目標基因的表達。

5 小結

皮膚在經過多次亞致死量的UV輻照后，造成應激誘導早衰。而在這個過程中，在所有影響皮膚改變的眾多細胞因素中，成纖維細胞起著最重要的作用。UV可以直接造成成纖維細胞DNA損傷，生成大量ROS，激活細胞信號轉導通路，影響成纖維細胞的生長、增殖、衰老、凋亡等。UV造成皮膚光老化的具體機制，尚未闡明，目前,人們將造成光老化的一部分原因歸結為DNA損傷，一部分原因歸結為產生ROS的氧化機制，以及ROS激活細胞信號轉導通路引起的基因表達改變。在光老化過程中，UV激活一系列的細胞信號轉導通路，而具體哪些細胞轉導通路在光老化過程起主要作用，尚未有定論。目前的研究以動物模型多見，人和動物的信號轉導通路可能存在差異，所以在動物身上得到的結果，可能不能類推到人類。今后我們將進一步研究UV導致光老化的具體機制，對導致膠原蛋白原合成減少和導致細胞外基質降解的基質金屬蛋白酶合成增多進行深入地研究。

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國家自然科學基金資助項目(81272125；81301642)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學科帶頭人培養(yǎng)計劃項目資助(XBR2011033)

200040 上海，復旦大學附屬華東醫(yī)院 整形外科

楊清建(1987-),男，山東曹縣人，碩士研究生.

劉天一，200040，復旦大學附屬華東醫(yī)院 整形外科，電子信箱：tianyiliucn@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.012

2014-03-11)