脂肪源性干細胞向心肌細胞誘導分化的研究進展

石園園 綜述 楊向群 審校

·綜述·

脂肪源性干細胞向心肌細胞誘導分化的研究進展

石園園 綜述 楊向群 審校

脂肪源性干細胞因具有生物學特性穩(wěn)定、來源廣泛、取材方便、數(shù)量充足、易于培養(yǎng)擴增的優(yōu)點，且在特定的誘導條件下可以分化為心肌細胞，有望成為細胞治療的理想來源。誘導方法的選擇，影響分化因素的研究已成為了細胞治療領域研究的熱點。本文就脂肪源性干細胞向心肌細胞誘導分化的方法和機制的研究進展進行綜述。

脂肪源性干細胞誘導心肌細胞分化

2001年，Zuk等[1]首次從脂肪組織中成功分離出脂肪源性干細胞（Adipose-derived stem cells，ASCs），發(fā)現(xiàn)其具有多向分化潛能，在特異性誘導因子的作用下，可以向特定類型的細胞分化[2]。隨后，Rangappa等[3]首次證實了腹部皮下白色脂肪的ASCs在5-氮胞苷（5-azacytidine，5-AZA）的誘導下可向心肌細胞分化。心肌細胞的再生能力低下，不能夠有效補充大面積心肌梗死所造成的心肌細胞丟失，致使梗死部位瘢痕形成及心肌收縮力降低和電傳導系統(tǒng)改變。近年來，細胞治療已經(jīng)作為一種新的療法被應用于心肌梗死后的修復。研究表明，植入心肌損傷模型的ASCs可能通過在梗死區(qū)分化為大量心肌細胞，或旁分泌方式刺激血管新生等機制來改善心肌的功能[4]。相比于其他干細胞，如胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞等，ASCs具有生物學特性穩(wěn)定、來源廣泛、取材方便、數(shù)量充足且易于培養(yǎng)擴增的優(yōu)點，有望成為細胞治療的理想來源[5]。誘導ASCs向心肌細胞定向分化已成為細胞治療研究領域的熱點?，F(xiàn)就ASCs向心肌細胞誘導分化的方法和機制進行綜述。

1 體外誘導ASCs向心肌細胞分化的方法及機制

1.1 5-AZA誘導法

繼1999年Makino等[6]首次將5-AZA應用于骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cell,BMSCs）向心肌細胞的誘導分化之后，5-AZA被廣泛應用于誘導多種細胞向心肌細胞的分化，包括胚胎干細胞、P19細胞以及ASCs等。5-AZA是一種DNA甲基轉移酶抑制劑。DNA的甲基化與基因的表達、染色體的修飾和失活、基因組印跡和內源性的基因沉默相關[7]。干細胞多能性及自我更新能力的保持也與DNA的甲基化密切相關。與細胞分化相關的基因在低甲基化時被激活，高甲基化時被抑制[8]。5-AZA有可能通過去甲基化作用激活ASCs對α-重鏈肌球蛋白、β-重鏈肌球蛋白、肌鈣蛋白、GATA-4、肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC-2v）、連接蛋白43及心鈉素等心肌特異性基因的表達。

Rangappa等[3]使用免疫熒光檢測到了分化細胞對肌球蛋白重鏈、肌動蛋白及肌鈣蛋白I（Cardiac troponin T，cTnT）的表達，并認為5-AZA會誘導ASCs進入快速增殖的不穩(wěn)定狀態(tài)，一旦耗盡增殖潛能，這些瞬間增多的干細胞就會退出增殖周期，變成終末分化的心肌細胞，并轉變其端粒末端轉移酶基因。2005年，Strem等[9]使用相同的方法成功誘導了鼠腹股溝來源的ASCs向心肌細胞的分化，并通過RT-PCR分析顯示出了分化細胞對MLC-2v、GATA-4、α-重鏈肌球蛋白及β-重鏈肌球蛋白等心肌特異性標志表達的上調。Carvalho等[10]在所有的分化細胞中均檢測到了橫紋肌肌動蛋白和連接蛋白43的表達。

雖然在很多的研究中5-AZA都成功誘導了ASCs向心肌細胞的分化，但是這些ASCs大多是鼠或兔來源的，在對hASCs誘導分化的研究中，5-AZA的誘導作用是存在爭議的。Lee等[11]使用5-AZA誘導處理人腹部皮下白色脂肪的ASCs，既沒有觀察到自主跳動的細胞，也沒有檢測到心肌細胞特異性標志的表達，認為單純的5-AZA不足以誘導hASCs向心肌細胞的分化。2010年，Choi等[12]報道5-AZA誘導hASCs向心肌細胞的分化具有傳代的限制性，僅在第4代hASCs分化來的細胞上檢測到了心肌特異性標志Nkx2.5、肌鈣蛋白Ⅰ和α-輔肌動蛋白的表達。通過對ASCs啟動子上的一段長2.5 Kb區(qū)域的檢測，發(fā)現(xiàn)大部分心肌特異性基因并沒有被甲基化，ASCs向心肌細胞分化的潛能并沒有被啟動子的甲基化所阻斷，這些啟動子并不直接被5-AZA的去甲基化影響。隨后，有研究報道，使用5-AZA誘導第5代和第10代的hASCs，也僅觀察到分化細胞形成肌管樣結構，而且定量PCR分析顯示，分化細胞中大部分心源性基因的表達是下調的[13]。

此外，關于5-AZA的誘導條件也存在一定爭議。首先是5-AZA的使用濃度，Rangappa等[3]發(fā)現(xiàn)9 μmol/L的5-AZA誘導結果最佳；Martin-Rendon等[14]報道5 μmol/L或10 μmol/L的5-AZA誘導結果并沒有明顯差別；還有研究表明，3 μmol/L的5-AZA已經(jīng)足以誘導ASCs向心肌細胞的分化[15-16]。其次是誘導時長，大多研究支持24 h是最佳的誘導時間[3，11，14]。增加誘導處理時間并不能提高ASCs向心肌細胞分化的轉化率，過長或反復誘導則可能會增強5-AZA對細胞的遺傳毒性，誘發(fā)細胞凋亡[9，12]。

1.2 心肌細胞提取液誘導法

研究發(fā)現(xiàn)，在體外，一種成體細胞的提取液可能通過促進細胞核攝入轉錄調節(jié)因子和誘導染色體重建等機制，改變另一種細胞的分化方向[17-18]。2004年，Gaustad等[19]使用大鼠心肌細胞質核提取液，成功地誘導了第4代hASCs向心肌細胞分化，免疫熒光檢測到部分分化細胞橫紋肌肌動蛋白、縫隙連接蛋白43等心肌特異性標志的表達。該研究認為，ASCs可能通過攝取提取液中的分化因子，改變了核內染色體的結構，從而誘導被抑制基因的表達，但是在ASCs的表面并沒有檢測到相關的受體結構。提取液加熱后對ASCs的誘導分化作用會消失，提示誘導作用可能和熱不穩(wěn)定蛋白相關。研究發(fā)現(xiàn)，小的非編碼核RNA也可能與細胞的分化或基因的重組有關[20-21]。Perán等[22]使用人心房細胞的質核提取液誘導hASCs，發(fā)現(xiàn)誘導組細胞的活性僅為對照組細胞的15%～20%，免疫印跡分析顯示，存活的分化細胞中有73%～80%都能表達心肌細胞標志，包括橫紋肌肌動蛋白、cTnT、cTnI、連接蛋白43及結蛋白等，并呈現(xiàn)出形態(tài)上的特征性變化，包括體積的增大、纖維樣變和雙核變等。RT-PCR檢測到的心肌相關性基因，也進一步證實了免疫印跡分析的結果。

1.3 甲基纖維素培養(yǎng)基誘導法

2004年，Planat-Bénard等[23]首次證實了取自鼠腹股溝和肩胛部的ASCs可以自發(fā)地分化為心肌細胞。分化細胞間存在緊密連接，并形成了肌管樣結構。GATA-4、Nkx2.5、心室和心房MLC-2v和MLC-2a等心源性基因及分泌物心房鈉尿肽（Atrial natriuretic peptide，ANP）的檢測均為陽性。相關的機制尚未清楚，但目前有許多研究認為細胞因子和化學誘導劑對這種分化具有促進作用。Song等[24]發(fā)現(xiàn)，血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）可能通過旁分泌機制促進這種分化。在培養(yǎng)基中添加VEGF可以顯著增加α-MHC、cTnI和Nkx2.5的表達，抗VEGF抗體則可以阻斷cTnT的表達。Palpant等[25]使用相似的培養(yǎng)基培養(yǎng)取自小鼠肩胛區(qū)的ASCs，也得到了一致的結果。蛋白質印跡分析顯示出cTnI的蛋白質亞型從慢骨骼肌肌鈣蛋白Ⅰ向成體心肌肌鈣蛋白Ⅰ的演變過程，進一步證實了ASCs具有分化并發(fā)育為成熟心肌細胞的潛能。該研究還發(fā)現(xiàn)，重組Wnt蛋白也可通過影響細胞的信號轉導通路，來促進ASCs向心肌細胞的分化。但有研究認為，這些結果可能只是由于心肌蛋白的被動吸收或外源性因子誘導的暫時性轉錄，而非ASCs的真正分化[11]。

1.4 與心肌細胞共培養(yǎng)法

2010年，Choi等[12]分別使用直接接觸共培養(yǎng)法和間接接觸共培養(yǎng)法，來培養(yǎng)hASCs和新生鼠的心肌細胞。直接接觸共培養(yǎng)法成功誘導了hASCs向心肌細胞的分化，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，分化細胞對人心肌肌動蛋白mRNA的表達具有時間依賴性。間接接觸培養(yǎng)組卻沒有檢測到人心肌肌動蛋白mRNA水平的顯著變化。該研究認為，細胞的直接接觸是誘導ASCs分化的關鍵，可能存在3種機制：①鄰近的鼠心肌細胞的機械性伸長；②通過細胞膜接觸的潛在性的電信號傳導；③融合因子通過縫隙連接從鼠心肌細胞傳遞至ASCs。同年，Jin等[26]將鼠ASCs與新生鼠的心肌細胞進行間接接觸培養(yǎng)，得出了相同的結果。但在加入淫羊藿甙（Icaria，ICA）的間接接觸培養(yǎng)組，卻檢測到了分化細胞對心肌特異性基因，包括轉錄因子Nkx2.5、GATA-4、MLC-2v、α-橫紋肌肌動蛋白和cTnT等的表達。研究發(fā)現(xiàn)，ICA可通過信號調節(jié)蛋白激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號轉導通路對細胞的生長和分化進行調節(jié)[27-31]。EPK的抑制劑PD98059可以部分抑制ICA的誘導作用。對細胞周期的調節(jié)作用可能是其介導分化的關鍵所在，但并不是唯一的作用機制，腫瘤抑制基因也可能與之相關。隨后，Cai等[32]的研究再次證實了直接接觸共培養(yǎng)法誘導ASCs向心肌細胞分化的作用。該研究還發(fā)現(xiàn)，移植前在體外進行ASCs與心肌細胞的共培養(yǎng)處理可以提高體內分化細胞的cTnT表達陽性率。Behfar等[33]的報道同樣表明，在慢性心肌損傷模型上移植經(jīng)共培養(yǎng)處理過的ASCs，對心肌功能和結構的改善都要優(yōu)于直接注射自然狀態(tài)下的ASCs。雖然其中的機制仍不清楚，但是與心肌細胞共培養(yǎng)可以形成一個相似于心臟的微環(huán)境，心肌細胞也可以通過分泌細胞因子、激素或一些可溶性因子調節(jié)信號通路從而誘導ASCs向心肌細胞的分化。

2 分化細胞的收縮或自主搏動現(xiàn)象

在一些誘導ASCs向心肌細胞分化的研究中，不僅檢測到了心肌特異性標志的表達，還觀察到了分化細胞的收縮活動或自主搏動現(xiàn)象。這種現(xiàn)象的發(fā)生機制尚未研究清楚，但可能與誘導方法的選擇或ASCs的組織來源相關。研究表明，上述誘導方法均有可能誘導ASCs分化為收縮或自主搏動的心肌細胞。但同一種方法中誘導物濃度或誘導時間的差異可能導致結果的不同。在5-AZA誘導法中，僅有Rangappa等[3]在培養(yǎng)的第3周觀察到了分化細胞的自主搏動，實驗過程中用到的是9 μmol/L的5-AZA，誘導時長24 h。Gaustad等[19]使用4～6周齡的大鼠心肌細胞提取液，成功誘導了hASCs向自主搏動的心肌細胞分化。其他使用人心肌細胞提取液或新生鼠細胞提取液的研究中，均沒有觀察到收縮或自主搏動現(xiàn)象。甲基纖維素培養(yǎng)基法誘導的分化細胞均發(fā)生了收縮[23-25]。Choi等[12]的研究中使用hASCs與新生鼠心肌細胞直接接觸共培養(yǎng)法，誘導的分化細胞也發(fā)生了自主搏動。脂肪組織分為棕色脂肪和白色脂肪，動物肩胛區(qū)和腹股溝處的脂肪組織中均含有棕色脂肪成分。有研究報道，棕色脂肪來源的ASCs具有較高的成心肌分化能力，且可在體外自發(fā)分化為有功能的心肌細胞[34]。上述甲基纖維素培養(yǎng)基法誘導實驗中的ASCs均來源于小鼠的腹股溝和肩胛部位，而另外三種方法中分化為能自主搏動心肌細胞的ASCs均來自于白色脂肪組織。此外，Choi等[12]還認為，分化細胞的收縮能力取決于接種細胞的密度，當細胞密度小于5×104時，細胞間距過大，可導致細胞不能收縮。

關于自主搏動的分化細胞是否是起搏細胞也需要進一步的研究證實。從起搏細胞的定義出發(fā)，這些分化細胞能夠自動產生節(jié)律性興奮，發(fā)生自主搏動，就應該是起搏細胞。Planat-Bénard等[23]對分化細胞進行超微結構的分析，認為這些分化細胞有可能是心室肌細胞（MLC-2a和連接蛋白43陽性）、心房肌細胞（MCL-2a、ANP和連接蛋白40陽性）及起搏細胞（介導自主收縮）的混合。該研究通過電流鉗檢測到了細胞的自發(fā)膜電位變化，藥物試驗發(fā)現(xiàn)分化細胞可以對腎上腺素能和膽堿能藥物作出相適應的反應，這些證據(jù)進一步證實了起搏細胞的存在。Palpant等[25]使用指示劑FURA2AM處理分化細胞，檢測到了與細胞收縮相一致的鈣瞬變。Choi等[12]也同樣檢測到了鈣瞬變，并發(fā)現(xiàn)分化細胞的鈣瞬變和收縮節(jié)律與周圍的大鼠心肌細胞相一致。該研究還通過細胞標記的方法，證實了分化細胞與鼠心肌細胞間縫隙連接的存在。縫隙連接允許心肌細胞間的電偶聯(lián)，形成細胞間電興奮波（同步收縮的基礎）的傳導通路[35]，來自收縮的鼠心肌細胞的電刺激可能在誘導ASCs向心肌細胞分化的過程中起到了重要作用。

3 問題和展望

隨著人們對ASCs生物學特性認識的加深，以及生物實驗技術的發(fā)展，ASCs在未來干細胞治療中的臨床應用將具備無限可能。但是，現(xiàn)階段ASCs的誘導方法還存在很大的缺陷，幾乎所有的誘導結果都存在著低轉化率的問題；在共培養(yǎng)誘導法中，異種細胞間會存在免疫排斥作用，應用到臨床上時將會需要大量的自體心肌細胞，而這對于經(jīng)歷過心衰的患者幾乎是不可能的。誘導和分化的機制也待更深層次的研究和探討，使用心肌細胞提取液或甲基纖維素培養(yǎng)基誘導時誘導物的最終去向，以及分化細胞的功能是否持久及其持續(xù)時長都不清楚。分化細胞起搏特性的驗證，也將會對生物起搏器的研制產生深遠的影響。

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Differentiation of Adipose-derived Stem Cells into Cardiomyocytes

SHI Yuanyuan1,YANG Xiangqun2.

1 Company 2 of Clinical Medicine;Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;2 Department of Human Anatomy, Research Center of Regenerative Medicine,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.Corresponding author:YANG Xiangqun(E-mail:yangxgq@smmu.edu.cn).

【Summary】The use of stem cells in the treatment of myocardial infarct has been strongly pursued in recent years.Due to their availability,feasibility,plasticity,and their potential to differentiate into cardiomyocytes at specific media,adiposederived stem cells(ASCs)have become an ideal source of donor cells.A significant effort has gone into elucidating which factors and techniques influence this differentiation.The methods and mechanisms of differentiation of ASCs into cardiomyocytes were reviewed in this paper.

Adult mesenchymal stem cells;Induction;Cardiomyocytes;Differentiation

Q813.1+1

B

1673－0364（2014）06－0351－04

2014年3月16日；

2014年5月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.014

國家自然科學基金（31170934）。

200433上海市第二軍醫(yī)大學學員旅學員二隊（石園園）；第二軍醫(yī)大學解剖學教研室、再生醫(yī)學研究中心（楊向群）。

楊向群（E-mail：yangxq@smmu.edu.cn）。