組織工程技術(shù)修復(fù)下頜骨骨缺損的研究進展*

王莉莉 劉洪臣

下頜骨是面部下1/ 3 形態(tài)的骨性基礎(chǔ)，參與語言、咀嚼、吞咽等重要功能。下頜骨常因腫瘤切除、創(chuàng)傷等因素常造成大面積下頜骨缺損，導(dǎo)致面部畸形和相應(yīng)功能障礙。 下頜骨缺損修復(fù)的方法主要是利用組織或材料對缺損進行重建。目前，重建的方法很多，包括自體骨移植、牽張成骨、同種異體骨移植等。但是不同的修復(fù)重建方法都有各自的缺點。自體骨移植很難達到下頜骨理想的形態(tài)，而且?guī)碜陨頁p傷，即供骨區(qū)并發(fā)癥[1，2]；牽張成骨周期較長，病人難以耐受且易感染；異體骨移植主要是免疫排斥反應(yīng)，再血管化和成骨速度慢[3]。組織工程骨的主要優(yōu)勢在于其自體細胞來源所帶來的低感染性和低致癌率，臨床應(yīng)用實踐證明，生物衍生組織工程骨有良好的成骨能力，未見明顯排斥反應(yīng)及并發(fā)癥。

1. 支架材料

常用于組織工程研究的支架材料分為無機和有機兩類。有機類包括天然材料、合成的可生物降解材料及脫鈣骨等。常用的天然材料有：纖維蛋白、膠原、藻酸鹽等。這些材料的優(yōu)點是組織相容性好，可作為種子細胞和生長因子的良好載體；缺點是材料柔軟、不能獨立充當支架材料。人工合成的可生物降解材料主要為聚酯類，可用于下頜骨缺損修復(fù)實驗研究的有：聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PLA)及共聚物(PLGA)等[4-7]。聚乳酸因自身機械強度不足，常被制作成網(wǎng)狀支架結(jié)合自體松質(zhì)骨或羥基磷灰石顆粒使用。這類材料的缺點包括：聚合物的降解產(chǎn)物易引起局部無菌性炎癥、局部PH 值改變易導(dǎo)致種子細胞死亡，故不是理想的支架材料。脫鈣骨來源于同種異體或異種骨，經(jīng)脫鈣及脫脂處理后，具有良好的生物相容性及立體多孔結(jié)構(gòu)，有利于種子細胞的黏附和生長。缺點是力學(xué)強度不足，不能獨立充當大塊下頜骨重建的支架，只能用作小缺損的填充治療研究。

目前用于組織工程下頜骨支架研究的多為無機類材料。這類材料包括羥基磷灰石(HA)、珊瑚、磷酸鈣陶瓷、骨水泥、硫酸鈣及生物活性玻璃等。β-磷酸三鈣(β-TCP)是使用最多的支架材料，植入體內(nèi)可完全降解和吸收，具有良好的骨傳導(dǎo)性。其缺點是該材料太脆弱，生物力學(xué)強度不足。羥基磷灰石組成的生物陶瓷具有高負荷力，但吸收非常緩慢，在骨痂形成幾年后仍存留在缺損區(qū)。珊瑚具有良好的生物相容性和可吸收性，但其質(zhì)地太脆，缺乏柔韌性且塑形困難，因此也不是非常理想的支架材料[8-12]。

隨著對支架材料研究的進展，納米羥基磷灰石進入學(xué)者們的視線，納米羥基磷灰石獨特的結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，同時在植入人體后同骨表面形成很強的化學(xué)鍵結(jié)合，能很好的輔助骨的生長，成為學(xué)者們很感興趣的支架材料。但是單獨使用時不易成型且脆性較大，機械強度不足。因此，學(xué)者們又開始了對納米羥基磷灰石復(fù)合材料的研究。王云等[13]總結(jié)了羥基磷灰石與不同材料復(fù)合的研究，例如：與殼聚糖復(fù)合、與膠原復(fù)合、與聚乳酸復(fù)合、與聚醚醚銅復(fù)合、與聚乳酸聚酰胺復(fù)合等等。這些研究都或多或少增加了支架材料的性能，但都還處于試驗階段，距臨床運用還有距離。

也有學(xué)者對其他支架材料復(fù)合的研究，例如：TCP/ HA、HA/ 珊瑚、HA/ PA(聚酰氨)及HA/膠原等按照不同比例復(fù)合后，材料吸收與成骨速度更為匹配，生物力學(xué)性質(zhì)更接近骨組織，輔助成骨效果較單一材料明顯提高[14-15]。但同樣離臨床運用還有一段距離。

隨著人們對同種異體骨研究的深入，同種異體骨移植后的愈合方式主要是起骨傳導(dǎo)作用 骨傳導(dǎo)作用也就是支架作用，是移植骨周圍組織床的血管、骨祖細胞沿植入物的機械引導(dǎo)侵入其內(nèi)部，實現(xiàn)爬行替代的過程[16]。這就顛覆了傳統(tǒng)對組織工程骨支架材料要求的限定，那么，組織工程骨支架材料是否一定需要降解，是今后研究的另一方向[17]。

2. 種子細胞

種子細胞是構(gòu)建組織工程骨的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，大量研究顯示，種子細胞復(fù)合支架材料移植于骨缺損區(qū)的成骨效果遠較單純支架材料移植好。早期骨組織工程研究常從實驗動物的松質(zhì)骨或骨膜中獲取成骨細胞充當種子細胞，但由于其數(shù)量極其有限，不能在體外大量擴增，無法滿足構(gòu)建大塊骨組織的要求。

理想的種子細胞應(yīng)容易獲取、能在體外傳代擴增并長期保持成骨活性、增值能力強、低免疫源性、無毒性及致瘤性。成體間充質(zhì)干細胞(MSC)是近來研究較多、能滿足這種要求的特殊細胞，它可源自各系不成熟的祖細胞(如骨祖細胞、軟骨祖細胞和脂肪祖細胞)，并在不同途徑下分化為不同的細胞。

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)骨髓間充質(zhì)干細胞是近幾年來用于組織工程下頜骨研究的主要種子細胞。自體骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有多分化潛能，而且實驗證實將BMSCs 進行體外擴增后，加些誘導(dǎo)因子，能向成骨細胞及成軟骨分化，加速骨組織、軟骨組織的形成[18]。但是由于同種異體細胞移植的免疫原性反應(yīng)，自體細胞移植取材有創(chuàng)，以及細胞數(shù)量和增殖分化能力隨年齡增長而顯著下降等問題，BMSCs 的廣泛應(yīng)用也受到限制。

脂肪干細胞(ADSCs)，脂肪干細胞有許多優(yōu)點：脂肪組織中ADSCs 含量豐富；有多分化潛能；體外培養(yǎng)倍增速度快；不易老化等。但是脂肪干細胞難以分離純化，體內(nèi)效果尚不明確。需要進一步研究。

其他組織來源的成體干細胞 近年來有學(xué)者在外周血液、骨骼肌、皮膚、肝臟等組織中也發(fā)現(xiàn)了具有多向分化潛能的成體干細胞。口腔研究方面，有報道能從牙髓牙周膜分離出多能干細胞也具有分化為成骨細胞的潛能。但這些成體干細胞數(shù)量有限，不適合作為骨組織工程的種子細胞。

胚胎干細胞是分化潛能較大的干細胞。但胚胎干細胞最主要的問題是安全性問題、倫理學(xué)問題以及分化控制問題，從而限制其運用[19]。

臍帶間充質(zhì)干細胞和臍血間充質(zhì)干細胞Romanov YA[20]和Covas Dt 等[21](2003)分別從臍靜脈內(nèi)皮和內(nèi)皮下分離出一種類似骨髓來源的MSCs的成纖維樣細胞，這種細胞缺乏內(nèi)皮和造血細胞抗原，表達平滑肌肌動蛋白及細胞粘附分子，可分化為脂肪細胞和成骨細胞。隨后越來越多的研究發(fā)現(xiàn)從人臍血管周圍所包裹的膠樣結(jié)締組織，即華爾通膠或沃頓膠(Wharton 膠)中分離培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細胞(Umbilical cord mesenchymal stromal cells， UCMSCs)在體外易分離擴增，具有自我更新和多向分化的潛能，除了滿足國際細胞療法和間充質(zhì)與組織干細胞委員會制定的最低間充質(zhì)干細胞標準，還表達一些原始干細胞標記[22-24]。而且人臍帶間充質(zhì)干細胞可抑制淋巴細胞的增殖，這表明它作為一種免疫缺陷的細胞，在移植應(yīng)用中發(fā)生免疫排斥的可能性小[25]。加上hUCMSCs 來源廣泛，便于取材，對供者無不利影響，無倫理問題的限制，這些特點使得hUCMSCs 很快成為細胞治療和組織工程中新的種子細胞[26，27]。這是組織工程骨種子細胞研究的方向。

在hUCMSCs 向成骨細胞誘導(dǎo)分化的實驗中[28]發(fā)現(xiàn)hUCMSCs 在磷酸鈣三維支架中合成的骨礦化物比hBMSCs 還要多。諸多學(xué)者[29，30]證實hUCMSCs 能向成骨細胞誘導(dǎo)，在較多支架材料上能成骨；也有學(xué)者研究證實hUCMSCs 能向軟骨細胞分化。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[30]，hUCMSCs 較人關(guān)節(jié)軟骨細胞更易形成關(guān)節(jié)軟骨。這說明hUCMSCs有可能成為促進骨組織和軟骨組織再生的另一種干細胞。

3. 骨誘導(dǎo)生長因子

生長因子代表一類能按照某種復(fù)雜的規(guī)則控制特定組織細胞活性的蛋白，骨基質(zhì)和前骨質(zhì)中存在轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等生長因子。在骨的自然轉(zhuǎn)歸過程中，骨細胞釋放這些生長因子，后者作用于干細胞、祖細胞、成骨細胞和其他細胞系(如血管內(nèi)皮細胞)，誘導(dǎo)組織缺損部位的再生。生長因子促進骨愈合在兩方面起作用，一是促進種子細胞合成細胞外基質(zhì)，其二是受區(qū)細胞受刺激后合成和分化能力加強[31]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是目前研究較多的促進成骨的生長因子。Spector[32]DI 等應(yīng)用rhBMP-2結(jié)合HA/ TCP 修復(fù)狗下頜骨5cm 長節(jié)段性缺損，術(shù)后3 月X 線證實缺損區(qū)有新骨形成，7 個月后局部活檢為正常骨組織，隨訪26 個月發(fā)現(xiàn)骨缺損區(qū)塑形良好。

與其他骨生長因子相比，NELL-1 的生物學(xué)效應(yīng)相對單一，其骨誘導(dǎo)活性也更具有特異性，同時它無法單獨誘導(dǎo)異位骨組織形成，因此NELL-1 可具有較高的生物安全性和精準性[33]。

由于代謝快，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在缺損部位存留時間短等缺點，生長因子在實際應(yīng)用中受到限制。如何使生長因子持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)揮作用，也是應(yīng)該研究的課題。

4. 組織工程骨修復(fù)下頜骨缺損臨床前實驗

在將組織工程骨實際應(yīng)用于臨床前，選擇大動物模型作臨床前實驗是必不可少的。一般選擇犬、羊或小型豬作實驗動物，在其單側(cè)或雙側(cè)下頜骨體部制作標準節(jié)段性缺損，缺損區(qū)用組織工程骨修復(fù)。

Schliephake[34]在8 只綿羊下頜骨上制作大塊節(jié)段性缺損，比較骨祖細胞復(fù)合磷酸鈣支架與單純磷酸鈣支架填補缺損后的成骨效果。5 個月后，結(jié)果顯示：含細胞組成骨率為34.4%，而單純支架組為10.4%。研究認為：復(fù)合種子細胞組成骨效果顯著；實驗組的成骨率并不高，可能與種子細胞的數(shù)量不足有關(guān)(該實驗中細胞數(shù)為5×106)；支架上的種子細胞也不宜過多，細胞太密集會導(dǎo)致氧氣和營養(yǎng)供給不足，尤其在支架中心區(qū)。

Abukawa[35]從豬的髂骨中抽取10ml 骨髓，從中分離出MSC，經(jīng)培養(yǎng)擴增后接種到PLGA 支架上，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)10 天后移植到其下頜骨缺損區(qū)(2×2cm)。6 周后缺損區(qū)充滿硬骨樣組織，而對照組僅有纖維組織形成。組織學(xué)檢查在實驗組所產(chǎn)生的骨組織中發(fā)現(xiàn)了成骨細胞、骨細胞、骨小梁和血管。

Yuan[36]報道用經(jīng)成骨誘導(dǎo)的BMSC 接種于β-TCP 支架，在體外培養(yǎng)5d 和7d 后，移植于狗下頜骨缺損區(qū)(3cm 長)。術(shù)后4 周有新骨形成，3 個月和8 個月結(jié)果顯示，下頜骨缺損區(qū)愈合，而僅用支架修復(fù)的對照組很少成骨。新生骨組織生物力學(xué)性質(zhì)滿意，接近對側(cè)無牙區(qū)皮質(zhì)骨。Miao[37]利用金屬網(wǎng)作為外支架、羥基磷灰石為內(nèi)支架，加載rhBMP-2，在猴背闊肌異位成骨后，連帶血管蒂移植，修復(fù)猴下頜骨節(jié)段性缺損，效果良好。

組織工程骨修復(fù)下頜骨的研究很多，以前的研究得到一些共性結(jié)果：1、種子細胞選用BMSC，都能觀察到節(jié)段性缺損達到骨愈合；2、成骨一般都是在支架周圍先開始；其原因可能與支架內(nèi)部血供緩慢，相應(yīng)氧氣和營養(yǎng)供給不足，影響種子細胞的成骨活性；周圍成骨細胞向支架周圍遷移和擴增，也是周圍先成骨的主要原因；3、只有使用可吸收支架材料才能在缺損區(qū)完全長滿新骨，非可吸收類材料則殘留在缺損區(qū)；生物材料與骨混合并不能完全達到骨愈合；理想的支架吸收時間是12-18月，這是新骨產(chǎn)生所需要的時間[38]；4、經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)的MSC 更易于在支架上成骨。但臨床運用還很局限。

5. 臨床應(yīng)用研究

臨床上組織工程骨首先用于肢體骨缺損修復(fù)。Quarto[38]2001 年首次采用多孔HA 支架接種自體擴增后的BMSC 修復(fù)4 例人體脛骨缺損，術(shù)后2月，移植區(qū)有大量骨痂產(chǎn)生，移植體與骨斷端連接良好。術(shù)后5-7 個月，移植體與宿主骨組織完全融合。兩例患者術(shù)后6-7 年隨訪，移植體與自體骨整合良好，后期未發(fā)生骨折。Vacanti[39]同年報道采用自體骨膜細胞體外擴增后接種到孔狀珊瑚支架上修復(fù)拇指遠端指骨缺損，雖獲得成功但這種費時費力的方法受到質(zhì)疑。

極少有臨床使用組織工程方法修復(fù)下頜骨缺損的公開報道。2004 年，Warnke[40]報道了1 例56 歲下頜骨腫瘤切除術(shù)后患者，下頜正中偏左側(cè)至右側(cè)磨牙后區(qū)缺損。作者按缺損區(qū)CT 數(shù)據(jù)預(yù)制鈦網(wǎng)作外層支撐，充填復(fù)合有rhBMP-7 和BMSC 的HA 塊構(gòu)建修復(fù)體。修復(fù)體先被放到患者的背闊肌內(nèi)，以達到異位成骨和胸背血管長入的目的。7 周后，該修復(fù)體連帶背闊肌及胸背血管被移植到下頜缺損區(qū)，血管蒂分別與頸外動脈和頭靜脈吻合[41]。4 周后患者恢復(fù)了咬合功能，能進食固體食物。但在術(shù)后7 月，外側(cè)鈦網(wǎng)支架折斷，局部發(fā)生感染。下頜重建術(shù)后15 月，患者死于心跳驟停。Yamada 等[42]2004 年報道用BMSC 和富含血小板血漿(PRP)制作成可注射的復(fù)合物，成功修復(fù)3 例下頜骨缺損。2013 年Barbad[43]利用同種異體骨為支架，骨髓間充質(zhì)干細胞為種子細胞修復(fù)3 例下頜骨缺損，經(jīng)過2 年觀察，有2 例效果滿意。但因其例數(shù)局限，而且缺乏長期隨訪，這方面還需要進一步研究，特別是其基礎(chǔ)研究。

6. 展望

下頜骨形態(tài)復(fù)雜，用自體骨修復(fù)時的塑形工作很困難。組織工程技術(shù)在體外可按照缺損形狀精確預(yù)制支架材料，并可在體外多次重復(fù)構(gòu)建修復(fù)體而對機體本身沒有任何損傷。因此，該方法用于下頜骨腫瘤術(shù)后修復(fù)極有前景。

從自體獲取種子細胞到制作成組織工程修復(fù)體應(yīng)用到體內(nèi)，中間需要數(shù)周時間。理想的方法是采用組織工程技術(shù)制作出各種活的骨組織成品，能直接用到體內(nèi)而不會有排斥反應(yīng)。hUCMSCs 來源廣泛，便于取材，對供者無不利影響，無倫理問題的限制，這些特點使得hUCMSCs 很快成為細胞治療和組織工程中新的種子細胞。

大塊支架內(nèi)部細胞的氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)問題是構(gòu)建組織工程骨的難題。如能在支架材料內(nèi)建立血管網(wǎng)絡(luò)并能與受區(qū)連接，將大大提高組織工程骨的生物活性。隨著構(gòu)建復(fù)合有各種生長因子、帶有供血網(wǎng)絡(luò)的移植體的研究日漸深入，臨床應(yīng)用組織工程骨修復(fù)下頜骨缺損的日期將不會太遙遠。

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