急彎棘豆總黃酮超聲波輔助提取工藝研究

劉 璐，傅旭陽，付明哲，趙寶玉＊

（西北農(nóng)林科技大學1.理學院；2.動物醫(yī)學院，陜西楊凌712100）

急彎棘豆（Oxytropisdeflexa）系豆科棘豆屬植物，廣泛分布在我國西北、華北、西南等地，主要生長在海拔3 000m以上草坡地［1］，急彎棘豆全草在藏藥和蒙古藥中廣泛使用，民間多用于消炎、解毒、抗菌、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等［2］。急彎棘豆全草中含有黃酮類化合物，以黃酮甙為主要成分［3］。許多研究已表明黃酮類化合物具有多種生物活性，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面有顯著效果，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域［4］。傳統(tǒng)溶劑熱提取急彎棘豆黃酮存在提取時間長、所用溶劑量大、雜質(zhì)多、有效成分低、成本高等缺點，嚴重阻礙了我國棘豆黃酮類化合物的開發(fā)利用［5］。近年來，超聲波輔助提取黃酮類化合物的工藝已有一定報道［6］，超聲波具有空化、湍流、界面和聚能效應(yīng)，能破裂植物細胞、促進溶劑滲透，輔助提取溫度低、時間短、產(chǎn)率高［7］。但目前尚未見棘豆中黃酮類化合物的超聲提取工藝報道。本研究通過單因素和正交實驗探索超聲波提取棘豆黃酮的工藝參數(shù)，篩選提取的最佳提取條件，為合理開發(fā)利用棘豆屬植物資源提供可靠依據(jù)［8］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試樣品 急彎棘豆2010年8月采自青海省祁連草地，經(jīng)陰干、去雜、粉碎過20目篩備用。

1.1.2 試 劑 蘆丁對照品（中國藥品生物品檢定所，批號10080－200306）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ－1500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TU－1901紫外光譜儀，普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 棘豆總黃酮的提取 稱取3g急彎棘豆干粉，在乙醇中超聲提取，過濾，合并兩次濾液，濃縮，石油醚除去油脂和色素，將乙醇部分轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶，用甲醇定容，作為樣品提取液。

1.3.2 棘豆總黃酮的測定［9］

1.3.2.1 標準曲線的繪制 精確吸取0.542mg／mL蘆丁標準液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL于8只10mL容量瓶中，加入1mL 1%三氯化鋁甲醇液，定容，放置15 min，以不加蘆丁標準液為空白，于274nm 波長下測定吸光度。以吸光度對蘆丁含量作標準曲線。

1.3.2.2 總黃酮的測定 取樣品提取液3 mL 于10mL容量瓶，以相應(yīng)試劑做空白，用三氯化鋁顯色法，分別于274nm 處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出急彎棘豆總黃酮含量。

1.3.3 單因素試驗 選取超聲功率、料液比、超聲時間、乙醇濃度、提取溫度5個因素，以測定的總黃酮含量為指標，確定各因素的適宜范圍，見表1。

表1 單因素試驗因素水平Table 1 Factors and levels of single factor experiment

1.3.4 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以超聲溫度、時間、料液比、超聲功率為主要因素，以樣品中總黃酮的提取率為指標，按照表2L9（34）正交設(shè)計進行試驗。

1.3.5 統(tǒng)計分析 所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。

表2 （L934）正交試驗設(shè)計Table 2 （L934）Orthogonal experiment design method

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的線性質(zhì)量

蘆丁的回歸方程為A＝0.419C＋0.0249，其中A 為吸光度，C 為蘆丁濃度（μg／mL），R2＝0.9992，實驗表明，在0～38μg／mL 范圍內(nèi)，蘆丁與吸光度值線性關(guān)系良好，如圖1。

2.2 超聲提取單因素試驗

2.2.1 超聲波功率對提取效果的影響 由圖2可知，超聲功率對棘豆總黃酮的提取有一定影響。隨著提取功率的增加，總黃酮的含量呈上升趨勢，功率在800左右提取率最大。超過800 W 隨著功率的增加反而下降，因此，將正交試驗中超聲功率確定為范圍600～800 W 較適宜。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

圖2 超聲功率對總黃酮提取含量的影響Fig.2 The effect of Ultrasonic power on the concentration of flavones

2.2.2 料液比對提取效果的影響 從圖3可知，在超聲功率、提取溫度和提取時間一定的條件下，1∶05～1∶20時提取出棘豆總黃酮的含量呈逐漸上升趨勢，1∶15～1∶20棘豆總黃酮含相對平穩(wěn)，但當料液比達1∶25其含量有所下降，故料液比以1∶20為宜。

2.2.3 超聲時間對棘豆總黃酮的提取有一定影響

從圖4可以看出，隨著提取時間的增加提取出的黃酮含量呈上升趨勢，45～60 min 時提取率最高，但在60min之后，隨著超聲時間的增加反而下降，75min后與超聲15min時含量相當，比含量最高時下降13.16%左右。因此，將正交試驗中的超聲時間定為45～60min。

2.2.4 溫度對超聲提取效果的影響 棘豆總黃酮在乙醇中的擴散與溫度有密切關(guān)系。從圖5可知，30 ℃～60 ℃之間，黃酮含量隨著溫度的升高呈上升趨勢，但在75 ℃時黃酮含量有所下降，75 ℃時總黃酮含量與35℃時相差無幾，因此，將正交試驗中的超聲溫度定為45 ℃。

2.2.5 乙醇濃度對提取效果的影響 從圖6可以看出，當乙醇濃度在30%～60%時，棘豆總黃酮含量逐漸增加；當乙醇濃度到達60%時相對提取率最高；當乙醇濃度大于70%時，隨著乙醇濃度的增加，黃酮含量有減少的趨勢；當乙醇濃度達到80%時黃酮含量含量比60%時下降了10.00%，因此，將正交試驗中乙醇濃度定為60%～70%。

圖3 料液比對總黃酮提取含量的影響Fig.3 Effect of ratio of material to solvent volum on the concentration of flavones

圖4 提取時間對總黃酮提取含量的影響Fig.4 The effect of time on the concentration of flavones

2.3 超聲波輔助提取正交試驗

由正交試驗結(jié)果可見，影響急彎棘豆超聲輔助提取的主要因素依次為超聲功率、超聲時間、溫度、和料液比。料液比與超聲時間對提取無顯著性影響（P＞0.05），溫度與超聲功率對提取有顯著影響性（P＜0.05）。確定最佳工藝為D2B2C2A1，即乙醇濃度到達60%，超聲45min；超聲溫度為45 ℃，料液比為1∶10，超聲功率為800 W，結(jié)果見表3、4。

圖5 不同溫度對總黃酮提取含量的影響Fig.5 Effect of different temperature on the concentration of flavones

圖6 不同乙醇濃度對提取含量的影響Fig.6 The effect of concentration of ethanol on the concentration of flavones

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The analysis of variance

2.4 提取工藝驗證

精密稱取急彎棘豆樣品6g，按照最佳工藝條件對急彎棘豆進行提?。╪＝4），三氯化鋁比色法測得急彎棘豆總黃酮含量為1.97%，結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果Table 5 Results of optimum extraction technology

3 討論

超聲波具有空化、粉碎、攪拌等特殊作用，能促進溶質(zhì)浸潤，增加傳質(zhì)面積，破壞植物細胞，產(chǎn)生瞬間高壓場，導致超臨界現(xiàn)象，提高擴散系數(shù)［10］。與常規(guī)提取法相比，超聲波加速了提取速度，縮短了提取時間，降低了提取溫度，提高了提取率［11］。

超聲波的功率越高越容易獲得較大的聲強，與介質(zhì)相互作用時，超聲強度更起決定性作用［12］。超過800 W 超聲功率的提取率開始下降，可能是功率過高時，提取液的溫升較大，造成部分黃酮物質(zhì)因受熱損失較大；同時溶劑揮發(fā)速度加快，提取液濃度增大，致使黃酮類物質(zhì)不易完全溶出［13］。

料液比影響溶劑的極性，從而影響不同極性黃酮類物質(zhì)的溶解性。料液小于1∶20時，增加溶劑用量可增大溶劑對黃酮的溶解能力，棘豆細胞內(nèi)的黃酮與浸提液之間的黃酮濃度差較大，擴散推動力大，超聲場中的湍動效應(yīng)有利于黃酮向浸提液擴散。當繼續(xù)提高溶劑用量，能耗及成本也隨之增大，還因為溶劑中的蛋白質(zhì)、碳水化合物和果膠可能與黃酮結(jié)合生成沉淀或吸附黃酮，從而減少了棘豆總黃酮的浸出率［14］。綜合考慮選擇1∶10的料液比。

從超聲波提取時間來看，提取率隨超聲作用時間增加，達到一個極限值后提取率反而減?。?5］。延長時間可以增加棘豆總黃酮的浸出量，提高黃酮浸出率。當時間在60min時，黃酮的浸出量并沒有太大的變化。這是因為此時棘豆黃酮向溶液擴散速度與溶液中黃酮向棘豆擴散的速度達到了平衡。但當提取時間達到75min時，黃酮的浸提率出現(xiàn)了明顯的降低，原因可能有兩個：一隨著萃取時間的延長，可能造成部分黃酮類物質(zhì)被氧化；二是超聲作用時間太長，使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低［16］。因此，超聲萃取棘豆的總黃酮時間不宜太長。

溫度升高，可軟化植物組織，增加溶解度和擴散速度，促進有效成分浸出。隨著溫度的升高黃酮浸出率逐漸增大，這是由于溫度的升高有利于增加棘豆總黃酮的溶解度和擴散速度［17］。但90 ℃時，急彎棘豆總黃酮的浸出率明顯降低，可能是黃酮在高溫時性質(zhì)不穩(wěn)定受熱易變性；此外，溫度太高時，乙醇揮發(fā)加快，影響棘豆總黃酮的浸出率［18］。

乙醇濃度對總黃酮提取有較大影響［19］。超過70%時，黃酮的提取率反而下降了。這是因為黃酮的極性較小，黃酮易溶于中等或中等偏下極性溶劑中。當乙醇濃度低時，黃酮的溶解度也低。當乙醇濃度增高后，乙醇分子之間不但彼此以氫鍵相結(jié)合，而且和水分子也形成氫鍵，降低了水的極性，故黃酮的溶解度增加［20］。隨著乙醇濃度超過70%后，一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強的成分溶出量增加［21］。因此將乙醇濃度確定在60%左右。

［1］李玉林，廖志新，杜玉枝，等.棘豆屬植物化學成分研究概況［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14（5）：75－79.

［2］馬彥梅，周文明，楊新娟.棘豆屬植物化學成分和藥理作用的研究進展［J］.西北林學院學報，2005，20（2）：167－170.

［3］文開新，王成章，嚴學兵，等.黃酮類化合物生物學活性研究進展［J］.草業(yè)科學，2010，27（6）：115－122.

［4］Cushnie T P，Lamb A J.Antimicrobial activity of flavonoids［J］.Antimicrob Agents，2005，26（5）：343－356.

［5］楊光明，王 棟.鐮形棘豆總黃酮和總酚的含量測定［J］.藥學與臨床研究，2009，17（5）：376－378.

［6］李 華，沈 潔.超聲波法從葡萄籽中提取多酚的研究［J］.釀酒科技，2005，7（5）：89－91.

［7］曾 里，夏之寧.超聲波和微波對中藥提取的促進和影響［J］.化學研究與應(yīng)用，2002，14（3）：245－249.

［8］劉 璐.棘豆屬植物黃酮測定方法與超聲波輔助提取工藝研究［D］.陜西：西北農(nóng)林科技大學，2010.

［9］劉 璐，付明哲，趙寶玉，等.急彎棘豆總黃酮含量的紫外分光光度法測定［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31（11）：59－62.

［10］鄭 艷.青刺果總黃酮的提取工藝及其對肉雞的免疫調(diào)節(jié)作用［D］.重慶：西南大學，2008.

［11］高 輝，杜 鵑.超聲波輔助提取苦苣總黃酮的工藝研究［J］.吉林醫(yī)藥學院學，2012，33（1）：21－22.

［12］陳 蕾，于 娟，李曉蕙.超聲法提取駱駝蒿總生物堿的工藝研究［J］.西北林學院學報，2010，25（3）：158－162.

［13］張艷軍，彭重威，徐淑慶，等.銀葉樹樹葉中總黃酮提取工藝優(yōu)化［J］.中藥材，2012，35（4）：640－641.

［14］郭 輝，羅宇倩，章華偉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取荷葉黃酮工藝［J］.中國食品學報，2011，11（1）：121－124.

［15］馬振千.紫花地丁總黃酮提取實驗研究［D］.天津：天津大學，2008.

［16］賈韶千，吳彩娥，李艷霞.枸杞中黃酮類化合物的超聲波強化提取.農(nóng)業(yè)機械學報第，2009，40（5）：131－134.

［17］黃運紅，高興強，黎偉偉，等.超聲法提取臍橙皮黃酮類化合物的工藝研究［J］.食品科學，2009，30（16）：102－105.

［18］張 然，王 晶，朱春花，等.超聲波提取蘇芡黃酮類化合物工藝［J］.食品科學2010，31（1）：247－250.

［19］Zhou T，Luo D，Li X，et al.Hypoglycemic and hypolipidemic effects of flavonoids from lotus（Nelumbo nuficeraGaertn）leaf in diabetic mice［J］.Journal of Medicinal Plants Research，2009，3（4）290－293.

［20］喬東東，張 云，尤新軍，等.星點設(shè)計－效應(yīng)面法優(yōu)化梓樹果實總黃酮的超聲提取工藝［J］.西北林學院學報，2010，25（3）：170－171.

［21］馮宗帥，吳彩娥，方升佐，等.青錢柳葉總黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)機械學報，2009，40（2）：130－134，75.