重金屬免疫學(xué)快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展

劉艷梅，鐘 輝，向軍儉

重金屬免疫學(xué)快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展

劉艷梅，鐘 輝，向軍儉*

（廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，暨南大學(xué)抗體工程研究中心，廣東 廣州 510632）

重金屬免疫學(xué)檢測技術(shù)作為一種新型檢測技術(shù)，與傳統(tǒng)檢測方法相比具有靈敏、快速、攜帶方便、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，可用于現(xiàn)場快速檢測。本文概述近年來重金屬免疫學(xué)檢測技術(shù)的最新研究進(jìn)展，并對該類方法的發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

重金屬；單克隆抗體免疫檢測；酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)；膠體金免疫層析法；熒光偏振免疫分析法

隨著全社會(huì)對食品安全和環(huán)境保護(hù)問題關(guān)注度的不斷提高，重金屬污染已成為全球性關(guān)注的問題。環(huán)境污染方面所指的重金屬污染主要指生物毒性顯著的汞（Hg）、鎘（Cd）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、砷（As），以及具有毒性的重 金屬銅（Cu）、鈷（Co）、鎳（Ni）、錫（Sn）、釩（V）等污染物。這類有毒物質(zhì)經(jīng)由食物鏈濃縮且在人體內(nèi)不斷累積，主要以慢性中毒和遠(yuǎn)期效應(yīng)顯出毒性，存在巨大的潛在危害。據(jù)國家環(huán)保局不完全統(tǒng)計(jì)，全國每年因重金屬污染的糧食達(dá)1.2×106kg，造成直接經(jīng)濟(jì)損失超過200億元；受不同程度重金屬污染的耕地面積約有2×107m2，約占我國耕地總面積的1/5[1]；中國水體重金屬污染問題也十分突出，以廣東韶關(guān)大寶山礦區(qū)為例，由于部分金屬礦區(qū)個(gè)人私自違規(guī)采礦致使地表雨水?dāng)y帶大量金屬礦物離子匯入橫石河中，使沿河兩邊的耕地受到嚴(yán)重重金屬污染。重金屬一旦污染環(huán)境，很難自然修復(fù)，且隨食物鏈蓄積和傳遞，會(huì)對食品安全和群眾健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[2-3]。

近年來重金屬污染越來越受到人們的重視，針對重金屬常用的傳統(tǒng)檢測方法包括電感耦合等離子體質(zhì)譜法[4]（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、石墨爐原子吸收光譜法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GF-AAS）、火焰原子吸收光譜法（flame atomic absorption spectros copy，F(xiàn) AAS）、X射線熒光光譜分析法[5]（X-ray fluorescence spectroscopy，XRF）、溶出伏安法（voltammetry）[6]以及紫外分光光度法（ultra violet spectrophotometry）等。GB15618-1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[7]中規(guī)定了用于土壤重金屬檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法主要是采用強(qiáng)酸消解后通過原子光譜法進(jìn)行重金屬測量。傳統(tǒng)檢測方法準(zhǔn)確、可信度高，但往往需要大型設(shè)備儀器和專業(yè)人員操作，有一定的時(shí)間地點(diǎn)局限性，不適用于現(xiàn)場定量檢測。在突發(fā)性環(huán)境污染事件檢測和大范圍取樣實(shí)時(shí)監(jiān)測時(shí)，需要建立一種靈敏、高效、快速、方便的檢測方法。儀器檢測方法往往只能檢測重金屬的總含量，不適用于不同存在形態(tài)的重金屬種類分析。多數(shù)重金屬的毒性取決于其物理化學(xué)形態(tài)[8]，基于單克隆抗體制備與應(yīng)用的免疫學(xué)檢測技術(shù)可以特異地針對某一種存在形式的重金屬 離子，為實(shí)現(xiàn)環(huán)境及食品樣品中重金屬的快速定量或半定量檢測提供了一個(gè)有效途徑[9]。本文綜述了近幾年來重金屬檢測中的樣品前處理方法及免疫學(xué)檢測技術(shù)，并對今后的研究發(fā)展方向做出展望。

1 樣品前處理

重金屬在實(shí)際樣品中往往以化合物的形態(tài)存在，一般不能直接進(jìn)行檢測。這就需要在檢測前進(jìn)行樣品前處理來除去干擾因素，并使金屬離子釋放到液相檢測環(huán)境中，以便后續(xù)檢測。樣品前處理的基本原則是盡量完整地保留被測組分，并使被測組分得到有效濃縮。目前重金屬殘留檢測中常用的樣品前處理方法有：濕式消解法、干灰化法、微波消解法、酸浸提法等[10]。重金屬免疫學(xué)檢測過程一般需要液相環(huán)境，因此暫不考慮干灰化法處理樣品。

1.1 濕式消解法

濕式消解法是通過強(qiáng)酸在高溫條件下破壞有機(jī)質(zhì)使金屬離子釋放出來，該方法對大多數(shù)樣品適用且回收率高，但需要耗費(fèi)大量強(qiáng)酸并有大量有害氣體釋放對環(huán)境和人體損傷較大。常用的酸有硝酸和高氯酸等。Sasaki等[11]使用濃硝酸在130 ℃條件下消解植物、土壤、肥料等物質(zhì)，使物質(zhì)中的重金屬離子釋放到液相環(huán)境中，經(jīng)過18碳硅膠螯合柱純化后利用膠體金試紙條法進(jìn)行免疫學(xué)檢測。

1.2 微波消解法

微波消解法是利用微波的穿透性和激活反應(yīng)能力，在密封裝置內(nèi)，使樣品溫度迅速升高，加入一定量的酸溶液，達(dá)到使樣品中有機(jī)物質(zhì)分解的目的[12]。Ghaedi等[13]通過微波消解法提取重金屬離子后，采用經(jīng)表面活性劑修飾的活性炭來對重金屬進(jìn)行富集以降低其檢測限。該方法作為一種新型樣品前處理方法具有快速、消化完全、污染小等優(yōu)點(diǎn)，正逐漸成為樣品中重金屬含量檢測的重要前處理方法。通常在微波消解后進(jìn)行免疫學(xué)檢測前存在排除離子干擾等技術(shù)難點(diǎn)，因而現(xiàn)階段還主要用儀器法檢測消解結(jié)果。Amorimfilho等[14]采用硝酸、雙氧水混合微波消解式樣后進(jìn)行石墨爐原子吸收光譜測定抗生素中的Cd2+和Pb2+含量。微波消解法為免疫學(xué)檢測重金屬提供了一種快速進(jìn)行樣品前處理的參考方法。

1.3 浸提法

通常為酸提取法即采用鹽酸或硝酸直接浸提所需組分，直接浸提法具有操作簡便、速度快、不污染環(huán)境、避免被測元素的揮發(fā)損失等優(yōu)點(diǎn)，但回收率相對較低。李支薇等[15]采用稀HCl、HNO3及H2SO4對樣品進(jìn)行浸提，探索了蔬菜中重金屬Cu2+、Pb2+、Cd2+的最適浸提條件。Gao Wei等[16]采用1 mol/L的CH3COONH4浸提土壤中的Cd2+并進(jìn)行了免疫學(xué)分析測定。

這3 種樣品前處理方法均可用于免疫學(xué)檢測過程，通過樣品前處理后需要經(jīng)過其他雜離子的去除或重金屬離子的富集等過程，最后與相應(yīng)的螯合劑螯合后方可進(jìn)行免疫學(xué)檢測。以上3 種樣品前處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

表1 不同樣品前處理方法比較Table 1 Comparison of different sample pretreatment methods

2 重金屬人工抗原及相應(yīng)單克隆抗體的制備

2.1 人工抗原的合成

重金屬免疫學(xué)檢測的3 個(gè)技術(shù)要點(diǎn)分別是：人工抗原的合成、特異性抗體的制備及免疫學(xué)檢測方法的建立。重金屬免疫學(xué)檢測依賴于高效價(jià)和高靈敏度的抗體，而制備重金屬-螯合物特異性單克隆抗體的關(guān)鍵在于合成優(yōu)質(zhì)的重金屬免疫原和檢測原。由于重金屬離子本身為小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，不能直接免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，且金屬離子帶有電荷，能與生物分子發(fā)生不可逆反應(yīng)導(dǎo)致動(dòng)物中毒，因此，為了增加其抗原性和特異性，首先需選取與目標(biāo)重金屬具有高度親和力的金屬螯合劑，制備成重金屬-螯合物，再將其與適宜的載體蛋白（血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）或牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）等）偶聯(lián)，制備成重金屬-螯合物-載體蛋白的復(fù)合物作為免疫原。同時(shí)，由于該偶聯(lián)物會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生針對載體蛋白的抗體，為了減少干擾，篩選出重金屬-螯合物特異性的抗體，需合成與其他載體蛋白（如卵清蛋白（ovalbumin，OVA））偶聯(lián)的復(fù)合物作為篩選用的檢測原。蔣蕓等[17]將二價(jià)汞離子與雙功能螯合劑谷胱甘肽（γ-glutamyl cysteingl+glycine，GSH）螯合后再與載體蛋白BSA、卵清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)后獲得完全抗原，并對其合成抗原進(jìn)行了表征分析鑒定，成功制備出Hg2+人工抗原。易翠平等[18]成功合成了免疫抗原Cd-iEDT-AOVA和篩選抗原Cd-iEDTA-BSA，隨后又成功制備出了Cd2+單克隆抗體。

完全人工抗原的合成是重金屬免疫學(xué)檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和技術(shù)難點(diǎn)之一，優(yōu)化人工完全抗原的合成和篩選特異性好的新型重金屬-螯合劑單克隆抗體都將是今后的發(fā)展方向。

2.2 單克隆抗體的制備

自Reardan等[19]第一次通過組建In3+-L-benzyl-EDTA-BSA復(fù)合物抗原，并制備出了In3+的特異性抗體以來，國內(nèi)外專家學(xué)者通過重金屬與螯合劑配位形成半抗原后，再與載體蛋白相耦聯(lián)制備出完全抗原，經(jīng)過免疫動(dòng)物后，利用傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合、陽性細(xì)胞株篩選與克隆化等過程，制備出大量的高特異性單克隆抗體，為重金屬免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。Johnson等[20]成功制備了鎘和鉛的兔多克隆抗體并應(yīng)用于樣品中鉛、鎘的檢測，在重金屬免疫學(xué)檢測中處于領(lǐng)先地位的Blake團(tuán)隊(duì)[21-22]成功制備出了鎘、鉛、鈾、銦、鈷、鎳、汞7 種重金屬的單克隆抗體，并建立了酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、多克隆位點(diǎn)分析（multiple cloning sites，MCS）、KinExA免疫測定法等一系列免疫學(xué)檢測方法。推動(dòng)了免疫學(xué)檢測技術(shù)在重金屬檢測領(lǐng)域的快速發(fā)展。

傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)存在制備周期長、成本較高、雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定和抗性易丟失等缺陷，近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了嵌合單克隆抗體、噬菌體抗體庫技術(shù)、核糖體展示技術(shù)等新型單克隆抗體制備技術(shù)。

嵌合抗體是將非人源抗體可變區(qū)移植到人抗體恒定區(qū)，應(yīng)用DNA重組技術(shù)將小鼠抗體基因上的可變區(qū)與人抗體基因的恒定區(qū)重組，再將重組后的基因?qū)牍撬枇黾?xì)胞中表達(dá)根據(jù)所用的載體質(zhì) 粒標(biāo)記基因產(chǎn)物，選用適當(dāng)?shù)目股鼗蛟噭┻M(jìn)行篩選，再用與傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗體的細(xì)胞株[23]。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于治療性抗體的制備中。

噬菌體抗體庫技術(shù)是利用絲狀噬菌體將外源基因插入噬菌體展示載體的蛋白基因區(qū)，以融合蛋白的形式表達(dá)出來，并隨著噬菌體的組裝而呈現(xiàn)在其表面的新型技術(shù)[24]，它模仿人體內(nèi)抗體的形成過程，將抗體片段呈現(xiàn)在噬菌體表面，建成噬菌體抗體庫，用與親和層析相類似的原理，從抗體庫中篩選出特異性噬菌體抗體。通過體外親和力誘變技術(shù)，可使噬菌體抗體獲得更高的親和力，再將其轉(zhuǎn)染其他宿主菌或?qū)⒖贵w基因克隆入表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，獲得高親和力的基因工程抗體[25]。噬菌體技術(shù)使單抗的制備簡單易行，穩(wěn)定有效，解決了用鼠瘤細(xì)胞與人B細(xì)胞融合導(dǎo)致的人細(xì)胞染色體丟失和雜交瘤不穩(wěn)定的問題，為雜交瘤技術(shù)很難或無法制備的人源抗體、抗自身抗原抗體的獲得提供了技術(shù)方案。

核糖體展示技術(shù)是由Plückthun實(shí)驗(yàn)室在多肽多聚核糖體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種完全在體外進(jìn)行蛋白質(zhì)或多肽分子選擇與進(jìn)化的技術(shù)[26]，核糖體展示技術(shù)采用體外進(jìn)化的方法改造抗體，避免了噬菌體展示技術(shù)轉(zhuǎn)化步驟的限制，更易構(gòu)建出高容量（≥1011）、高質(zhì)量的文庫，更有利于篩選出特異性蛋白，為制備小分子蛋白質(zhì)或多肽開辟了一條新途徑[27]。新型單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展為重金屬-螯合劑單克隆抗體的制備與改良提供了重要支持。

3 重金屬離子的免疫學(xué)檢測方法

通過各研究人員對重金屬殘留的快速檢測技術(shù)的深入研究與探討[28]，產(chǎn)生了許多快速檢測方法，其中主要有酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)、膠體金試紙法、生物化學(xué)傳感器方法[29-31]、熒光分析法等，免疫學(xué)檢測方法具有一些傳統(tǒng)方法不具備的優(yōu)點(diǎn)，如方便快捷、操作簡單、反應(yīng)迅速、便于易攜、分析成本低的特點(diǎn)，表明該檢測方法可應(yīng)用于大量樣品的現(xiàn)場檢測，也可應(yīng)用于食品安全監(jiān)測或環(huán)境檢測方面。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)

酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)是將抗原抗體特異性免疫反應(yīng)與酶催化作用相結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、操作簡單、便于易攜、快速準(zhǔn)確可應(yīng)用于大量樣品檢測等優(yōu)點(diǎn)，一般不需貴重的儀器設(shè)備。ELISA技術(shù)作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)技術(shù)方法，不需要專業(yè)系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)，普通實(shí)驗(yàn)人員即可熟練操作，在進(jìn)行樣品檢測時(shí)所需時(shí)間短，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對待檢物進(jìn)行定量，一般在ELISA試劑盒檢測范圍內(nèi)的樣品均可應(yīng)用該方法。但ELISA試劑盒的檢測范圍受到特異性抗體親和力與靈敏度的制約，有一定的適用范圍，實(shí)際樣品檢測時(shí)可能出現(xiàn)假陽性問題容易引起誤判[32]，每次進(jìn)行定量檢測時(shí)都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

ELISA檢測重金屬常用的方法有間接競爭ELISA和直接競爭ELISA。

3.1.1 間接競爭ELISA（indirect competitive ELISA，icELISA）

其原理是將制備的重金屬完全抗原包被在固相載體上同時(shí)添加待檢樣品（競爭物）和特異性單克隆抗體，抗原與待檢樣品中的競爭物競爭結(jié)合單克隆抗體相同表位，酶標(biāo)二抗孵育后，經(jīng)底物顯色，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品中待檢物的含量。Gao Wei等[16]用乙二酸四乙胺（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）螯合重金屬Cd2+并偶聯(lián)卵清蛋白做免疫原免疫BALB/c小鼠，獲得特異性單克隆細(xì)胞株4F3B6D9A1，所得腹水型抗體純化后用于icELISA，其半抑制濃度（half maximal（50%）inhibitory concentration，IC50）和抑制區(qū)間分別為2.59 ng/mL和0.2～40 ng/mL，除與Mn2+有2.9%和Hg2+有1.6%交叉外，與其他金屬離子交叉反應(yīng)性均小于1%。在實(shí)際樣品檢測中其結(jié)果與石墨爐原子吸收光譜測定值的平均相關(guān)系數(shù)為0.987 3。Wang Yuzhen等[33]以高特異性Hg2+單克隆抗體為基礎(chǔ)建立icELISA方法檢測水樣、牛奶、青菜中的重金屬Hg2+含量，該icELISA檢測范圍是0.1～100 ng/mL，IC50和最低檢測限分別達(dá)到了1.12 ng/mL和0.08 ng/mL。在實(shí)際樣品檢測時(shí)回收率為80%～113%，檢測結(jié)果令人滿意。

3.1.2 直接競爭酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)

即為一步競爭免疫檢測，其原理為樣品中的重金屬離子與螯合劑螯合后與定量的重金屬離子-螯合劑-酶復(fù)合物混合后競爭結(jié)合已包被在固相載體上的抗體，底物顯色后可與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得出重金屬離子濃度。Kumada等[34]用辣根過氧化物酶標(biāo)記Cd2+-EDTA復(fù)合物采用直接競爭免疫檢測法對環(huán)境水樣中的Cd2+進(jìn)行檢測，檢測限可達(dá)0.3 μg/mL，其他雜質(zhì)離子Ca2+、Mg2+、Fe3+對檢測結(jié)果無干擾。檢測結(jié)果與原子吸收法的檢測結(jié)果相吻合，添加標(biāo)準(zhǔn)品回收率達(dá)（100.29±3.60）%。之后Darwish等[35]采用直接競爭免疫檢測法對人血清中Cd2+含量進(jìn)行檢測。將抗Cd2+-EDTA復(fù)合物的抗體直接包被在底板上，將從血樣中分離的Cd2+與適量EDTA混合形成絡(luò)合物與競爭物競爭結(jié)合固定于底板上的抗體表位，通過底物顯色后分析重金屬鎘含量，檢測質(zhì)量濃度范圍達(dá)0.24～100 μg/L，與人血中其他金屬離子無交叉，與原子吸收檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.984。ELISA檢測方法是應(yīng)用最多最基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測方法。

3.2 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)具有方便、快速、肉眼可見檢測結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，無需任何檢測儀器，被廣泛用于食品農(nóng)藥殘留、瘦肉精殘留、重金屬殘留等食品安全和環(huán)境安全快速檢測中。膠體金檢測技術(shù)現(xiàn)在多被用于半定量檢測，特別適合用于大范圍的環(huán)境樣品初檢和爆發(fā)式污染事件的應(yīng)急現(xiàn)場檢測中。

3.2.1 膠體金免疫層析法（gold immuno-chromatographic assay，CIA）

其原理是將特異性抗體標(biāo)記在金顆粒上后固定于金標(biāo)墊上，抗原與二抗分別標(biāo)記在于硝酸纖維素膜上，在硝酸纖維素膜的一端滴加待檢樣品，在毛細(xì)作用下，樣品向硝酸纖維素膜的一端移動(dòng)并與金標(biāo)墊上的標(biāo)記抗體結(jié)合，當(dāng)樣品到達(dá)抗原處時(shí)，若樣品中的待檢物量不足以與所有標(biāo)記抗體結(jié)合則膠體金上標(biāo)記的抗體便與膜上固定的抗原結(jié)合而顯色，若待檢物與標(biāo)記抗體完全結(jié)合則不與固定在膜上的抗原結(jié)合，而是移動(dòng)到固定有二抗的區(qū)域后顯色。膠體金免疫層析可以快速定性或者半定量檢測重金屬離子[36]，操作簡單、快速、特異性高，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道該技術(shù)已應(yīng)用于重金屬的定量檢測中，如Abe等[37]發(fā)明的顏色掃描儀利用在Cd2+-EDTA絡(luò)合物和抗Cd2+-EDTA抗體特異性反應(yīng)形成的抗原抗體復(fù)合物質(zhì)量濃度來檢測Cd2+質(zhì)量濃度，檢測限≤0.01 mg/L。由于抗原-抗體復(fù)合物的反應(yīng)是定量的，采用一系列質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)Cd2+-EDTA與抗Cd2+-EDTA抗體反應(yīng)后通過使用一個(gè)顏色掃描儀器以確定顯色程度，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了實(shí)際大米樣品和土壤樣品中鎘含量膠體金免疫層析檢測。

3.2.2 免疫熒光層析快速診斷技術(shù)

免疫熒光層析是在膠體金免疫層析技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展形成的，它以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物并應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢測、食品安全監(jiān)測、環(huán)境污染檢測等方面有日漸廣泛的應(yīng)用。付強(qiáng)強(qiáng)等[38]建立了一種檢測信號(hào)強(qiáng)度與檢測物濃度呈正相關(guān)的新型熒光淬滅免疫層析試紙條，并成功制備了可用于檢測小分子重金屬Cr3+的熒光淬滅免疫層析試紙條，為免疫學(xué)方法檢測重金屬和免疫層析試紙條的發(fā)展提供了一個(gè)新的方向。

3.3 熒光分析法

熒光分析法基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)某一平面偏振光照射后，吸收光能成為激發(fā)態(tài)，接著恢復(fù)到基態(tài)，同時(shí)發(fā)出某一平面的偏振光。基于重金屬離子能對熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光猝滅或熒光增強(qiáng)作用，并隨濃度增大產(chǎn)生的猝滅或增強(qiáng)作用越大這一原理對重金屬離子原 理進(jìn)行熒光分析檢測。常用的可發(fā)射熒光的物質(zhì)有有機(jī)熒光染料、量子點(diǎn)和稀土納米材料。Tao Huilin等[39]利用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移基于CdSe和CdTe量子點(diǎn)對前列腺抗原（prostate specifi c antigen，PSA），在最佳條件下PSA抗原的線性范圍為2.8～10 μg/mL，相關(guān)性系數(shù)r=0.999 2，檢測限為1.5×10-2μg/mL。熒光分析法與傳統(tǒng)儀器檢測方法相比，具有更高的靈敏度和更低的檢測范圍而且進(jìn)行樣品檢測時(shí)無需進(jìn)行分離富集顯色等操作過程，大大簡化了操作流程。但熒光物質(zhì)只對部分重金屬離子如Hg2+、Cu2+、Ag+、Pb2+、Co2+有響應(yīng)，對許多自身不發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測時(shí)需要預(yù)先加入熒光標(biāo)記物才能進(jìn)行熒光分析，這些問題在一定程度上限制了熒光分析的發(fā)展。熒光分析法比ELISA方法和膠體金試紙條法的靈敏度高10～100 倍，在進(jìn)行樣品檢測時(shí)要求低檢測限時(shí)可選用此類方法。

熒光分析法中的量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)是以納米晶標(biāo)記抗原或 抗體可以通過量子點(diǎn)顏色改變來測定靶標(biāo)物質(zhì)含量的新型標(biāo)記檢測技術(shù)。以量子點(diǎn)作為標(biāo)記物，具有熒光強(qiáng)度穩(wěn)定、激發(fā)光譜廣、抗漂白等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于免疫診斷與分析中。陳清愛等[40]在量子點(diǎn)對金屬離子有熒光效應(yīng)特性的基礎(chǔ)上，利用C u2+對CdTe量子點(diǎn)熒光淬滅，建立Cu2+比色傳感器可快速實(shí)現(xiàn)對Cu2+的檢測；利用Ag+對CdTe量子點(diǎn)熒光淬滅特性，研發(fā)出一種熒光Ag+定量檢測方法，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度與Ag+濃度在2.0×10-5～1.0×10-6mol/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測限（3σ/k）為8.8×10-7mol/L，相關(guān)系數(shù)為0.998 7。劉猛等[41]基于量子點(diǎn) 與石墨烯研發(fā)新型生物傳感器 用于快速、準(zhǔn)確、定量檢測環(huán)境中的重金屬離子，構(gòu)建了基于無機(jī)發(fā)光材料CdTe納米棒和有機(jī)熒光染料-鈣黃綠素藍(lán)的超靈敏熒光比色探針，對 銅離子的檢出限達(dá)到0.13 nmol/L，靈敏度是 傳統(tǒng)量子點(diǎn)熒光探針的60 倍。量子點(diǎn)標(biāo)記免疫技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可進(jìn)行多組定量分析等優(yōu)點(diǎn)，如今量子點(diǎn)與免疫層析檢測技術(shù)已被應(yīng)用于小分子物質(zhì)（如萊克多巴胺及鹽酸克倫特羅）的快速檢測中，為食品中重金屬的檢測提供了新的技術(shù)支持，為新型量子點(diǎn)免疫檢測重金屬離子的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

3.4 基于KinExA?3000的免疫法檢測

KinExA是一種計(jì)算機(jī)控制的流式熒光計(jì)，用來進(jìn)行自由抗體、自由抗原和抗體-抗原復(fù)合物的快速分離和定量檢測[42]。Blake等[43]建立了基于制備的特異性抗體2A81G5和KinExA?3000免疫傳感器檢測重金屬的模型，能準(zhǔn)確測定加標(biāo)水樣的Cd2+濃度，獨(dú)立運(yùn)行7 次測定其變異系數(shù)為0.81%～7.28%。Yu Haini等[44]利用KinExATM3000建立了一 個(gè)自動(dòng)的免疫傳感器，并對Uo+進(jìn)行檢測。該傳感器對Uo+的檢測范圍是1.4～2.4 μg/kg，檢測變異系數(shù)為3.5%～5.9%。在免疫技術(shù)的基礎(chǔ)上，市售KinExA?3000，可自動(dòng)加樣運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照設(shè)定環(huán)境樣本進(jìn)行分析檢測?，F(xiàn)在已有利用生物素標(biāo)記來分析環(huán)境污染物中六價(jià)鉻、鈾的模型建成。利用生物素標(biāo)記測得鈾檢測限為1.4～2.4 ng/mL，鈾測定的變異系數(shù)在3.5%～5.9%，平均值為4.6%。鈾加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)平均回收率為（99.17±7.05）%。該類免疫傳感器靈敏度高、特異性強(qiáng)，有望用于定量監(jiān)測環(huán)境和臨床樣本中的金屬離子。

生物傳感器法靈敏、準(zhǔn)確、特異性好，檢測操作簡單，檢測方便快速，但傳感器設(shè)計(jì)復(fù)雜，需要特定的儀器設(shè)備，該方法適用于臨床樣本等需要精確快速定量的檢測中，一般其靈敏度要高于其他免疫學(xué)檢測方法。

4 結(jié) 語

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的迅速發(fā)展，食品中重金屬污染問題越來越受到人們的重視，對于如何快速準(zhǔn)確檢測樣品中的痕量重金屬離子成為世界性的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)重金屬檢測方法（紫外分光光度法除外）檢測限一 般在10-10～10-12g/L，新型檢測法如石墨爐原子吸收法檢測限可達(dá)10-14g/L；普通免疫學(xué)檢測方法重金屬檢測限可達(dá)10-9～10-11g/L，而新型免疫分析方法如熒光分析法和免疫傳感器法等檢測限可達(dá)10-12～10-13g/L[44]，可滿足一般的重金屬檢測要求。在僅依靠傳統(tǒng)檢測手段并不能很好的滿足人們的檢測需求時(shí)，就需要多方面的科研人員運(yùn)用現(xiàn)代高新技術(shù)來研發(fā)特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便、快捷的重金屬檢測方法。免疫學(xué)快速檢測方法具有方便、快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測中的應(yīng)用優(yōu)勢會(huì)日漸明顯。

重金屬離子免疫學(xué)檢測中抗重金屬離子的高親和力、高特異性抗體的制備是基礎(chǔ)，如今通過抗體改造[45]、蛋白修飾或基因重組等技術(shù)手段處理可獲得更高特異性、靈敏度和更穩(wěn)定的單克隆抗體，這為免疫學(xué)檢測手段的提高提供了技術(shù)平臺(tái)。加上新技術(shù)手段和新標(biāo)記技術(shù)的不斷涌現(xiàn)也促進(jìn)了免疫學(xué)檢測技術(shù)的快速發(fā)展。目前該檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品中各類生物毒素和部分重金屬污染物的檢測，但重金屬檢測樣品多為水樣、液體樣，在實(shí)際樣品前處理到免疫學(xué)檢測過程中還存在某些技術(shù)難點(diǎn)，非液體樣品的重金屬免疫學(xué)檢測方法的建立還需要進(jìn)一步研究與探索。

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Advances in Rapid Immunoassay of Heavy Metals

LIU Yan-mei, ZHONG Hui, XIANG Jun-jian*
(Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering, Antibody Engineering Center, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Heavy metal immunoassay is a new technology for the detection of heavy metals. Over the traditional chemical methods, immunoassay has many advantages such as fast detection, low cost, simple operation, high sensitivity and excellent selectivity. It can be used for rapid detection on site. The recent progress of heavy metal immunoassay is briefly reviewed in this article. Future development trends and prospects are also proposed.

heavy metal; monoclonal antibody immunoassays; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); colloidal gold immuno-chromatographic assay (CIA); fluorescence polarization immunoassay (FPIA)

R994.4

A

1002-6630（2014）17-0306-06

10.7506/spkx1002-6630-201417058

2014-03-21

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012A020200003）；廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2010B090400426）

劉艷梅（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榭贵w技術(shù)及其應(yīng)用。E-mail：lym1265@163.com

*通信作者：向軍儉（1952—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)榉肿用庖吲c工程抗體及應(yīng)用。E-mail：txjj@jnu.edu.cn