氧化魔芋葡甘露聚糖對齊口裂腹魚品質(zhì)和脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

周 成，鄔應(yīng)龍，向世瓊，夏曉杰

氧化魔芋葡甘露聚糖對齊口裂腹魚品質(zhì)和脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

周 成，鄔應(yīng)龍*，向世瓊，夏曉杰

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

目的：研究日糧氧化魔芋葡甘露聚糖（oxidized konjac glucomannan，OKGM）對齊口裂腹魚的品質(zhì)和脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法：將初始體質(zhì)量為80 g的齊口裂腹魚隨機(jī)分成5 組，分別飼喂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0（對照組）、0.4%、0.8%、1.6%、3.2% OKGM，養(yǎng)殖60 d后，考察OKGM對齊口裂腹魚的品質(zhì)和脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果：與對照組相比，日糧OKGM添加量為1.6%和3.2%能顯著增加齊口裂腹魚腹肌中蛋白質(zhì)含量（P＜0.05），添加量為0.8%時，會顯著降低腹肌粗脂肪含量（P＜0.05），OKGM添加量對齊口裂腹魚肌肉中水分和粗灰分無顯著影響（P＞0.05）；添加量對齊口裂腹魚肌肉的pH值、失水率、羥脯氨酸含量、膠原蛋白含量的影響均無顯著性差異（P＞0.05）；添加量為1.6%時能顯著升高肌肉中過氧化物酶體增殖物激活受體-α（peroxisome proliferator activated receptor-α，PPAR-α）mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05），添加量為0.8%能顯著升高肝胰臟中PPAR-α mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；添加量為0.8%能極顯著降低齊口裂腹魚肌肉中脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP）mRNA表達(dá)水平（P＜0.01），添加量對肝胰臟中FABP mRNA表達(dá)水平的影響差異均不顯著（P＞0.05）。結(jié)論：日糧中添加適量OKGM能改善齊口裂腹魚的品質(zhì)，調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)。

氧化魔芋葡甘露聚糖；齊口裂腹魚；品質(zhì)；過氧化物酶體增殖物激活受體-α；脂肪酸結(jié)合蛋白

齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti Tchang）為川西高原特有的冷水性魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，是產(chǎn)區(qū)名貴的野生經(jīng)濟(jì)魚類[1-2]。目前，齊口裂腹魚的人工繁殖技術(shù)已經(jīng)基本成熟[3]，并逐步開始了集約化養(yǎng)殖。但在養(yǎng)殖過程中，各種疾病時有發(fā)生，影響了齊口裂腹魚人工養(yǎng)殖的發(fā)展[4]。有效提高養(yǎng)殖魚類的品質(zhì)，保證魚肉的質(zhì)量安全，對促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。

氧化魔芋葡甘露聚糖是魔芋葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM）經(jīng)適當(dāng)?shù)难趸瘎┭趸笾频玫?。KGM是到目前為止最優(yōu)良的可溶性膳食纖維，同時具有降血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫等生理功能，對預(yù)防和輔助治療各種疾病，如肥胖癥、腸道癌、心血管病、糖尿病等，具有重要作用[5]。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬Ⅱ型核受體家族成員[6]。PPARs分為α、β、γ 3個亞型[7]。PPARs在介導(dǎo)脂肪酸氧化及脂肪代謝中起重要作用，其靶基因均與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑有關(guān)。Desvergne等[8]報道，PPARs可增加脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶的表達(dá)，刺激細(xì)胞對脂肪酸的攝入和向脂酸CoA的轉(zhuǎn)化PPARs是調(diào)控肝臟脂肪酸氧化酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。Panadero等[9]研究表明：PPAR-α可以調(diào)節(jié)若干線粒體脂肪酸催化酶的表達(dá)，通過誘導(dǎo)肌肉和肝臟特異性的肉毒堿棕擱酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶表達(dá)而調(diào)控脂肪酸向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，刺激β-氧化過程，降低脂肪酸和甘油三酯合成。脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP）屬于脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員，是一類分子質(zhì)量較小而對脂肪酸有高親和力的可溶性蛋白質(zhì)[10]，有研究表明，心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）表達(dá)量與肌間脂肪含量呈正相關(guān)[11]，因此脂肪酸結(jié)合蛋白基因被作為肌肉間脂肪的候選基因。

本實驗主要研究日糧中添加氧化魔芋葡甘露聚糖（oxidized konjac glucomannan，OKGM）對齊口裂腹魚肌肉品質(zhì)的影響，并通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)檢測齊口裂腹魚脂肪代謝相關(guān)基因PPAR-α、FABP的mRNA表達(dá)水平。由于沉淀在肌肉內(nèi)的脂肪含量與肉的嫩度和風(fēng)味有直接的關(guān)系，對齊口裂腹魚PPARs及其脂肪代謝相關(guān)基因的研究，可為齊口裂腹魚育種和品質(zhì)改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OKGM由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院功能性食品實驗室自制[12]；齊口裂腹魚購自四川省雅安天泉雅魚場，為2011年孵化的同一批魚種，體質(zhì)量（79.54±8.12）g/尾，選擇體質(zhì)健壯的實驗魚300 尾，暫養(yǎng)馴食14 d后開始實驗；魚粉、豆粕、玉米、麩皮、魚用多維、礦物添加劑、磷酸二氫鈣由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所提供；菜油、面粉購自雅安市農(nóng)貿(mào)市場。

總膽固醇、甘油三酯試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRNzol 天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM日本TaKaRa公司；西班牙瓊脂糖 北京恒奧生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、熒光定量PCR儀、水平電泳槽、電泳儀 美國Bio-Rad公司；微量移液器、Centrifuge 5810R高速低溫離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 動物飼養(yǎng)與管理

1.3.1 動物分組與管理

暫養(yǎng)2 周后，選擇健康無傷病的齊口裂腹魚隨機(jī)分組，設(shè)1 個對照組，4 個OKGM處理組，每個處理組設(shè)3 個平行組。每個處理組投放20 尾魚，每個重復(fù)組投入1 個魚缸（規(guī)格為0.70 m×0.50 m×0.50 m），共15 個魚缸，按實驗設(shè)計分別編號。每天以體質(zhì)量2.5%的量投喂飼料，定時、定質(zhì)、定量投喂飼料，實驗期間水溫為 18～22 ℃，pH 7.4～7.6。實驗期間保持微流水，各實驗池水體每天的交換量為30%。實驗結(jié)束禁食24 h，進(jìn)行各種指標(biāo)的測定。

1.3.2 實驗飼料

表1 實驗飼料的組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diets %

以魚粉、豆粕為蛋白源，以食用菜油為脂肪源，參照美國國家科學(xué)研究委員會（1994）魚類的營養(yǎng)需要，段彪[13]和何雷[14]等的齊口裂腹魚飼料配方設(shè)計，基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平見表1，飼料原料均過40目篩，按飼料配方表制得基礎(chǔ)飼料；在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%的OKGM，分別記為對照組、OKGM0.4、OKGM0.8、OKGM1.6、OKGM3.2組，配成氮含量和能量相等的5 種飼料，實驗飼料充分混合后用制粒機(jī)加工成直徑1 mm的硬顆粒飼料，干燥并密封保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 樣品采集

實驗結(jié)束時，解剖齊口裂腹魚后迅速取出肝胰臟和肌肉組織，放入液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆?；背肌取? 根背鰭至最后1 根背鰭之間，側(cè)線以上白肌，腹肌取側(cè)線以下腹部肌肉（每次取樣位置盡可能在相同位置），置于-20 ℃冰箱中保存。

1.4.2 魚肉基本組成的測定

魚體粗蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測定（GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》）；粗脂肪和肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）采用索氏抽提儀測定法（GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》）；水分采用干燥法測定（GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》）；粗灰分采用馬福爐灼燒法測定（GB 5009.4—2010《灰分的測定》）。

1.4.3 肌肉pH值[15]和失水率[16]的測定

魚宰殺后取背部肌肉5 g，冷藏于4 ℃冰箱中24 h后，剔除肌間刺剪碎，加入少量蒸餾水，用研缽碾碎勻漿，然后轉(zhuǎn)移到小燒杯內(nèi)，加入等量蒸餾水混和均勻，靜置10 min后，提取上清液，用酸度計測定pH值。重復(fù)3 次，取平均值。

取魚體背部肌肉（相同位置）5 g，稱質(zhì)量m0，于沸騰水中煮5 min，撈出冷卻，吸去魚肉表面水分，稱質(zhì)量為m，按照公式（1）計算失水率，重復(fù)3 次，計算平均失水率。

1.4.4 肌肉羥脯氨酸含量的測 定及膠原蛋白含量[17]計算

羥脯氨酸含量按照試劑盒說明書測定，以鮮樣計。膠原蛋白含量按照公式（2）計算，以濕質(zhì)量計。

1.4.5 肌肉和肝胰臟PPAR-α mRNA、FABP mRNA表達(dá)水平的測定

1.4.5.1 引物設(shè)計與合成

用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)GenBank中齊口裂腹魚β-actin基因序列（JQ013000）、PPAR-α基因序列（KF316324）、FABP基因序列（GU205786）設(shè)計特異性引物，引物序列如表2。

表2 引物序列及退火溫度Table 2 Primer sequences and corresponding annealing temperatures

1.4.5.2 總RNA提取和cDNA制備

參照TRNzol總RNA提取試劑盒說明書方法提取RNA，用1 g/100 mL的瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取RNA的完整性，OD260nm/OD280nm檢測樣本純度。

cDNA由反轉(zhuǎn)錄試劑盒法制備放置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5.3 RT-PCR基因檢測

采用SYBR GreenⅠ熒光染料法，10 μL反應(yīng)體系，含5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）、上下游引物各0.25 μL、1 μL cDNA、3.5 μL DEPC水。熒光定量PCR步驟：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，55.8 ℃（β-actin） 30 s，39 個循環(huán)；95 ℃ 10 s；擴(kuò)增完畢后，迅速降溫到65 ℃進(jìn)行溶解曲線分析，然后以0.5 ℃/s的速率從65 ℃遞增到95 ℃，連續(xù)測定樣品熒光強(qiáng)度以獲取溶解曲線。

1.4.5.4 相對表達(dá)量 的分析

以β-actin基因作為內(nèi)參基因，選擇一校準(zhǔn)樣本，比較待測樣本相對校準(zhǔn)樣本的表達(dá)差異，利用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析[18]。

式中：Δ ΔCt=（Ct受檢基因-Ctβ-actin）待測樣本-（Ct受檢基因-Ctβ-actin）校準(zhǔn)樣本

結(jié)果是通過參照基因表達(dá)水平校正的待測樣本中的目標(biāo)基因相對于校準(zhǔn)樣本的相對表達(dá)量，用參照基因校準(zhǔn)目標(biāo)基因表達(dá)來彌補(bǔ)樣本組織量的差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果用x±s表示，采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），Duncan’s多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧OKGM對齊口裂腹魚品質(zhì)的影響

2.1.1 日糧OKGM對齊口裂腹魚背肌和腹肌基本成分的影響

表3 日糧OKGM對齊口裂腹魚的背肌和腹肌基本成分的影響x±s，n＝8）Table 3 Effect of dietary OKGM on basic composition of back muscle and abdominal muscle of Schizothorax prenanti Tchang x±s，n＝8) g/100 g

由表3可知，與對照組相比，日糧OKGM添加量對齊口裂腹魚背肌水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分的影響均不顯著（P＞0.05），當(dāng)日糧OKGM添加量達(dá)到1.6%

及以上時，能顯著增加齊口裂腹魚腹肌中蛋白質(zhì)含量（P＜0.05），當(dāng)日糧中添加了OKGM，齊口裂腹魚腹肌粗脂肪均有所降低，但OKGM添加量為0.8%時，腹肌粗脂肪才顯著降低（P＜0.05），日糧OKGM添加量對齊口裂腹魚腹肌中水分和粗灰分影響不顯著（P＞0.05）。

2.1.2 日糧OKGM對齊口裂腹魚肌肉pH值、失水率、羥脯氨酸及膠原蛋白含量的影響

表4 日糧OKGM對齊口裂腹魚肌肉中pH值、失水率、羥脯氨酸及其膠原蛋白含量的影響（x±s，n＝8）Table 4 Effect of dietary OKGM on muscle pH, dehydration rate, hydroxyproline content and collagen content of Schizothorax prenanti Tchang (x±s，n＝8)

由表4可知，齊口裂腹魚肉冷藏24 h后，與對照組相比，日糧OKGM添加量為0.4%和1.6%能顯著降低肌肉的pH值（P＜0.05），日糧OKGM添加量對齊口裂腹魚肌肉中的失水率、羥脯氨酸含量、膠原蛋白含量的影響均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 日糧OKGM對齊口裂腹魚IMF的影響

由圖1可知，與對照組相比，日糧OKGM添加量為0.8%時能顯著降低齊口裂腹魚IMF含量（P＜0.05），其他組間的差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 日糧OKGM對齊口裂腹魚IMF的影響Fig.1 Effect of dietary OKGM on intramuscular fat of Schizothorax prenanti Tchang

2.3 日糧OKGM對齊口裂腹魚肌肉和肝胰臟PPAR-α mRNA、FABP mRNA表達(dá)水平的影響

2.3.1 日糧OKGM對齊口裂腹魚肌肉中PPAR-α mRNA表達(dá)水平的影響

圖2 日糧OKGM對齊口裂腹魚肌肉中PPAR-α mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of dietary OKGM on PPAR-α mRNA expression level in muscle of Schizothorax prenanti Tchang

由圖2可知，日糧OKGM組肌肉中PPAR-α mRNA 表達(dá)水平都高于對照組，當(dāng)OKGM添加量為1.6%時，肌肉中PPAR-α mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05），其他組PPAR-α mRNA增加都不顯著（P＞0.05）。

2.3.2 日糧OKGM對齊口裂腹魚肝胰臟中PPAR-α mRNA表達(dá)水平的影響

圖3 日糧OKGM對齊口裂腹魚肝胰臟PPAR-α mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of dietary OKGM on PPAR-α mRNA expression level in liver of Schizothorax prenanti Tchang

由圖3可知，日糧OKGM組肝胰臟中PPAR-α mRNA 表達(dá)水平都高于對照組，當(dāng)OKGM添加量為0.8%時，肝胰臟中PPAR-α mRNA 表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05），其他組PPAR-α mRNA增加都不顯著（P＞0.05）。

2.3.3 日糧OKGM對齊口裂腹魚肌肉中FABP mRNA表達(dá)水平的影響

圖4 日糧OKGM對齊口裂腹魚肌肉中FABP mRNA表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of dietary OKGM on FABP mRNA expression level in muscle of Schizothorax prenanti Tchang

由圖4可知，與對照組相比，日糧OKGM添加量為0.8%能極顯著降低齊口裂腹魚肌肉中FABP mRNA表達(dá)水平（P＜0.01），其他組差異都不顯著（P＞0.05）。

2.3.4 日糧OKGM對齊口裂腹魚肝胰臟中FABP mRNA表達(dá)水平的影響

圖5 日糧OKGM對齊口裂腹魚肝胰臟中FABP mRNA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of dietary OKGM on FABP mRNA expression level in liver of Schizothorax prenanti Tchang

由圖5可知，與對照組相比，日糧OKGM添加量對齊口裂腹魚肝胰臟中FABP mRNA表達(dá)水平影響均不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

實驗結(jié)果表明，日糧OKGM添加量對齊口裂腹魚背肌和腹肌中的水分和粗灰分含量沒有影響，但能增加齊口裂腹魚腹肌中蛋白質(zhì)含量，降低腹肌粗脂肪含量，這與向梟等[19]的研究結(jié)果基本一致，對齊口裂腹魚肌肉的pH值、失水率、羥脯氨酸和膠原蛋白含量基本沒有影響，魚肌肉的pH值直接影響肌肉組織的系水力和嫩度，當(dāng)宰后肌肉pH值下降時肌肉組織的蛋白質(zhì)保持內(nèi)含水分的能力隨之降低。pH值越高，肌肉的嫩度越好，本實驗中添加OKGM對齊口裂腹魚肌肉中的pH值并沒有造成顯著影響，因此添加OKGM不會降低其持水力，影響其品質(zhì)，綜上所述，日糧中添加適量的OKGM能一定程度改善齊口裂腹魚肌肉品質(zhì)。

本實驗中，日糧添加OKGM能升高肌肉和肝胰臟中PPAR-α mRNA表達(dá)水平，PPAR-α可以調(diào)節(jié)若干線粒體脂肪酸催化酶的表達(dá)，通過誘導(dǎo)肌肉和肝臟特異性的肉毒堿棕擱酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶表達(dá)而調(diào)控脂肪酸向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，刺激β-氧化過程，降低脂肪酸和甘油三酯合成。

日糧OKGM添加量為0.8%能極顯著降低齊口裂腹魚肌肉中FABP mRNA表達(dá)水平，但對齊口裂腹魚肝胰臟中FABP mRNA表達(dá)水平的影響不顯著。FABP主要參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，可將脂肪酸從細(xì)胞膜上運(yùn)送到甘油三酯和磷脂合成的位點(diǎn)，調(diào)節(jié)體脂含量，尤其是調(diào)節(jié)肌間脂肪含量。FABP能夠加強(qiáng)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的濃度，優(yōu)先結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸，促進(jìn)甘油三酯的合成。本實驗結(jié)果顯示，當(dāng)OKGM添加量為0.8%時能夠顯著降低齊口裂腹魚肌肉中FABP mRNA表達(dá)水平，這與IMF含量變化趨勢一致，這與林亞秋等[20]的研究結(jié)果基本一致。而肌間脂肪被認(rèn)為與肉質(zhì)風(fēng)味及口感呈正相關(guān)，影響肉質(zhì)的嫩度、風(fēng)味、多汁性，特別是肉的嫩度[21]。因此，深入了解動物體脂肪組織的發(fā)育和生長機(jī)理對于控制多余脂肪沉積有積極意義。

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Effect of Dietary Oxidized Konjac Glucomannan on Quality and Lipid Metabolism-Related Gene Expression of Schizothorax prenanti Tchang

ZHOU Cheng, WU Ying-long*, XIANG Shi-qiong, XIA Xiao-jie
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Objective: To study the effect of dietary oxidized konjac glucomannan (OKGM) on the quality and lipid metabolismrelated gene expression of Schizothorax prenanti Tchang (SPT). Methods: The SPT with body weight of approximately 80 g were randomly divided into five groups which were fed 0 (control group), 0.4%, 0.8%, 1.6% and 3.2% (experimental groups) OKGM for 60 days, respectively. The results showed that compared with the control group, the protein content in abdominal muscle of SPT was significantly increased by adding 1.6% and 3.2% OKGM in the SPT diet (P ＜ 0.05), the fat content in abdominal muscle was significantly reduced by adding 0.8% OKGM in the diet (P ＜ 0.05); however, the amount of OKGM had no significant impact on muscle moisture or crude ash in SPT (P ＞ 0.05). In addition, no significant difference in pH, dehydration rate, hydroxyproline content or collagen content in abdominal muscle of SPT was observed in response to varying amounts of OKGM (P ＞ 0.05). Meanwhile, PPAR-α mRNA expression level in muscle of SPT was significantly increased by dietary addition of 1.6% OKGM (P ＜ 0.05), and a significant increase in this parameter was also observed for liver of SPT administered with 0.8% OKGM (P ＜ 0.05). In contrast, FABP mRNA expression level in muscle of SPT was significantly decreased by dietary addition of 0.8% OKGM (P ＜ 0.01), yet the amount of OKGM had no significant impact on the expression level of FABP mRNA in liver (P ＞ 0.05). Conclusion: The dietary addition of OKGM can improve the quality of SPT and regulate the gene expression associated with lipid metabolism.

oxidized konjac glucomannan; Schizothorax prenanti Tchang; quality; peroxisome proliferator activated receptor-α; fatty acid-binding protein

TS254.1

A

1002-6630（2014）17-0245-05

10.7506/spkx1002-6630-201417047

2013-10-25

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“211工程”雙支計劃項目（2014）

周成（1986—），男，碩士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：806888397@qq.com

*通信作者：鄔應(yīng)龍（1963—），男，教授，博士，研究方向為功能性食品。E-mail：wuyinglong99@163.com