馬奶及其制品中腸球菌屬乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)

王夢(mèng)姣，李少英,*，李淑芬，賀文英，宋曉敏，馬春艷，李 貞，駱 袁

馬奶及其制品中腸球菌屬乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)

王夢(mèng)姣1，李少英1,*，李淑芬2，賀文英3，宋曉敏1，馬春艷1，李 貞1，駱 袁4

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；4.呼和浩特鐵路局，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010057）

目的：為使具有民族特色和特殊功效的馬奶及其制品中的有益乳酸菌應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)，確保分離自內(nèi)蒙古牧區(qū)靠自然發(fā)酵制作的馬奶及其制品中的乳酸菌的安全性，對(duì)分離自馬奶及其制品中的乳酸菌進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。方法：通過吲哚實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)、氨基脫羧酶實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、D-乳酸檢測(cè)及質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)，確定菌株是否含有有害代謝產(chǎn)物及有無耐藥性。結(jié)果：菌株的吲哚實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)、氨基脫羧酶實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)均為陰性，在菌株JHZ9、JHZ15、JHZ25、JNN1中檢出了少量的D-乳酸，菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)所選藥品無耐藥性且未檢測(cè)到可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒。結(jié)論：7 株腸球菌屬的乳酸菌在代謝活動(dòng)中不產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，不存在可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒。

乳酸菌；安全性；有害代謝產(chǎn)物；耐藥性；質(zhì)粒

酸馬奶是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵奶產(chǎn)品，起源于中亞草原，其生產(chǎn)和消費(fèi)在東歐和中亞國(guó)家有著悠久的歷史[1]。酸馬奶又稱熟馬奶[2]，可改善人體消化功能、降血壓、降血脂、提高免疫力、改善心血管類疾病等[3-4]。馬奶較其他畜類奶含有豐富的蛋白質(zhì)、乳糖、維生素和礦物質(zhì)，且馬奶中的馬乳蛋白易被人體消化[5]，馬奶中還含有豐富的?；撬?、乳糖和必需脂肪酸。馬奶及酸馬奶的功效、獨(dú)特的風(fēng)味口感與其中的微生物有必然聯(lián)系，因此對(duì)從中分離出的乳酸菌的研究十分必要。

內(nèi)蒙古牧區(qū)的酸馬奶采用家庭手工制作、自然發(fā)酵的方式獲取，其產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特，倍受人們的青睞。其中的有益乳酸菌更是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)，目前對(duì)乳酸菌的研究主要集中在產(chǎn)品的開發(fā)上，而這其中乳酸菌的安全性研究就顯得尤為重要。乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)從受試對(duì)象上分類包括：體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)[6]。體外實(shí)驗(yàn)主要是關(guān)于乳酸菌代謝活動(dòng)和細(xì)胞特性的研究。代謝活動(dòng)研究主要是確定乳酸菌是否含有胺、氨、吲哚、苯酚、致癌亞膽酸和降解黏膜的酶，細(xì)胞特性要確定乳酸菌株有沒有耐藥性[6]。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期對(duì)馬奶及其制品酸馬奶中的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定及初步的生化特性、抗菌特性的研究的基礎(chǔ)上[7-10]，對(duì)從馬奶及其制品中分離出來的7 株腸球菌屬乳酸菌進(jìn)行體外安全性實(shí)驗(yàn)，包括有害代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)和菌株耐藥性實(shí)驗(yàn)，確定7 株腸球菌屬的乳酸菌在發(fā)酵過程中是否會(huì)產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物、是否帶有耐藥基因、耐藥基因是否存在于質(zhì)粒，從而對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

腸球菌JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28均來源于內(nèi)蒙古錫林郭勒牧區(qū)酸馬奶中，腸球菌JNN1來源于內(nèi)蒙古錫林郭勒牧區(qū)馬奶中，大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922，均由國(guó)家自然基金課題組（No.31060014）提供。標(biāo)準(zhǔn)菌株為糞腸球菌（E. faecalis）CICC23658，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

MRS液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基、Taylor氏脫羧酶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基等培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[6,11-12]進(jìn)行配制。

血瓊脂平板 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；D-/L-乳酸檢測(cè)試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer 寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒 天根生化科技有限公司；瓊脂糖、Tris-Base 美國(guó)Sigma公司；乙二胺四乙酸、硼酸天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DYY-6D型電泳儀電源、DYCP-31DN型電泳儀 北京市六一儀器廠；圖像記錄分析儀 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)22 h，活化3 代。

1.3.2 產(chǎn)乳酸實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 凝乳實(shí)驗(yàn)

將活化好的第3代菌液3 000 r/min離心10 min，棄掉上清液。加入與培養(yǎng)液等體積的無菌生理鹽水，3 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，如此重復(fù)離心洗滌3 次后加入與培養(yǎng)液等體積的生理鹽水制成供試菌液，將供試菌液按3%的接菌量接入無菌脫脂乳中，37 ℃培養(yǎng)7 d，期間觀察記錄。

1.3.2.2 酸度滴定

將上述培養(yǎng)7 d的乳酸菌，按照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測(cè)定》進(jìn)行酸度測(cè)定。

1.3.3 有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 吲哚實(shí)驗(yàn)

在無菌條件下，將活化好的8 株菌株按3%的接菌量分別接入到蛋白胨水培養(yǎng)基中。37 ℃培養(yǎng)72 h，加入吲哚試劑8～10 滴，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 硝酸鹽還原酶活性檢測(cè)

在無菌條件下，將活化好的8 株菌株按3%的接菌量分別接入到硝酸鹽培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)5 d后，滴加碘化鉀溶液和淀粉溶液各10 滴，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)[12]。

1.3.3.3 溶血實(shí)驗(yàn)

在無菌條件下，將活化好的8 株菌株用滅菌的接菌環(huán)劃線和穿刺于血瓊脂平板中，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察有無溶血圈出現(xiàn)。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)[13-14]。

1.3.3.4 氨基脫羧酶活性檢測(cè)

在無菌條件下，將活化好的8 株菌株按3%的接菌量分別接入Taylor氏脫羧酶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基（鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸），37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察記錄結(jié)果。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)[11]。

1.3.3.5 乳酸旋光性檢測(cè)

使用愛爾蘭Megazyme公司的D-/L-乳酸檢測(cè)試劑盒對(duì)D-乳酸進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 耐藥性檢測(cè)

1.4.1 藥敏實(shí)驗(yàn)

利用紙片法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，藥敏紙片：諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素[15]。

1.4.2 質(zhì)粒提取

取0.2 g瓊脂糖加1×TBE（Tris-硼酸）電泳緩沖液20 mL溶解降溫至60 ℃，加入1 μL核酸染料，混勻，倒入電泳槽制膠。

取1.5 mL培養(yǎng)好的菌液，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。取提取的液體5 μL，加入1 μL 6×Loading buffer，點(diǎn)樣于制備好的瓊脂糖凝膠，電泳液為1×TBE溶液，電壓設(shè)定110 V，工作30 min。用圖像記錄分析系統(tǒng)對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。

以大腸埃希氏菌ATCC 25922作為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)乳酸實(shí)驗(yàn)

2.1.1 凝乳實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示8 株菌株37 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，除標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC23658外，接入其他7 株菌株的脫脂乳均凝乳。牛乳中的酪蛋白遇胃酸后結(jié)成的凝塊較硬，而乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸使蛋白質(zhì)形成微細(xì)的凝乳，使凝塊變軟，更利于人體消化[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，7 株菌株凝乳效果均較好。

2.1.2 酸度滴定

標(biāo)定后NaOH溶液濃度為0.104 7 mol/L，8 株菌株酸度滴定結(jié)果如表1所示。

表1 菌株酸度滴定結(jié)果Table 1 Titratable acidity produced by eight tested strains

由表1可知，菌株JHZ9、JHZ15、JHZ22經(jīng)發(fā)酵后的酸度均≥70°T，菌株JHZ17、JHZ25、JHZ28酸度略低于70°T，但接近70°T，菌株JNN1和CICC23658酸度較低。

乳酸菌的產(chǎn)酸能力是其能否用于發(fā)酵制品的重要指標(biāo)。GB 19301—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 生乳》規(guī)定，發(fā)酵乳的理化指標(biāo)中酸度≥70°T。結(jié)果說明菌株JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28發(fā)酵能力較好，其發(fā)酵乳的酸度基本符合國(guó)家發(fā)酵乳標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2 有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 吲哚實(shí)驗(yàn)

8 株菌株吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，向培養(yǎng)好的菌液中滴加指示劑，均未出現(xiàn)紅色圓環(huán)，說明未產(chǎn)生吲哚類物質(zhì)。

吲哚實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)菌株是否能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸。色氨酸為人體必需氨基酸，參與人體蛋白質(zhì)合成、調(diào)節(jié)免疫功能和促進(jìn)消化。色氨酸代謝過程發(fā)生障礙會(huì)引起肝功能衰退、惡性腫瘤等[16]。吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株不會(huì)分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。

2.2.2 硝酸鹽還原酶活性檢測(cè)

細(xì)菌如果產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，會(huì)將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，與碘化鉀溶液反應(yīng)會(huì)置換出碘單質(zhì)，滴加淀粉溶液培養(yǎng)基會(huì)變?yōu)樗{(lán)色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所有菌液均未變藍(lán)，為陰性反應(yīng)。

硝酸鹽還原酶可以將食物中含有的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是強(qiáng)致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，與食品中蛋白質(zhì)分解中間產(chǎn)物仲胺反應(yīng)形成亞硝胺，后者可誘發(fā)多種癌癥如肝癌、胃癌、食道癌和咽癌等[17]。結(jié)果說明菌株代謝產(chǎn)物中不含有硝酸還原酶或硝酸還原酶無活性。

2.2.3 氨基脫羧酶活性檢測(cè)

具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿性，滴加指示劑（溴甲酚紫），呈黃色為陰性，呈紫色為陽性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示測(cè)定管呈黃色，為陰性。

一些乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，能夠?qū)⑹称分械陌被崦擊冗€原成生物胺類物質(zhì)，若胺類在體內(nèi)聚積過多，則會(huì)引起中毒癥狀[18]。檢測(cè)結(jié)果說明乳酸菌代謝產(chǎn)物中不含有氨基脫羧酶。

2.2.4 溶血實(shí)驗(yàn)

圖1 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of hemolysis test

如圖1所示，在培養(yǎng)的生長(zhǎng)物周圍的瓊脂未顯示綠色，說明沒有產(chǎn)生α-溶血；在穿刺物和劃線瓊脂的周圍未出現(xiàn)透明圈，說明沒有產(chǎn)生β-溶血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為γ-溶血，即對(duì)溶血無作用或不溶血[13]。

溶血是指紅細(xì)胞破裂溶解現(xiàn)象，可由多種理化因素和毒素引起。如某些溶血性鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌可導(dǎo)致敗血癥，瘧原蟲破壞紅細(xì)胞和某些溶血性蛇毒含卵磷脂酶，使血漿或紅細(xì)胞的卵磷脂轉(zhuǎn)變?yōu)槿苎蚜字?，使紅細(xì)胞膜分解[19]。本實(shí)驗(yàn)7 株菌株均無溶血現(xiàn)象發(fā)生（圖1只列出其中3 株），說明菌株不是溶血細(xì)菌。

2.2.5 乳酸旋光性檢測(cè)

表2 菌株D-/ -乳酸含量檢測(cè)結(jié)果Table 2 D-/ - lactic acid contents produced by eight tested strains

在菌株JHZ9、JHZ15、JHZ25、JNN1和CICC23658中檢出了少量的D-乳酸，結(jié)果如表2所示。乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生的乳酸分為D-乳酸和L-乳酸兩種。人體只具有代謝L-乳酸的L-乳酸脫氫酶，因此只有L-乳酸能被人體完全代謝利用。而D-乳酸和DL-乳酸過量攝入則有可能引起代謝紊亂甚至導(dǎo)致中毒。世界衛(wèi)生組織明確規(guī)定，成人每天攝入D-乳酸的量不得超過100 mg/kg體質(zhì)量，對(duì)于3 個(gè)月以下的嬰兒食品中不應(yīng)加入D-乳酸，而對(duì)于L-乳酸則未加限制[20]。在菌株JHZ9、JHZ15、JHZ25、JNN1和CICC23658中檢測(cè)出了含量很少的D-乳酸，但長(zhǎng)期食用是否會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不良影響還有待進(jìn)一步研究。

2.3 耐藥性檢測(cè)

2.3.1 藥敏實(shí)驗(yàn)

表3 菌株對(duì)7 種抗菌藥的敏感性結(jié)果[20]Table 3 Antimicrobial resistance of the seven strains isolated in this study to seven antimicrobial drugs[20]

由表3可知，7株菌株JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28、JNN1對(duì)紅霉素（大環(huán)內(nèi)酯類藥物）敏感，對(duì)氨芐西林、阿莫西林（青霉素類藥物）敏感，除JHZ15對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星（喹諾酮類藥物）中度敏感，JHZ17對(duì)環(huán)丙沙星中度敏感外，其余菌株對(duì)喹諾酮類藥物敏感。JNN1對(duì)鏈霉素敏感，JHZ15、JHZ17對(duì)鏈霉素有抗性，其余菌株對(duì)鏈霉素（氨基糖苷類藥物）中度敏感[15]。

2.3.2 質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)

圖2 質(zhì)粒提取結(jié)果Fig.2 The results of plasmid extraction test

由圖2可知，通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)菌株JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28、JNN1做質(zhì)粒檢測(cè)，在任何泳道上均未出現(xiàn)條帶，說明在此檢測(cè)方法下未檢測(cè)到7 株菌株含有質(zhì)粒。

近年來倍受關(guān)注的腸球菌攜帶的耐藥基因，例如紅霉素、萬古霉素、四環(huán)素、氯霉素和慶大霉素耐藥相關(guān)的基因都位于質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子這些可轉(zhuǎn)移性遺傳物質(zhì)上[21]。Perreten等[22]在乳酸乳球菌K214中檢測(cè)到了可轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒（pK214）。但實(shí)驗(yàn)中7 株菌株均未提取到耐藥質(zhì)粒，這種情況可能是由于7 株菌株本身并不帶有耐藥質(zhì)粒，也可能是耐藥基因存在于細(xì)菌DNA上，即不攜帶有可轉(zhuǎn)移的耐藥基因。

3 結(jié)論與討論

近年來，乳酸菌安全性問題得到廣泛關(guān)注，大量文獻(xiàn)證明，多數(shù)乳酸菌菌株或使用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵是安全可行的，但也有少量研究結(jié)果表明能夠從一些患者體內(nèi)分離出乳酸菌[23]，可能與菌血癥、心內(nèi)膜炎、尿道感染等疾病有關(guān)[24]。因此，對(duì)新篩選出的擬作為益生菌的乳酸菌進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)是十分必要的，尤其是用于食品的菌株[25]。盡管我國(guó)目前還沒有制定乳酸菌安全性評(píng)價(jià)的相關(guān)準(zhǔn)則，但檢測(cè)乳酸菌菌株的毒性、耐藥性、是否產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物以及在體內(nèi)對(duì)機(jī)體的影響等變化情況同樣必不可少。

2002年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合專家委員會(huì)提出了用于食品的益生菌安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則[26]，建議為確保所使用益生菌菌株的安全性，至少需要進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其安全性：1） 對(duì)其耐藥性進(jìn)行評(píng)價(jià)；2）評(píng)估某些代謝活性；3）對(duì)人體實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的副作用進(jìn)行評(píng)估；4）商品在市場(chǎng)上銷售后，要對(duì)其出現(xiàn)的相關(guān)副作用病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查；5）如果所使用的益生菌菌株所隸屬的菌種對(duì)哺乳動(dòng)物是一種已知的產(chǎn)毒素菌種，則被評(píng)價(jià)的該益生菌菌株必須進(jìn)行產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)；6）如果所使用的益生菌菌株所隸屬的菌種具潛在的溶血活性，則被評(píng)價(jià)的該益生菌菌株必須進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)。

有些乳酸菌可能攜帶有可轉(zhuǎn)移的耐藥基因引起了人們的廣泛關(guān)注。乳酸菌自身出現(xiàn)耐藥性沒有危險(xiǎn)，可以使其更好地適應(yīng)環(huán)境生存下來，發(fā)揮功效，但若耐藥基因可以在乳酸菌和病原菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，使某些病原菌產(chǎn)生耐藥性，后果將不堪設(shè)想。目前已經(jīng)明確乳酸菌存在天然耐藥和獲得性耐藥[27]，天然耐藥為細(xì)菌固有耐藥，一般不具有傳遞性，乳酸菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐受就屬于天然耐藥[28]。而獲得性耐藥多數(shù)來自抗生素的選擇性壓力，這種抗性基因一般存在于菌體的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，腸球菌中結(jié)合轉(zhuǎn)座子和接合性質(zhì)粒的存在對(duì)抗性基因在細(xì)菌之間的轉(zhuǎn)移起著重要作用[29]。Flórez等[30]研究發(fā)現(xiàn)抗四環(huán)素的乳酸乳球菌中含有編碼tetM的可轉(zhuǎn)移因子，使得抗性基因在不含質(zhì)粒的菌株之間轉(zhuǎn)移。2007年 Hummel等[31]在沒有氯霉素耐藥表型的乳酸菌中檢測(cè)到氯霉素耐藥基因（cat），證明無耐藥表型的細(xì)菌可能攜帶耐藥基因。秦宇軒等[32]對(duì)市售酸奶進(jìn)行乳酸菌分離，在對(duì)紅霉素和四環(huán)素敏感的乳酸菌中檢測(cè)到了紅霉素耐藥基因（ermB）和四環(huán)素耐藥基因（tetM）。這一結(jié)果說明對(duì)乳酸菌耐藥基因的研究不應(yīng)只局限于對(duì)抗生素有抗性的乳酸菌。本實(shí)驗(yàn)對(duì)7 種抗生素敏感或耐藥的菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，均未提取到耐藥質(zhì)粒，不存在抗性基因轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腸球菌屬乳酸菌JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28、JNN1均具有良好的凝乳特性，菌株JHZ17、JHZ25、JHZ28、JNN1酸度低于70°T，其余菌株均≥70°T。吲哚實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)、氨基脫羧酶實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)均為陰性。在菌株JHZ9、JHZ15、JHZ25、JNN1和CICC23658中檢出了少量的D-乳酸。菌株JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28、JNN1對(duì)喹諾酮類（氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星）、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素）、青霉素類（氨芐西林、阿莫西林）藥物敏感，除JNN1對(duì)鏈霉素敏感，其他菌株對(duì)氨基糖苷類藥物（鏈霉素）有抗性或呈中度敏感，未檢測(cè)到7 株菌株含有質(zhì)粒。通過體外安全性實(shí)驗(yàn)中有害代謝產(chǎn)物和耐藥性的檢測(cè)，初步證明7 株乳酸菌安全，可為今后菌株應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)提供部分安全性理論依據(jù)，但仍需進(jìn)一步結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)等安全性實(shí)驗(yàn)，對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

[1] CHEN Y, WANG Z, CHEN X, et al. Identification of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from koumiss, a traditional fermented mare’s milk[J]. Journal of Dairy Science, 2010, 93(3): 884-892.

[2] 徐少澤. 馬奶、酸馬奶的食療和醫(yī)用價(jià)值[J]. 中國(guó)民族醫(yī)藥雜志, 2012, 18(2): 21-22.

[3] 王瑞珍. 酸馬奶的營(yíng)養(yǎng)成分與保健特性[J]. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問, 2012(10): 247-248.

[4] WANG Junguo, CHEN Xia, LIU Wenjun, et al. Identification of Lactobacillus from koumiss by conventional and molecular methods[J]. European Food Research and Technology, 2008, 227(5): 1555-1561.

[5] 劉洪元, 高昆. 馬奶及酸馬奶(馬奶酒)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療作用[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2003(4): 45-46.

[6] 張剛. 乳酸細(xì)菌: 基礎(chǔ)技術(shù)和應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007: 194; 421.

[7] 賀銀鳳, 翟光超, 李少英, 等. 酸馬奶酒中糞腸球菌H1-1抑菌物質(zhì)的提取與純化研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(3): 50-52.

[8] 霍小琰, 李少英, 郭榮榮. 酸馬奶中乳酸菌的鑒定及生物學(xué)特性的研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2012, 39(7): 940-948.

[9] 賀銀鳳, 王鋰韞, 李少英, 等. 酸馬奶酒中一株糞腸球菌抑菌物質(zhì)的粗提及特性研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2007, 23(1): 264-267.

[10] 李少英, 烏尼, 李培鋒, 等. 內(nèi)蒙古牧區(qū)乳與乳制品中乳酸菌資源及其生態(tài)分布[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2007, 25(12): 1495-1499.

[11] 陳天壽. 微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1995: 179-396.

[12] 內(nèi)村泰, 崗田早苗. 乳酸菌試驗(yàn)手冊(cè)(日文版)[M]. 日本東京: 朝倉書店, 1992: 30-73.

[13] 凌代文. 乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 1998: 125-126.

[14] CARIOLATO D, ANDRIGHETTO C, LOMBARDI A. Occurrence of virulence factors and antibiotic resistances in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium collected from dairy and human samples in North Italy[J]. Food Control, 2008, 19(9): 886-892.

[15] 王夢(mèng)姣, 李少英, 韋婉, 等. 分離自酸馬奶的腸球菌屬乳酸菌抗性試驗(yàn)[J]. 食品科技, 2013, 38(10): 7-11.

[16] 李劍欣, 張緒梅, 徐琪壽. 色氨酸的生理生化作用及其應(yīng)用[J]. 氨基酸和生物資源, 2005, 27(3): 58-62.

[17] 龔鋼明, 呂玉濤, 管世敏, 等. 乳酸菌亞硝酸鹽還原酶制備及酶學(xué)性質(zhì)[J]. 中國(guó)釀造, 2011, 30(1): 58-60.

[18] 周景文, 堵國(guó)成, 陳堅(jiān). 發(fā)酵食品有害氨(胺)類代謝物: 形成機(jī)制和消除策略[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2011, 11(9): 8-25.

[19] 竇曉明, 孫高英, 單虎. 乳酸菌胞外產(chǎn)物對(duì)副溶血弧菌抑制作用的研究[J]. 海洋科學(xué), 2007, 31(8): 11-14.

[20] 歐提庫爾, 穆斯塔帕, 張志東. L-乳酸的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景[J].新疆化工, 2005(3): 5-11.

[21] 張灼陽, 劉暢, 郭曉奎. 乳酸菌耐藥性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2007, 19(5): 478-480.

[22] PERRETEN V, SCHWARZ F, CRESTA L, et al. Antibiotic resistance spread in food[J]. Nature, 1997, 389: 801-802.

[23] 劉小青, 萬翠香, 徐鋒, 等. 乳酸菌的安全性研究[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2009, 21(10): 952-955.

[24] 楊寶蘭, 徐進(jìn). 益生菌的安全性[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2004, 16(3): 262-265.

[25] WASSENAAR T M, KLEIN G. Safety aspects and implications of regulation of probiotic bacteria in food and food supplements[J]. Journal of Food Protection, 2008, 71(8): 1734-1741.

[26] FAO/WHO Working Group. Guidelines for the evaluation of probiotics in food[R]. London Ontario: FAO/WHO, 2002.

[27] SAARELA M, MOGENSEN G, FONDéN R, et al. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties[J]. Journal of Biotechnology, 2000, 84(3): 197-215.

[28] 莫非, 黃志卓, 渠巍, 等. 貴州省2009年細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2011, 29(6): 473-474.

[29] 李?yuàn)檴? 潛在益生乳桿菌的抗生素敏感性研究[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[30] FLóREZ A B, AMMOR M S, MAYO B. Identification of tet(M) in two Lactococcus lactis strains isolated from a Spanish traditional starter-free cheese made of raw milk and conjugative transfer of tetracycline resistance to lactococci and enterococci[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 121(2): 189-194.

[31] HUMMEL A S, HERTEL C, HOLZAPFEL W H, et al. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(3): 730-739.

[32] 秦宇軒, 李晶, 王秋涯, 等. 市售酸奶中乳酸菌的鑒定與耐藥性[J].微生物學(xué)報(bào), 2013, 53(8): 889-897.

Safety Assessment of Enterococcus Isolated from Mare’s Milk and Its Products

WANG Meng-jiao1, LI Shao-ying1,*, LI Shu-fen2, HE Wen-ying3, SONG Xiao-min1, MA Chun-yan1, LI Zhen1, LUO Yuan4
(1. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 3. College of Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 4. Huhhot Railway Administration, Ho hhot 010057, China)

Objective: This study aimed to isolate lactic acid bacteria (LAB) from mare’s milk and its products, which have nationality characteristics and special functions. The mare’s milk and its products were made by natural fermentation in pastoral areas of Inner Mongolia. In order to ensure their safe application in the food fermentation industry, it is necessary to assess the safety of LAB isolated from mare’s milk and koumiss. Methods: Indole test, nitrate redu ctase assay, amino decarboxylase test, hemolysis test, D-lact ic acid assay and plasmid extraction were performed to identify whether harmful metabolites or drug resistance exists in the tested strains. Results: Negative results were observed in all tests except for D-lactic acid, which was detected in small amounts in strains JHZ9, JHZ15, JHZ25 and JNN1. Neither resistance to the tested drugs nor transferable resistant plasmid was detected in seven tested strains. Conclusion: Neither harmful metabolites nor drug resistant plasmids has been detected in the seven strains, which belong to En terococcus.

lactic acid bacteria; safety; harmful metabolites; drug resistance; plasmids

Q935

A

1002-6630（2014）17-0204-05

10.7506/spkx1002-6630-201417039

2013-11-14

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31060014）

王夢(mèng)姣（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：wmj603320463@sina.com

*通信作者：李少英（1961—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：nmglshy@126.com