基于響應(yīng)曲面法的微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

閆穎娟，盧 儉，周劍忠，李 偉，董明盛,*

基于響應(yīng)曲面法的微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

閆穎娟1,2，盧 儉1,3，周劍忠4，李 偉2，董明盛2,*

（1.忻州師范學(xué)院生物系，山西 忻州 034000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司，江蘇 南京 211100；4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

采用響應(yīng)曲面法對微囊化保加利亞乳桿菌FMG-4高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：最佳培養(yǎng)基配方為：在MRS培養(yǎng)基中添加乳清粉97.15 g/L、大豆蛋白粉10.00 g/L、酵母粉7.55 g/L、碳酸鈣8.03 g/L、硫酸鎂0.30 g/L、硫酸錳0.02 g/L。最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度41.7 ℃、初始pH 6.9。此時(shí)保加利亞乳桿菌FMG-4細(xì)胞菌密度可達(dá)到3.18×1011CFU/g。

液芯微囊；響應(yīng)曲面法；保加利亞乳桿菌；高密培養(yǎng)

酸奶發(fā)酵劑應(yīng)具有較高的活力和穩(wěn)定性。對篩選出來的乳酸菌進(jìn)行高活性、高密度培養(yǎng)（high cell density culture，HCDC）是制備高效乳酸菌酸奶發(fā)酵劑的關(guān)鍵。目前我國大多數(shù)大型乳品加工企業(yè)采用國外進(jìn)口的直投式酸奶發(fā)酵劑，其質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)易行，菌體密度可達(dá)到1011CFU/g，但價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本大[1-3]。液芯微囊發(fā)酵劑是采用生物微囊化技術(shù)將發(fā)酵菌株包裹在球狀微囊內(nèi)，通過連續(xù)培養(yǎng)制備的微囊化發(fā)酵劑。從培養(yǎng)基中分離這種發(fā)酵劑無需經(jīng)過超濾或冷凍離心，普通離心或微過濾即可進(jìn)行，因此大大降低了生產(chǎn)成本，更重要的是可以減輕離心對菌體的傷害。另外，乳酸菌細(xì)胞包囊后還可以防止氧對菌體的損傷以及噬菌體感染，對乳酸菌細(xì)胞起到保護(hù)的作用[4-6]。

將微囊化的酸奶發(fā)酵劑進(jìn)行高密度培養(yǎng)，是其能夠應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的關(guān)鍵。高密度培養(yǎng)是指在液體增菌培養(yǎng)液中，微生物細(xì)胞密度超過正常培養(yǎng)一個(gè)數(shù)量級以上，也被稱為高密度發(fā)酵技術(shù)。HCDC技術(shù)廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中，通過這種培養(yǎng)方式可以降低設(shè)備投資，縮短生產(chǎn)周期，從而降低生產(chǎn)成本，提高商品化發(fā)酵劑的市場競爭力[7-9]。液芯微囊發(fā)酵劑的HCDC研究將為微囊化乳酸菌發(fā)酵劑的實(shí)際生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）FMG-4：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

MRS培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀2.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、硫酸錳0.25 g、蛋白胨10.0 g、酵母浸膏5.0 g、牛肉浸膏10.0 g、葡萄糖20.0 g、硫酸鎂0.58 g、吐溫-80 1.0 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.0，121 ℃滅菌20 min。

海藻酸鈉 ISP美國國際特品公司；脫脂奶粉、低蛋白乳清粉（乳糖含量80%，蛋白質(zhì)含量3%） 新西蘭紐迪希亞公司；大豆蛋白粉（蛋白質(zhì)含量60%） 鎮(zhèn)江市尚谷食品有限公司；黃原膠、殼聚糖、蔗糖（食品級） 上海萬疆生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

自制液芯微囊化細(xì)胞無菌制備裝置；HG303-4A型電熱干燥培養(yǎng)箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；LRH-150型生化培養(yǎng)箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；THZ-D臺式恒溫振蕩器 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；XW-80型旋渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；S-3000N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 液芯微囊的制備

將甘油管保存的保加利亞乳桿菌FMG-4用MRS液體培養(yǎng)基活化2 次，發(fā)酵液離心收集菌體，加入少許生理鹽水懸浮菌泥，再將其倒入質(zhì)量濃度為15 g/L的氯化鈣溶液和質(zhì)量濃度為3 g/L的黃原膠溶液的混合液中制成菌懸液。采用自制液芯微囊無菌制備裝置，將上述菌懸液逐滴滴入磁力攪拌的質(zhì)量濃度為8.8 g/L的海藻酸鈉溶液中反應(yīng)一段時(shí)間，然后用適量的蒸餾水稀釋海藻酸鈉溶液。從稀釋液中過濾出海藻酸鈣液芯微囊，將獲得的海藻酸鈣液芯微囊洗滌后，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量濃度為10 g/L的氯化鈣溶液中進(jìn)行20 min硬化處理，之后用蒸餾水洗掉其表面殘留的氯化鈣，然后將微囊放入預(yù)配好的質(zhì)量濃度為3 g/L的殼聚糖溶液中浸泡。浸泡一定時(shí)間后濾出微囊，再次使用蒸餾水進(jìn)行沖洗，最后將制得的海藻酸鈣液芯微囊成品保存在配制好的生理鹽水中。圖1為液芯微囊的制備過程[10-12]。

圖1 微囊制備流程Fig.1 Flow chart of liquid-core microcapsule preparation

1.3.2 微囊化酸奶發(fā)酵乳酸菌的高密度培養(yǎng)

將制備好的包裹有保加利亞乳桿菌的液芯微囊，按照5%的接種量加入到預(yù)配好的MRS液體增菌培養(yǎng)基中，在40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，之后將液體增菌培養(yǎng)基更換，采用同樣的方法連續(xù)培養(yǎng)5個(gè)批次。培養(yǎng)結(jié)束后，將液芯微囊濾出，殘留液芯微囊外的菌體采用無菌水進(jìn)行洗滌，然后采取化學(xué)破囊法將液芯微囊破碎釋放，最后通過平板計(jì)數(shù)法測試每克液芯微囊內(nèi)的菌體數(shù)量。

1.3.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

1.3.3.1 響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

使用Design Expert軟件，以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用部分重復(fù)因子設(shè)計(jì)方法[13-15]和最陡爬坡試驗(yàn)，研究乳清粉、大豆蛋白粉、酵母粉、碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸錳等組分添加量對微囊化乳酸菌高密度培養(yǎng)的影響。從中篩選出顯著影響組分因子，通過響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)建立細(xì)胞密度的模型方程。

1.3.3.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

采用使用Design Expert軟件，對培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度和初始pH值）進(jìn)行優(yōu)化，建立細(xì)胞密度的模型方程[16]。

1.3.4 高密度培養(yǎng)后微囊內(nèi)外菌體掃描電鏡觀察

將高密度培養(yǎng)后微囊，置于2.5%的戊二醛溶液中固定12 h，用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每次10 min，再分別用50%、70%、90%的乙醇梯度脫水15 min，然后用100%乙醇脫水3 次，每次30 min。用叔丁醇置換3次，每次30 min。將樣品放入臨界點(diǎn)干燥儀中用液態(tài)二氧化碳進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，用雙面膠帶將樣品黏到樣品臺上，用離子濺射儀給樣品鍍上10 nm金膜，最后用S-3000N型掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 微囊化保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 部分重復(fù)因子設(shè)計(jì)法篩選關(guān)鍵因子

通過Design Expert軟件，對乳清粉（X1）、大豆蛋白粉（X2）、酵母粉（X3）、碳酸鈣（X4）、硫酸鎂（X5）、硫酸錳（X6）等關(guān)鍵因子進(jìn)行篩選，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。通過對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，得到保加利亞乳桿菌細(xì)胞密度（Y）的回歸方程為：Y = 10.52+0.25X1-0.035X2+0.14 X3+0.15 X4-0.007 5 X5+0.010X6。

表1 部分重復(fù)因子設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 Experimental design and results of fractional factorial design (FFD)

表2 保加利亞乳桿菌細(xì)胞密度回歸方程方差分析Table 2 ANOVA for the regression equation of L. bulgaricus counts

表3 保加利亞乳桿菌細(xì)胞密度回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression coefficients and their significance for L. bulgaricus counts

對該回歸方程進(jìn)行方差分析（表2），該模型具有極顯著性水平足夠擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。由回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)（表3）可知，培養(yǎng)基中乳清粉、酵母粉和碳酸鈣添加量是極顯著影響因素（P＜0.01），乳清粉、酵母粉、碳酸鈣添加量對乳酸菌細(xì)胞密度具有顯著正相關(guān)效應(yīng)，大豆蛋白粉添加量與乳酸菌細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)效應(yīng)，而硫酸鎂、硫酸錳添加量與乳酸菌細(xì)胞密度無相關(guān)性，期望值變化較小，因此從經(jīng)濟(jì)性角度考慮，取硫酸鎂、硫酸錳的最小值，分別為0.3、0.02 g/L。

2.1.2 最陡爬坡試驗(yàn)

由于大豆蛋白粉、硫酸鎂、硫酸錳添加量對乳酸菌細(xì)胞密度影響不顯著，而乳清粉、酵母粉、碳酸鈣添加量3 個(gè)因素與乳酸菌細(xì)胞密度呈顯著正相關(guān)，因此保持前者3 組值不變，根據(jù)乳清粉、酵母粉、碳酸鈣添加量3個(gè)因素回歸方程系數(shù)的比例關(guān)系，設(shè)定步長進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表4。試驗(yàn)組4對應(yīng)的乳酸菌細(xì)胞密度最大，為1.38×1011CFU/g，因此將試驗(yàn)組4選作后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Steepest ascent experimental design and results

2.1.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

表5 培養(yǎng)基優(yōu)化中心組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 Central composite design with experimental and predicted results of L. bulgaricus counts for optimization of medium components

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以試驗(yàn)組4為中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表5。以乳清粉（A）、酵母粉（B）、碳酸鈣（C）添加量為自變量，以細(xì)胞密度（Y）為因變量對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式方程為：Y = 11.24+ 0.13A+0.15B+0.087C-0.33A2-0.16B2-0.16C2-0.070AB+0.018AC-0.012BC。對模型進(jìn)行方差分析（表6）可知，模型具有極顯著性（P＜0.001），判定系數(shù)R2= 0.967 2，即該模型可以解釋96.72%乳酸菌細(xì)胞密度的變化，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明該模型方程對數(shù)據(jù)擬合情況較好。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)（表7）可知，3 個(gè)主效應(yīng)因素均為顯著影響因素（P＜0.05）。

表6 保加利亞乳桿菌細(xì)胞密度二次多項(xiàng)模型方差分析Table 6 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model for L. bulgaricus counts

表7 保加利亞乳桿菌細(xì)胞密度模型方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 7 Regression coefficients and their significance for L. bulgaricus counts

響應(yīng)曲面和等高線圖見圖2～4，由圖2可知，乳清粉和碳酸鈣的交互作用對細(xì)胞密度的影響不顯著，當(dāng)乳清粉添加量小于95 g/L時(shí)，乳酸菌細(xì)胞密度隨著其添加量的增加呈快速上升的趨勢；當(dāng)大于95 g/L時(shí)，細(xì)胞密度反而呈下降趨勢。碳酸鈣的變化對細(xì)胞密度的影響比乳清粉小，當(dāng)碳酸鈣添加量小于7.9 g/L時(shí)，隨著碳酸鈣添加量的增加，細(xì)胞密度略有增加，而當(dāng)碳酸鈣添加量大于7.9 g/L時(shí)，細(xì)胞密度隨其添加量的增加而減少，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中添加適量碳酸鈣可以起到增加液芯微囊的機(jī)械強(qiáng)度、緩沖環(huán)境pH值的作用，為酸奶發(fā)酵乳酸菌提供良好的生長環(huán)境，但過量時(shí)反而不利于乳酸菌細(xì)胞的生長[17-19]。圖3與圖4變化趨勢相同，酵母粉和乳清粉、碳酸鈣添加量的交互作用對細(xì)胞密度的影響均顯著，當(dāng)酵母粉添加量小于7.2 g/L時(shí)，隨著酵母粉添加量的增加，細(xì)胞密度呈增加趨勢且增幅較大，而當(dāng)酵母粉添加量大于7.2 g/L時(shí)，變化趨于平緩。

圖2 乳清粉和碳酸鈣添加量及其交互作用對保加利亞乳桿菌細(xì)胞密度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the interactive effect of whey power and CaCO3concentration on L. bulgaricus counts

圖3 乳清粉和酵母粉添加量及其交互作用對保加利亞乳桿菌細(xì)胞密度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the interactive effect of whey power and yeast powder concentration on L. bulgaricus counts

圖4 酵母粉和碳酸鈣添加量及其交互作用對保加利亞乳桿菌細(xì)胞密度影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effect of yeast powder and CaCO3concentration on L. bulgaricus counts

將乳清粉、酵母粉、碳酸鈣的添加量取值范圍分別設(shè)定在90～110、6～8、6.7～8.7 g/L，并將細(xì)胞密度設(shè)定為目標(biāo)最大值，根據(jù)軟件給出的10 組最優(yōu)組合（表8），從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選取第4組的組合，即培養(yǎng)基配方為：乳清粉97.15 g/L、大豆蛋白粉10 g/L、酵母粉7.55 g/L、碳酸鈣8.03 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、硫酸錳0.02 g/L。

表8 培養(yǎng)基優(yōu)化的10 組最優(yōu)組合Table 8 Optimal medium formulations

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

表9是利用中心組合試驗(yàn)對溫度和初始pH值進(jìn)行優(yōu)化的設(shè)計(jì)方案及結(jié)果。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到乳酸菌細(xì)胞密度預(yù)測值（Y）對自變量培養(yǎng)溫度（A）和初始pH值（B）的多元回歸方程為Y = 10.98-0.20A-0.01B-0.35 A2-0.46B2+0.035AB。

表9 培養(yǎng)條件的中心組合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 9 Central composite design with experimental and predicted results of L. bulgaricus counts for optimization of culture conditions

對該模型方程進(jìn)行方差分析（表10），結(jié)果表明該模型極顯著（P＜0.01），R2= 0.993 7，表明該模型能解釋99.37%細(xì)胞密度的變化，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明細(xì)胞密度的實(shí)測值和預(yù)測值之間擬合度較好，因此該方程作為酸奶發(fā)酵乳酸菌的細(xì)胞密度模型是合適的。

表10 細(xì)胞密度二次多項(xiàng)模型方差分析Table 10 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model for L. bulgaricus counts

表11 細(xì)胞密度模型方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 11 Regression coefficients and their significance for L. bulgaricus counts

由方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知（表11），初始pH值對細(xì)胞密度影響不顯著，而溫度對其影響顯著。由響應(yīng)曲面及等高線（圖5）可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度在40～42 ℃時(shí)，細(xì)胞密度隨著培養(yǎng)溫度的升高而增加，當(dāng)溫度大于42 ℃時(shí)細(xì)胞密度出現(xiàn)負(fù)增長；從等高線圖可以看出，培養(yǎng)溫度和初始pH值的交互作用不顯著。

圖5 培養(yǎng)溫度和初始pH值及其交互作用影響保加利亞乳桿菌細(xì)胞密度的響應(yīng)曲面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the interactive effect of culture temperature and pH on L. bulgaricus counts

將培養(yǎng)溫度和初始pH值分別設(shè)定在40～44 ℃和6.6～7.2，用乳酸菌細(xì)胞密度作為靶向最大值，通過實(shí)驗(yàn)軟件進(jìn)行優(yōu)化處理，得到的10 組最優(yōu)組合培養(yǎng)條件見表12，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，微囊化保加利亞乳桿菌最優(yōu)的培養(yǎng)條件選擇第6組，即培養(yǎng)溫度為41.7 ℃，初始pH值為6.9。

表12 培養(yǎng)條件的10 組最優(yōu)組合Table 12 Optimal combinations of culture conditions

2.3 微囊化酸奶發(fā)酵乳酸菌高密度培養(yǎng)

用優(yōu)化的培養(yǎng)基在41.7 ℃、初始pH 6.9條件下對游離乳酸菌和微囊化乳酸菌分別進(jìn)行連續(xù)5 批增殖培養(yǎng)，結(jié)果見圖6。微囊內(nèi)乳酸菌細(xì)胞密度在第1批和第2批的增殖培養(yǎng)過程中極顯著增加（P＜0.01），第3批發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到3.18×1011CFU/g，之后液芯微囊內(nèi)細(xì)胞密度變化不顯著（P＞0.05），而游離條件下乳酸菌細(xì)胞密度在所有培養(yǎng)批次中變化均不顯著（P＞0.05）。

圖6 微囊化酸奶發(fā)酵乳酸菌連續(xù)培養(yǎng)過程中囊內(nèi)細(xì)胞密度的變化Fig.6 Change in L. bulgaricus counts in liquid-core capsules during continuous culture

2.4 高密度培養(yǎng)后微囊內(nèi)外菌體掃描電鏡

圖7 液芯微囊內(nèi)（A）和外（B）菌體掃描電鏡圖（×1 000）Fig.7 SEM images (× 1 000) of high-density cultured cells inside (A) and outside (B) liquid-core microcapsules

由圖7可知，囊內(nèi)保加利亞乳桿菌菌體粗壯，形態(tài)良好，菌體分布均勻，密度較高，而囊外表面菌體密度較少，說明液芯微包囊可以對菌體起到較好的保護(hù)作用。

3 結(jié) 論

隨著商品發(fā)酵劑應(yīng)用的迅速增加，發(fā)酵劑的經(jīng)濟(jì)性成為一個(gè)重要研究指標(biāo)，為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，在實(shí)踐中需要針對每個(gè)特定過程建立相應(yīng)的高效發(fā)酵模式。因此，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)和工藝在工業(yè)化實(shí)踐中就顯得日趨重要。高密度培養(yǎng)技術(shù)不僅是生產(chǎn)高質(zhì)量濃縮型菌體和代謝產(chǎn)物的重要環(huán)節(jié)，也是能否以低成本實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵性因素[20-21]。

微生物培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件在HCDC培養(yǎng)過程中占有極其重要的地位。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化了用于微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方：以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加乳清粉97.15 g/L、大豆蛋白粉10.00 g/L、酵母粉7.55 g/L、碳酸鈣8.03 g/L、硫酸鎂0.30 g/L、硫酸錳0.02 g/L。高密度培養(yǎng)微囊化保加利亞乳桿菌的最優(yōu)條件為：培養(yǎng)溫度41.7 ℃、初始pH 6.9。此時(shí)保加利亞乳桿菌FMG-4細(xì)胞菌密度可達(dá)到3.18×1011CFU/g。

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Optimization of High Cell Density Culture Conditions for Microencapsulated Lactobacillus bulgaricus by Response Surface Methodology

YAN Ying-juan1,2, LU Jian1,3, ZHOU Jian-zhong4, LI Wei2, DONG Ming-sheng2,*
(1. Department of Biology, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. Nanjing Weigang Dairy Co. Ltd., Nanjing 211100, China; 4. Institute Agro-product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

In this study, the medium composition and culture conditions for microencapsulated Lactobacillus bulgaricus FMG-4 were optimized using response surface methodology. The results showed that the optimal medium for high cell density culture of microencapsulated Lactobacillus bulgaricus FMG-4 was an MRS medium supplemented with 97.15 g/L whey powder, 10.00 g/L soy protein powder, 7.55 g/L yeast powder, 8.03 g/L calcium carbonate, 0.30 g/L magnesium sulfate and 0.02 g/L manganese sulfate. The optimal culture conditions were 41.7 ℃ and an initial pH of 6.9. Under the optimized culture conditions, the density of L. bulgaricus FMG-4 reached 3.18×1011CFU/g.

liquid core microcapsule; response surface methodology; Lactobacillus bulgaricus; high cell density culture

TS201.3

A

1002-6630（2014）17-0153-07

10.7506/spkx1002-6630-201417030

2014-01-08

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD18B01-4）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100903）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（KYZ201419）；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2012GB23600639）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

閆穎娟（1985—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：sxxzyyj@163.com

*通信作者：董明盛（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn