響應(yīng)面法優(yōu)化小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵工藝

李 悅，薛橋麗，李世俊，王 晶，胡永金,*

響應(yīng)面法優(yōu)化小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵工藝

李 悅1，薛橋麗2，李世俊1，王 晶3，胡永金1,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，云南 昆明 650201；3.玉溪沃森生物技術(shù)有限公司，云南 玉溪 653100）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，利用Minitab軟件，對(duì)纖維素酶高產(chǎn)菌小刺青霉（Penicillium spinulosum）16-7進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化。通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出影響產(chǎn)酶的3 個(gè)主要因素，即稻草-麩皮（碳源）添加量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。在此基礎(chǔ)上通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明：當(dāng)?shù)静?麩皮添加量為3.45 g/100 mL、培養(yǎng)溫度為27.11 ℃和培養(yǎng)時(shí)間為146.27 h時(shí)，酶活力最高，此條件下濾紙酶酶活力預(yù)測(cè)值為132.53 U/mL。經(jīng)過(guò)修正，選擇稻草-麩皮添加量3.45 g/100 mL、培養(yǎng)溫度27 ℃、培養(yǎng)時(shí)間146 h，此條件下測(cè)得羧甲基纖維素酶酶活力為387.58 U/mL、濾紙酶酶活力為128.86 U/mL，濾紙酶酶活力比優(yōu)化前提高49.07%。

纖維素酶；發(fā)酵；Plackett-Bumann設(shè)計(jì)；響應(yīng)面分析；小刺青霉

纖維素是地球上分布最廣泛、含量最豐富的可再生資源，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球每年通過(guò)光合作用產(chǎn)生的植物生物量高達(dá)1.14×1012t[1-2]，其中大部分尚未被利用或未被合理利用，目前全世界被開發(fā)利用的農(nóng)林纖維副產(chǎn)物不足2%，我國(guó)約有50%以上的農(nóng)林廢棄物在田間地頭被白白燒掉。這不僅浪費(fèi)了寶貴的自然資源，而且全世界每年因農(nóng)林廢棄物焚燒造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元[3-5]。

因此，合理開發(fā)和利用這一豐厚的天然資源——纖維素，是世界各國(guó)當(dāng)前研究開發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域[6-8]。如用纖維素酶將纖維素降解為可利用的糖液，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酒精、菌體蛋白、氣體燃料（如氫氣）等物質(zhì)，對(duì)解決當(dāng)今世界所面臨的糧食短缺、能源危機(jī)和環(huán)境污染問(wèn)題具有深遠(yuǎn)的意義[9-10]。目前用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種大多都是絲狀真菌，主要為木霉屬、曲霉屬和青霉屬等菌株[11]。

纖維素酶是微生物分解利用纖維素時(shí)自身合成的一種胞外酶，酶產(chǎn)量的高低直接影響纖維素利用率。在發(fā)酵過(guò)程中，纖維素酶的活力大小主要與菌種纖維素酶基因的表達(dá)有關(guān)，但是同一菌株，通過(guò)一定的外部條件優(yōu)化，可以提高其產(chǎn)酶活力，發(fā)酵的工藝條件對(duì)產(chǎn)酶的影響也十分重要，以本實(shí)驗(yàn)室篩選保存的小刺青霉（Penicillium spinulosum）16-7為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)，擬篩選出對(duì)纖維素酶發(fā)酵最重要的影響因素，結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化纖維素酶液態(tài)發(fā)酵工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

小刺青霉（Penicillium spinulosum）16-7，云南省大圍山原始森林土壤中篩選，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 試劑

羧甲基纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na）（化學(xué)純）、3,5-二硝基水楊酸（化學(xué)純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）天津市永大化學(xué)試劑有限公司；定量濾紙（中速） 杭州富陽(yáng)特種紙業(yè)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[11]：CMC-Na 1.5 g/100 mL、NH4NO30.1 g/100 mL、酵母膏0.1 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL、KH2PO40.1 g/100 mL，pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[11]：1.5 g/100 mL不同碳源、NH4NO30.4 g/100 mL、酵母膏0.4 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.02 g/100 mL、KH2PO40.4 g/100 mL，pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HX121-0054立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SHA-BA恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；7200型可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；DT5-2型低速臺(tái)式離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

1.3 稻草、麩皮預(yù)處理

將100 g稻草、麩皮分別置于500 mL的3 g/100 mL氫氧化鈉溶液中混勻，0.15 MPa（126～128 ℃）保溫5 min，放氣[12]后備用。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 液體種子培養(yǎng)

將小刺青霉16-7制成孢子懸液（107～108個(gè)細(xì)胞/mL），按10%的接種量接入到裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶?jī)?nèi)，置于恒溫?fù)u床中28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每組做3 個(gè)平行樣。

1.5 分析方法[13-15]

1.5.1 粗酶液的制備

將發(fā)酵液在5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液作為粗酶液。

1.5.2 羧甲基纖維素酶活力（CMCase activity，CMCA）測(cè)定

分別向4 支試管（1 支空白管，3 支樣品管）加入1 g/100 mL CMC-Na溶液（用pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制）2.00 mL，然后加入一定稀釋比例的酶液0.50 mL （空白管不加），混勻。將4 支試管置于50 ℃水浴中反應(yīng)30 min，迅速向各管加入DNS試劑3.0 mL，再于空白管中加入稀釋好的酶液0.5 mL。將4 支管同時(shí)放入沸水浴中，加熱10 min取出。冷卻至室溫，定容至15 mL搖勻，以空白管（對(duì)照液）調(diào)零，測(cè)OD540nm值。酶活力單位采用國(guó)際定義方法：以1 mL酶液在1 min內(nèi)分解底物生成1 μg葡萄糖的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（1 U/mL）。

1.5.3 濾紙酶活力（filter paper activity，F(xiàn)PA）的測(cè)定

分別向4 支試管（1 支空白管，3 支樣品管），加入50 mg濾紙和pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1.5 mL，然后加入一定稀釋比例的酶液0.50 mL（空白管不加），使管內(nèi)溶液浸沒濾紙，蓋塞。將4 支試管同時(shí)置于50 ℃水浴中反應(yīng)60 min后，立即向各管加入DNS試劑3.0 mL。再于空白管中加入稀釋好的酶液0.50 mL。后續(xù)操作同1.5.2節(jié)。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 單因素試驗(yàn)

分別選取碳源、氮源、起始pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、表面活性劑添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。

碳源：首先分別以3 g/100 mL稻草、玉米秸稈、濾紙、葡萄糖、CMC-Na為不同的碳源，然后在確定稻草為最佳碳源基礎(chǔ)上添加不同質(zhì)量比例的麩皮，確定二者的添加比例以提高碳源利用率；氮源：以0.6 g/100 mL蛋白胨、酵母膏、NH4NO3、NaNO3、(NH4)2SO4及NH4Cl作為不同的氮源，確定最佳氮源后考察不同添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響；培養(yǎng)基起始pH值：分別設(shè)培養(yǎng)基起始pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5；裝液量：分別盛裝25、50、75、100、125、150 mL液體培養(yǎng)基到250 mL的三角瓶中；搖床轉(zhuǎn)速：分別設(shè)置為100、125、150、175、200、250 r/min；接種量：向產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別加入1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的種子培養(yǎng)液；培養(yǎng)溫度：在26、28、30、32、34 ℃條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)時(shí)間：分別培養(yǎng)3、4、5、6、7、8、9 d；表面活性劑的添加量：向培養(yǎng)基中分別添加0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/100 mL的吐溫-80。

1.6.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

Plackett-Burman設(shè)計(jì)是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它基于非完全平衡塊原理，可以用最少試驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng)，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素[16-17]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以FPA作為響應(yīng)值，對(duì)影響產(chǎn)酶的碳源、氮源、菌種接種量、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、吐溫-80添加量、初始培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間9 個(gè)影響因素進(jìn)行篩選，篩選出3 個(gè)主效應(yīng)因子，每個(gè)因素選兩個(gè)水平，另設(shè)3 個(gè)虛擬列，以考察實(shí)驗(yàn)誤差，共20 組試驗(yàn)。

1.6.3 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)可以達(dá)到快速進(jìn)入最優(yōu)點(diǎn)附近區(qū)域的目的[18]。系統(tǒng)最優(yōu)條件的初步估計(jì)常常遠(yuǎn)離實(shí)際的最優(yōu)點(diǎn)，要先采用最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程[19-21]。以Plackett-Burman試驗(yàn)的零水平作為最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)點(diǎn)，根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)獲得的3 個(gè)主效應(yīng)因素的比例關(guān)系設(shè)定步長(zhǎng)和上升路徑進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.6.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken法，依據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素與水平，對(duì)纖維素酶發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，包括12 個(gè)析因試驗(yàn)和5 個(gè)中心試驗(yàn)，共17 組試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖1 不同碳源對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.1 Effect of carbon sources on cellulase production

由圖1可知，小刺青霉16-7在以稻草為碳源時(shí)酶活力最高（CMCA為244.67 U/mL、FPA為69.55 U/mL），秸稈次之。說(shuō)明該菌對(duì)稻草這類天然纖維素的分解利用能力較強(qiáng)，其中葡萄糖幾乎是所有真菌都喜歡利用的良好碳源，所以酶活力也較高，但產(chǎn)酶能力仍低于天然纖維素，這和很多研究報(bào)道的葡萄糖是真菌纖維素酶合成的阻遏物的觀點(diǎn)一致。結(jié)果說(shuō)明，該菌在不同種類的碳源培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶能力有很大差別。

圖2 稻草與麩皮質(zhì)量比對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.2 Effect of rice straw-to-wheat bran ratio on cellulase production

由圖2可知，隨著稻草與麩皮比例的不斷變化，酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)静菖c麩皮比為7∶3時(shí)，酶活力達(dá)到峰值，CMCA為269.83 U/mL，F(xiàn)PA為74.15 U/mL。分析原因可能是麥麩為產(chǎn)酶提供少量的淀粉、粗蛋白、微量元素等營(yíng)養(yǎng)因子，從而提高菌株的產(chǎn)酶能力；同時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)的初始糖質(zhì)量濃度可加速誘導(dǎo)菌株產(chǎn)酶，且在一定范圍內(nèi)，誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)量是呈正比關(guān)系，但如果糖質(zhì)量濃度過(guò)高則會(huì)降低酶產(chǎn)量。由此可見，培養(yǎng)基中添加適當(dāng)比例的麩皮時(shí)，對(duì)于誘導(dǎo)纖維素酶的形成是有幫助的。但是，隨著麩皮的添加比例不斷增大，會(huì)對(duì)纖維素酶的形成產(chǎn)生抑制作用，另外過(guò)多的麩皮可能會(huì)造成培養(yǎng)基的蓬松度降低，通氣性減弱，從而影響纖維素酶的形成。

圖3 稻草-麩皮添加量對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.3 Effect of carbon source concentration on cellulase production

由圖3可知，隨著稻草-麩皮添加量的不斷增大，酶活力呈現(xiàn)先急劇增大，到峰值后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)静?麩皮添加量為3 g/100 mL時(shí)，CMCA和FPA達(dá)到峰值，CMCA為281.77 U/mL，F(xiàn)PA為77.09 U/mL?？赡苁且?yàn)檫m量的稻草-麩皮添加量作為一種誘導(dǎo)劑在表達(dá)體系中起作用，過(guò)低的糖濃度誘導(dǎo)作用小，延緩產(chǎn)酶期，且菌絲體生長(zhǎng)緩慢，而過(guò)高的糖質(zhì)量濃度則會(huì)對(duì)纖維素酶的形成產(chǎn)生抑制作用。初步確定稻草-麩皮的添加量為3 g/100 mL。

2.1.2 氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖4 不同氮源對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources on cellulase production

由圖4可知，不同氮源對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)酶影響的差異較大，其中蛋白胨和酵母膏對(duì)產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，其次為(NH4)2SO4、NH4Cl。結(jié)果表明，氮源對(duì)酶活力的影響因素依次為：有機(jī)氮＞銨鹽＞硝酸鹽，采用蛋白胨作為氮源時(shí)效果最好，CMCA為258.59 U/mL，F(xiàn)PA為69.28 U/mL。

圖5 蛋白胨添加量對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.5 Effect of peptone concentration on cellulase production

由圖5可知，隨著蛋白胨添加量的不斷增大，酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.8 g/100 mL時(shí)，CMCA和FPA達(dá)到峰值，CMCA為282.32 U/mL，F(xiàn)PA為74.29 U/mL。初步確定蛋白胨的添加量為0.8 g/100 mL。

2.1.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.6 Effect of rotation speed on cellulase production

由圖6可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，酶活力均達(dá)到峰值，CMCA為275.41 U/mL，F(xiàn)PA為72.48 U/mL。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速?gòu)?00 r/min增至150 r/min時(shí)，小刺青霉16-7纖維素酶酶活力呈增大趨勢(shì)；但當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)150 r/min后，產(chǎn)酶水平有所下降，選擇使用150 r/min的轉(zhuǎn)速比較適合。

搖床轉(zhuǎn)速主要影響發(fā)酵液的溶解氧濃度，目的菌是好氧菌，在生長(zhǎng)和產(chǎn)酶過(guò)程中要消耗大量的氧，所以在產(chǎn)酶過(guò)程中應(yīng)不斷振蕩來(lái)增加發(fā)酵液的溶氧濃度，另外適度振蕩還可以增加菌絲與發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸，使菌種能夠獲得充足的營(yíng)養(yǎng)。由以上結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)速太低可能導(dǎo)致培養(yǎng)基中溶氧不足，影響菌體生長(zhǎng)；太高可能由于機(jī)械剪切力過(guò)大，造成菌絲斷裂，進(jìn)而影響產(chǎn)酶。

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.7 Effect of culture time on cellulase production

由圖7可知，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶有較大的影響。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為3～6 d時(shí)，酶活力呈現(xiàn)急劇增大的趨勢(shì)；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為7 d時(shí)，酶活力達(dá)到頂峰，CMCA為270.68 U/mL，F(xiàn)PA為71.23 U/mL；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)7 d時(shí)，酶活力呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。

酶的產(chǎn)生需要一個(gè)過(guò)程，目的菌16-7培養(yǎng)前期處于遲緩期，菌絲體緩慢生長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境逐步適應(yīng)，培養(yǎng)一段時(shí)間之后，菌絲體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌絲體生長(zhǎng)旺盛，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，是菌株產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的主要階段，產(chǎn)酶量逐步達(dá)到最高，這時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間是7 d左右，即目的菌產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)時(shí)期。發(fā)酵后期，隨著培養(yǎng)基內(nèi)可供菌株利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少，以及代謝產(chǎn)物的積累，菌體步入衰亡期，細(xì)胞相繼衰老、死亡，生長(zhǎng)繁殖等代謝活動(dòng)減弱。通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中菌株生長(zhǎng)狀況的觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲體的形態(tài)變化與其產(chǎn)酶變化是一致的。

2.1.5 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖8可知，培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶活力具有較大影響。在28 ℃條件下，CMC酶活力和濾紙酶活力均達(dá)到最大值，CMCA為270.48 U/mL，F(xiàn)PA為70.92 U/mL。當(dāng)溫度超過(guò)28 ℃，酶活力下降明顯。初步確定目的菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)溫度為28 ℃。

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.8 Effect of culture temperature on cellulase production

在較低溫度26 ℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)緩慢，傳代時(shí)間延長(zhǎng)，酶活力高峰期出現(xiàn)較晚。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，菌絲體旺盛生長(zhǎng)，產(chǎn)酶高峰期提前，酶分泌增多，酶活力增大。但若溫度持續(xù)升高，可能造成了菌株過(guò)早老化，酶分泌量減少，酶活力逐漸降低。使得參與生化反應(yīng)的酶系統(tǒng)遭到破壞，直接導(dǎo)致微生物細(xì)胞因無(wú)法繁殖而死亡。

2.1.6 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖9 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.9 Effect of initial pH on cellulase production

由圖9可知，培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶有較明顯的影響，當(dāng)初始pH值在3.0～5.5時(shí)，隨著pH值升高，纖維素酶活性出現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)初始pH值為5.5時(shí)，酶活力最高，CMCA為286.54 U/mL，F(xiàn)PA為75.41 U/mL；當(dāng)初始pH值大于5.5后，酶活力逐步下降。初步確定目的菌產(chǎn)纖維素酶初始pH值為5.5。這與大多數(shù)真菌適宜在中性偏酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)相符。

2.1.7 接種量對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖10 接種量對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.10 Effect of inoculum size on cellulase production

由圖10可知，接種量對(duì)產(chǎn)酶效果影響較為明顯，接種量為1%～4%時(shí)，酶活力較小；當(dāng)?shù)?%時(shí)，產(chǎn)酶水平達(dá)到峰值，CMCA為294.35 U/mL，F(xiàn)PA為77.46 U/mL；超過(guò)5%以后，產(chǎn)酶水平有所下降，而在6%～8%，產(chǎn)酶較為穩(wěn)定；當(dāng)接種量大于8%，酶活力迅速下降。

接種量過(guò)小時(shí)，營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，菌絲體劇烈生長(zhǎng)，產(chǎn)酶滯后，產(chǎn)酶活力不高，延長(zhǎng)生長(zhǎng)周期；接種量過(guò)大時(shí)，第一，影響產(chǎn)酶培養(yǎng)基的透氣性，從而使得酶活力降低；第二，發(fā)酵前期菌株生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)基溫度升高，抑制產(chǎn)酶能力；其三，菌株生長(zhǎng)過(guò)密，發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)供給不足，競(jìng)爭(zhēng)增強(qiáng)，抑制菌株生長(zhǎng)。

2.1.8 裝液量對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖11 裝液量對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig. 11 Effect of liquid medium volume in 250-mL flasks on cellulase production

由圖11可知，250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)基能獲得較佳的產(chǎn)酶效果，CMCA為289.56 U/mL，F(xiàn)PA為76.20 U/mL。裝的過(guò)多和過(guò)少都不利于產(chǎn)酶，裝液量過(guò)少，可能會(huì)引起搖瓶中的液體培養(yǎng)基晃動(dòng)厲害，破壞了菌體與纖維素的黏附狀態(tài)，且機(jī)械剪切力過(guò)大，造成菌絲斷裂，進(jìn)而影響產(chǎn)酶，但隨著裝液量超過(guò)100 mL，產(chǎn)酶水平也逐漸下降，這可能是由于供氧不足且在液體攪動(dòng)過(guò)程中菌體不能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，不利于目的菌的生長(zhǎng)。

2.1.9 吐溫-80添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

圖12 吐溫-80添加量對(duì)小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.12 Effect of Tween-80 addition on cellulase production

由圖12可知，吐溫-80對(duì)產(chǎn)酶能力的影響較小。添加表面活性劑吐溫-80能在一定程度上提高纖維素酶活力，添加量為0.6 mL/100 mL時(shí)酶活力達(dá)到峰值，CMCA為281.45 U/mL，F(xiàn)PA為74.07 U/mL。CMCA是未添加時(shí)的1.21 倍，濾紙酶酶活力是未添加時(shí)的1.23倍，再增加用量酶活力開始下降，這可能是因?yàn)楸砻婊钚詣┘尤脒^(guò)多可能會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而使酶活力降低。同樣，添加量過(guò)低則起不到作用，添加量為0.2 mL/100 mL時(shí)的酶活力與未添加時(shí)相差不大。因此，添加表面活性劑控制在合適范圍內(nèi)，將有利于提高產(chǎn)酶能力。針對(duì)小刺青霉株16-7，本實(shí)驗(yàn)采用0.6 mL/100 mL的吐溫-80添加量較為合適。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman experimental design and results

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical analysis of the Plaekett-Burman experimental results

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1所示，統(tǒng)計(jì)分析見表2，滿足“Prob＞F”小于0.05的3 個(gè)因素（碳源、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間）是顯著的，可考慮作為主要因素進(jìn)一步做響應(yīng)面試驗(yàn)。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小，正效應(yīng)因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)因素均取較低值，即選擇蛋白胨添加量1.2 g/100 mL、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、pH 5.5、裝液量100 mL/250 mL、接種量7.5%、吐溫-80添加量為0.6 mL/100 mL。方差分析見表3，主效應(yīng)“Prob＞F”等于0.012，說(shuō)明模型與試驗(yàn)值擬合良好。

表3 Plackett- Burman試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of the Plaekett-Burman experimental results

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)獲得的3 個(gè)主效因素的比例關(guān)系設(shè)定步長(zhǎng)和上升路徑，其中培養(yǎng)溫度有顯著正效應(yīng)，應(yīng)增加；稻草-麩皮添加量和培養(yǎng)時(shí)間有顯著負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減小。進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。最優(yōu)條件出現(xiàn)在試驗(yàn)2，因此以該處理?xiàng)l件為中心點(diǎn)進(jìn)行下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The response values of steepest ascent path

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.1 模型的建立

以FPA為響應(yīng)值，根據(jù)表4的結(jié)果擬定試驗(yàn)因素水平與結(jié)果見表5，用Design Expert軟件進(jìn)行多元回歸分析。經(jīng)回歸擬合后，試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響可以用以下回歸方程表示：Y=132.25-2.03A+1.44B+1.99C+ 0.75AB-2.20AC+1.13BC-10.48A2-6.64B2-12.38C2。

表5 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Box-Benhnken Experimental design and results

表6 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析Table 6 ANOVA for the response surface quadratic model

由表6可知，所選模型的不同處理間差異極顯著（P＜0.000 1），說(shuō)明用回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其應(yīng)變量與全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，即該試驗(yàn)方法可靠。失擬項(xiàng)P=0.143 8＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)的誤差等偶然因素不會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)顯著影響，該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，試驗(yàn)誤差小。

該方程的決定系數(shù)R2=98.85%，說(shuō)明模型可以解釋98.85%的試驗(yàn)所得的產(chǎn)酶變化，表示方程擬合度良好。變異系數(shù)表示試驗(yàn)的精確度，變異系數(shù)值越低則試驗(yàn)的可靠性越高，本試驗(yàn)變異系數(shù)=1.35%，僅有1.35%的響應(yīng)值變異不能用該模型解釋，說(shuō)明試驗(yàn)操作可信。

2.4.2 響應(yīng)面圖和等高線圖分析

模型的三維響應(yīng)面圖和等高線圖能比較直觀地解釋各變量和變量之間對(duì)響應(yīng)值的影響。根據(jù)上述回歸方程繪制出響應(yīng)面圖和等高圖，見圖13～15。利用該圖可以將其3 個(gè)變量中的1 個(gè)變量固定在中心值水平，而對(duì)另外2 個(gè)變量交互影響FPA的效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。

圖13 碳源添加量和培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素酶產(chǎn)量影響的響應(yīng)等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.13 Response surface and contour plots for the effects of carbon source concentration and culture temperature on cellulase production

由圖13可知，在培養(yǎng)時(shí)間保持固定的情況下，稻草-麩皮添加量（A）和培養(yǎng)溫度（B）對(duì)FPA的影響。等高圖近圓形，且等高線較疏，表明此兩因素的交互作用不顯著。響應(yīng)面立體分析圖開口向下，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值以后，隨著各因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。當(dāng)?shù)静?麩皮添加量在3.25～3.75 g/100 mL、培養(yǎng)溫度在26.5～27.5 ℃時(shí)，可得到FPA的最大值。

圖14 碳源添加量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)纖維素酶產(chǎn)量影響的響應(yīng)等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.14 Response surface and contour plots for the effects of carbon source concentration and culture time on cellulase production

由圖14可知，在培養(yǎng)溫度保持固定的情況下，稻草-麩皮添加量（A）和培養(yǎng)時(shí)間（C）對(duì)FPA的影響。等高圖呈橢圓形，且等高線較密，可以直觀地看出兩因素的交互作用顯著，同樣從方差分析可知稻草-麩皮添加量（A）和培養(yǎng)溫度（B）交互作用顯著（P=0.028 1）。處于同一曲線上的FPA是一樣的。在橢圓區(qū)域的中心FPA最大，由中心向邊緣FPA逐漸降低。響應(yīng)面立體分析圖開口向下，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值以后，隨著各因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。當(dāng)?shù)静?麩皮添加量在3.25～3.75 g/100 mL、培養(yǎng)時(shí)間在132～156 h時(shí)，可得到FPA的最大值。

由圖15可知，在稻草-麩皮添加量保持固定的情況下，培養(yǎng)溫度（B）和培養(yǎng)時(shí)間（C）對(duì)FPA的影響。等高圖呈橢圓圓形，且等高線較密，但方差分析中兩因素的P=0.201 9，可以得出此培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的存在一定交互作用。處于同一曲線上的FPA是一樣的。在橢圓區(qū)域的中心FPA最大，由中心向邊緣FPA逐漸降低。響應(yīng)面立體分析圖開口向下，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值以后，隨著各因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。當(dāng)培養(yǎng)溫度在26.5～27.5 ℃、培養(yǎng)時(shí)間在132～156 h時(shí)，可得到FPA的最大值。

圖15 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)纖維素酶產(chǎn)量影響的響應(yīng)等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.15 Response surface and contour plots for the effects of culture time and temperature on cellulase production

對(duì)模型方程進(jìn)行典型性分析，結(jié)果表明該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，最大值就是穩(wěn)定點(diǎn)。此回歸模型得出Box-Behnken試驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果為稻草-麩皮添加量3.45 g/100 mL、培養(yǎng)溫度27.11 ℃、培養(yǎng)時(shí)間146.27 h，此條件下FPA為132.53 U/mL。

經(jīng)過(guò)修正，選擇稻草-麩皮添加量3.45 g/100 mL、培養(yǎng)溫度27 ℃、培養(yǎng)時(shí)間146 h，進(jìn)行3 批次發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，獲得平均FPA為128.86 U/mL ，比優(yōu)化前平均FPA（86.44 U/mL）提高49.07%。結(jié)果與模型預(yù)測(cè)基本一致，說(shuō)明模型能夠比較真實(shí)地反映各顯著因素對(duì)纖維素酶產(chǎn)量的影響，表明所得模型對(duì)實(shí)驗(yàn)具有指導(dǎo)意義。

3 結(jié) 論

單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)有效地找出影響纖維素酶產(chǎn)量主要因素，最陡爬坡試驗(yàn)?zāi)艹浞纸咏畲箜憫?yīng)面區(qū)域，再利用Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化。得到的發(fā)酵最優(yōu)條件為：稻草-麩皮添加量3.45 g/100 mL、培養(yǎng)溫度27.00 ℃、培養(yǎng)時(shí)間146.00 h、蛋白胨添加量1.2 g/100 mL、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、pH 5.5、裝液量100 mL/250 mL、接種量7.5%、吐溫-80添加量為0.6 mL/100 mL。此條件下測(cè)得羧甲基纖維素酶酶活力為387.58 U/mL、濾紙酶酶活力為128.86 U/mL，濾紙酶酶活力比優(yōu)化前提高49.07%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳洪章, 李佐虎. 纖維素原料微生物與生物量全利用[J]. 化工科技市場(chǎng), 2001(5): 17-20.

[2] 鄧天福, 杜開書, 李廣領(lǐng). 纖維素酶及其在釀造業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)釀造, 2011 , 30(12): 17-19.

[3] SHULER M L. Utilization and recycle of agriculture wastes and residues[M]. Boca Raton, Florida: CRC Press Inc., 1980.

[4] 薛橋麗, 王煒, 胡永金, 等. 堆肥中高溫纖維素酶菌株的篩選及其酶性質(zhì)研究[J]. 中國(guó)釀造, 2012, 31(1): 30-33.

[5] 武林芝. 纖維素酶以及應(yīng)用行業(yè)的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(26): 10570-10574.

[6] 宋穎琦, 劉睿倩, 楊謙, 等. 纖維素降解菌的篩選及其降解特性的研究[J]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 34(2): 197-200.

[7] 武香玉, 徐海燕, 辛國(guó)芹, 等. 纖維素酶及其研究進(jìn)展[J]. 飼料博覽, 2013(10): 27-29.

[8] 胡格華, 蘇香萍, 潘虹, 等. 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件的研究[J]. 三峽大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2013, 35(4): 100-102.

[9] LUTZEN N W, NIELSEN M H, OXENBOELL K M, et a1. Cellulase and their applications in the conversion of lignocellu-loses to fermentable sugars[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society, 1983, 300: 283-291.

[10] 傅力, 涂正東, 葉凱. 里氏木霉高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育及產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2009, 25(3): 10-13.

[11] PERSON I, TJERNELD F, HAHN-HǎGERDAL B. Fungal cellulolytic enzyme production: a review[J]. Process Biochemistry, 1991, 26: 65-74.

[12] 葉生梅, 許盼吉, 汪江林. 稻草秸稈的預(yù)處理及發(fā)酵乙醇的試驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2008, 35(3): 16-20.

[13] 劉海波, 王義強(qiáng), 陳介南. 一株高產(chǎn)纖維素酶菌的篩選與鑒定[J]. 生物學(xué)雜志, 2008, 25(3): 16-20.

[14] 張瑞萍. 纖維素酶的濾紙酶活和CMC酶活的測(cè)定[J]. 印染助劑, 2002, 19(5): 51-53．

[15] MANDELS M, ANEREOTTI R E. Enzymatic hydrolysis of waste cellulose[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1976, 6: 17-21.

[16] ZHOU Jiangya, YU Xiaojuan, DING Cong, et a1. Optimization of phenol degradation by Candida tropicalis Z-04 using Plackett-Burman design and response surface methodology[J]. Journal of Environmental Sciences, 2011, 23(1): 22-30.

[17] 潘春梅, 王輝, 任敏. 響應(yīng)面法優(yōu)化L-谷氨酰胺發(fā)酵培養(yǎng)基的研究[J].生物技術(shù)通訊, 2013, 19(4): 528-531.

[18] CHEN Xiaochun, BAI Jianxin, CAO Jiaming, et a1. Medium optimization for the production of cyclicadenosine 3,5-monophosphate by Mierobacterium sp. No.205 using response surface methodology[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(2): 919-924.

[19] RATNAM B V V, RAO M D. Optimization of fermentation condtions for the production of ethanol from sago starch using response surface methodology[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2003, 19: 523-526.

[20] BAS D, BOYAEL I H. Modeling and optimization I: usability of response surface methodology[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 78: 836-845.

[21] FUNG W Y, WOO Y P, LIONG M T. Optimization of growth of Lactobacillus acidophilus FTCC 09291 and evaluation of growth characteristics in soy whey medium: a response surface methodology approach[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008. 56: 7910-7918.

Optimization of Cellulase Production by Penicillium spinulosum 16-7 in Liquid-State Fermentation by Response Surface Methodology

LI Yue1, XUE Qiao-li2, LI Shi-jun1, WANG Jing3, HU Yong-jin1,*
(1. College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Library of Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 3. Walvax Biotechnology Co. Ltd., Yuxi 653100, China)

This paper reports the optimization of the fermentation conditions for cellulase production by Penicillium spinulosum 16-7 by Plackett-Burman design and response surface methodology using the statistical software Minitab. By using Plackett-Burman design, carbon source (a combination of rice straw and wheat bran at a mass ratio of 7:3) concentration, culture temperature and time were identified as main factors that influence cellulase production. The selected variables were further investigated by steepest ascent analysis and optimized by response surface analysis. The highest cellulase activity was obtained after culture at 27.11 ℃ for 146.27 h at a carbon source concentration of 3.45 g/100 mL, leading to a predicted filter paper activity of 132.53 U/mL. Under the modified fermentation conditions of 3.45 g/100 mL carbon source concentration, 27 ℃ and 146 h, carboxymethyl cellulase activity was 387.58 U/mL and the filter paper activity was 128.86 U/mL, 49.07% higher than that obtained before optimization.

cellulase enzyme; fermentation; Plackett-Bumann design; response surface analysis; Penicillium spinulosum

Q93.33

A

1002-6630（2014）17-0137-09

10.7506/spkx1002-6630-201417028

2014-04-16

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（30960308）；云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2008ZC057M）

李悅（1988—），女，碩士，主要從事食品質(zhì)量及安全性研究。E-mail：xixiliyue@tom.com

*通信作者：胡永金（1972—），男，教授，博士，主要從事功能性食品與生物技術(shù)研究。E-mail：huyjin@126.com