石榴皮多酚分離純化及對(duì)脂肪酸合成酶抑制作用的研究

蒲 博，李 兵，楊舒慧，唐鵬程，焦士蓉,*

石榴皮多酚分離純化及對(duì)脂肪酸合成酶抑制作用的研究

蒲 博1，李 兵1，楊舒慧2，唐鵬程1，焦士蓉1,*

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.云南金雨莊生物科技有限責(zé)任公司，云南 昆明 650000）

以總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)、吸附率、解吸率為指標(biāo)，進(jìn)行石榴皮總多酚的分離純化研究，并通過反相高效液相色譜（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法測(cè)定石榴皮多酚中的鞣花酸、安石榴苷、綠原酸、槲皮素和表兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。同時(shí)研究石榴皮多酚純化物對(duì)脂肪酸合成酶的抑制作用。結(jié)果表明：石榴皮多酚純化的最佳條件為采用D101大孔樹脂，石榴皮溶液進(jìn)柱質(zhì)量濃度為10 mg/mL，流速為2 BV/h，清洗用水5 BV，乙醇洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)為70%，用量為5.5 BV；純化后石榴皮多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.64%，較純化前多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)49.31%有明顯提高；純化后石榴皮多酚中安石榴苷、鞣花酸、綠原酸、槲皮素和表兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為46.91%、9.44%、0.53%、0.75%、0.32%。石榴皮多酚提取物對(duì)脂肪酸合成酶的半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）為0.72 mg/mL，說明石榴皮多酚對(duì)脂肪酸合成酶具有較好的抑制作用。

石榴皮多酚；脂肪酸合成酶；純化；抑制

石榴皮（pomegranate peel）是石榴干燥后的果皮，性酸、味澀，具有止血、澀腸、殺蟲的效用，是臨床常用中藥[1-4]。經(jīng)反相高效液相色譜（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分析，石榴皮中含安石榴苷、鞣花酸等多酚類物質(zhì)，且含量較高[5-8]。研究表明安石榴苷和鞣花酸具有抑制癌細(xì)胞增殖、抗突變和抗氧化作用[9-14]。大孔吸附樹脂具有吸附容量大、吸附速度快、選擇性好、再生簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化[15-20]。目前，普遍認(rèn)為脂肪酸合成酶在能量代謝中發(fā)揮著重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）可能是治療肥胖和癌癥的雙重靶點(diǎn)[21]。雖然有研究發(fā)現(xiàn)部分減肥、抗菌藥也具有較強(qiáng)的FAS抑制活性，但都具有不穩(wěn)定、毒性高等缺點(diǎn)[22]，作為藥物廣泛應(yīng)用還具有一定的局限性，因此開發(fā)高效、低毒、性能更穩(wěn)定的FAS抑制劑成為當(dāng)前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[23]。

本實(shí)驗(yàn)比較了不同樹脂以及不同方式對(duì)石榴皮多酚的分離純化效果，并研究了純化物對(duì)FAS的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴皮 成都中藥飲品有限公司；FAS 本實(shí)驗(yàn)室提取。

鞣花酸、槲皮素、綠原酸、表兒茶素、安石榴苷美國Sigma公司；D101型大孔樹脂、DI40型大孔樹脂成都科龍?jiān)噭S；AB-8型大孔樹脂、D160型大孔樹脂、HPD722型大孔樹脂 河北滄州寶恩化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Heto Lyolab 3000凍干機(jī) 上海匯分電子科技有限公司；LC20高效液相色譜系統(tǒng)（配有SPDM20A二極管陣列檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱和SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 石榴皮粗提物的制備

以水為提取溶劑，料液比為1∶30（m/V），提取溫度為75 ℃，提取時(shí)間為140 s，對(duì)石榴皮多酚進(jìn)行提取，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥得石榴皮粗提取物。

1.3.2 大孔樹脂的預(yù)處理

將大孔樹脂（D101、DI40、AB-8、D160、HPD722）用無水乙醇浸泡24 h，將樹脂溶脹后上柱沖洗，先用無水乙醇沖洗至流出液加適量水至無白色混濁，再用蒸餾水洗至無醇味。接著酸堿處理樹脂，先后以體積分?jǐn)?shù)均為5%的鹽酸和氫氧化鈉對(duì)其處理，采用5 BV/h的流速。等待3 h后以相同流速用蒸餾水洗至中性，蒸餾水浸泡后以作備用。

1.3.3 大孔樹脂比較與選擇

稱取各樹脂2 g，將其分別加入裝有50 mL質(zhì)量濃度為9 mg/mL的石榴皮初提取物凍干粉的三角瓶中，于25 ℃恒溫振蕩器上，以115 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩20 h，讓樹脂飽和吸附。然后測(cè)定上清液中多酚的質(zhì)量濃度（ρe），接著濾去三角瓶中溶液，蒸餾水洗滌2 次，然后加入無水乙醇相同條件處理3 h，測(cè)其解吸液中多酚的質(zhì)量濃度（ρd）。分別按如下公式計(jì)算吸附率、吸附量、解吸率。

式中：ρ0為石榴皮提取物中多酚的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρe為清液中多酚的質(zhì)量濃度／（mg/mL）；ρd為解吸液中多酚的質(zhì)量濃度／（mg/mL）；V0為石榴皮提取物溶液體積/mL；m為樹脂質(zhì)量/g。

1.3.4 大孔樹脂對(duì)石榴皮多酚的靜態(tài)吸附與解吸

方法與1.3.3節(jié)相同。

1.3.5 大孔樹脂對(duì)石榴皮多酚的動(dòng)態(tài)吸附與解吸

1.3.5.1 大孔樹脂對(duì)石榴皮多酚的動(dòng)態(tài)吸附性能

稱取樹脂2 g，采取濕法上柱，用質(zhì)量濃度為10 mg/mL的石榴皮提取物溶液以2 BV/h的流速過柱。每半柱體積取流出液進(jìn)行吸光度檢測(cè)，測(cè)其多酚質(zhì)量濃度，繪制大孔樹脂對(duì)石榴皮多酚質(zhì)量濃度的吸附曲線圖。

1.3.5.2 樹脂清洗用水量的確定

用水洗脫樹脂中的多糖，對(duì)水洗脫劑每一柱用水測(cè)量一次多酚丟失率和多糖反應(yīng)情況，以此來確定清洗水的用量。

多糖反應(yīng)：檢驗(yàn)方法為α-萘酚濃硫酸法，將待測(cè)水溶液取量1 mL，加入5%的萘酚數(shù)滴，振蕩搖勻后，向里面再加入5～6 滴濃硫酸，使其分為兩層，再隔2～3 min后兩層液體的液面有紫紅色的環(huán)狀出現(xiàn)，這就說明其中有多糖，由此就可已確定出洗脫劑用量的合適度。

1.3.5.3 乙醇洗脫劑用量

以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇對(duì)吸附的樹脂進(jìn)行解吸，每隔半個(gè)柱體積收集一管解吸溶液，測(cè)其多酚質(zhì)量濃度。然后以乙醇用量為橫坐標(biāo)，以解吸液中的多酚質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制解吸曲線圖，以確定乙醇最佳洗脫量。

1.3.6 石榴皮多酚質(zhì)量濃度的測(cè)定

多酚質(zhì)量濃度采用福林-酚比色法測(cè)定[24]。在283 nm波長處測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，石榴皮多酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=102.4x-3.606（R2=0.999 8），式中：x為石榴皮多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為吸光度。

1.3.7 色譜條件

采用反相高效液相色譜法，石榴皮多酚中綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用色譜柱Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm），其流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸（17∶83，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長310 nm，柱溫為30 ℃。安石榴苷測(cè)定采用色譜柱為Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-2%冰醋酸（7∶93，V/V）；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長為232 nm；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量均為20 μL。

1.3.8 脂肪酸合成酶活性的測(cè)定[25]

于含有1 mmol/L EDTA、pH值為7、濃度為0.1 mmol/L的磷酸鉀緩沖液中進(jìn)行，底物濃度為乙酰CoA 6 μmol/L，丙二酰CoA 12 μmol/L，NADPH 37.5 μmol/L，體積為2 mL，1 cm光徑于37 ℃水浴恒溫4～5 min，加入50 μL稀釋后的高速離心上清液?jiǎn)?dòng)酶反應(yīng)，于340 nm波長處連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度變化。

動(dòng)物FAS的活性單位（U）規(guī)定為每分鐘氧化14 nmol NADPH的酶量，因此，每毫升高速離心上清液酶活力（E）用下式計(jì)算。

式中：V為測(cè)酶活體積數(shù)0.002 L；C為稀釋倍數(shù)；106為mmol轉(zhuǎn)換nmol系數(shù)；ΔA340nm為340 nm波長處的吸光度變化值；ε為NADPH氧化為NADP時(shí)在340 nm波長處的毫摩爾消光系數(shù)，此處為6.022 L/mmol。

1.3.9 石榴皮多酚對(duì)脂肪酸合成酶的抑制作用

取本實(shí)驗(yàn)室純化的石榴皮提取物，配制成質(zhì)量濃度為900 mg/L的溶液，分別吸取20、40、60、80、100、120、140 μL，然后再分別加蒸餾水130、110、90、70、50、30、10 μL，配制成150 μL溶液，再加入到反應(yīng)體系中，測(cè)定酶活性大小，分析石榴皮提取物在不同質(zhì)量濃度下對(duì)酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂比較與選擇結(jié)果

由于各樹脂之間存在孔徑、極性等種別差異，所以吸附與解吸的效果不一樣，由表1可知，D101樹脂的吸附率最大，可以到達(dá)73.13%，而它的解吸率為81.33%，僅次于HPD722型樹脂。與其他各型樹脂相比它還有最大的靜態(tài)吸附量，其靜態(tài)吸附量為81.14 mg/g，因此選用D101樹脂。

表1 各大孔樹脂對(duì)石榴皮多酚的靜態(tài)飽和吸附與解吸參數(shù)Table 1 Parameters of adsorption and desorption for various types of resin

2.2 大孔樹脂對(duì)石榴皮多酚的靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

2.2.1 石榴皮多酚質(zhì)量濃度選擇

圖1 石榴皮多酚質(zhì)量濃度選擇Fig.1 Screening of optimal sample concentration

由圖1可知，隨石榴皮多酚濃度不斷地加大，樹脂的吸附率有下降的趨勢(shì)，前面幾個(gè)濃度吸附率差異不大，從第4個(gè)后的每一個(gè)點(diǎn)都有較大差異，鑒于節(jié)約用時(shí)的考慮，這里選擇10 mg/mL的質(zhì)量濃度為上柱質(zhì)量濃度，該質(zhì)量濃度條件下的吸附率為71.06%。

2.2.2 乙醇洗脫劑體積分?jǐn)?shù)選擇

圖2 乙醇洗脫劑體積分?jǐn)?shù)選擇Fig.2 Screening of optimal eluent concentration

由圖2可知，乙醇洗脫劑體積分?jǐn)?shù)變化對(duì)D101樹脂吸附石榴皮多酚的影響較大，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)加大，解吸率也有上升的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%以后，解吸率趨于平穩(wěn)，因此從經(jīng)濟(jì)的角度考慮選擇體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇比較適宜。

2.3 大孔樹脂對(duì)石榴皮多酚的動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 大孔樹脂對(duì)石榴皮多酚動(dòng)態(tài)吸附性能

圖3 大孔樹脂對(duì)石榴皮多酚的動(dòng)態(tài)吸附Fig.3 Dynamic adsorption of polyphenols on macroporous resin D101

由圖3可知，隨進(jìn)柱量的增大，流出液的多酚質(zhì)量濃度也在增大，這表明進(jìn)柱量越大，樹脂的吸附效果越差，這是由于樹脂的吸附接近平衡的緣故。在此條件下，進(jìn)柱量大于4 BV時(shí)，流出液中多酚質(zhì)量濃度停止增大，這證明樹脂的吸附已經(jīng)達(dá)到平衡。

2.3.2 樹脂清洗用水量選擇

石榴皮提取物中有一定的多糖存在，可以采取大孔樹脂對(duì)它和石榴皮多酚的吸附差異來將兩者分開，將石榴皮提取物溶液按一定的條件進(jìn)柱后，等樹脂充分吸附，用水清洗樹脂，將多余的多糖除去，多糖反應(yīng)與多酚丟失率見表2。

表2 多糖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)Table 2 Effect of water washing of the loaded column on polyphenol loss and polysaccharide removal

由表2可知，當(dāng)洗脫水用量大于5 BV時(shí)，多糖呈陰性反應(yīng)，這表明除去了大量的雜質(zhì)，但隨洗脫水量的加大，其中多酚的丟失率也不斷在增大，所以綜合考慮，最終決定選擇用5 BV的清洗用水量。

2.3.3 乙醇洗脫劑用量確定

圖4 乙醇洗脫劑用量的選擇Fig.4 Screening of optimal eluent amount

由圖4可知，當(dāng)乙醇洗脫劑的用量為5.5 BV時(shí)，石榴皮多酚的解吸程度基本達(dá)到極限，此時(shí)乙醇解吸液中多酚質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，大部分的多酚已經(jīng)在洗脫劑用量為5 BV時(shí)解脫下來，考慮到效率和經(jīng)濟(jì)的因素，這里選擇乙醇洗脫劑用量為5.5 BV。

2.4 石榴皮多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

2.4.1 粗提物多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

將石榴皮多酚粗提取物配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，空白管為蒸餾水，在283 nm波長處測(cè)定其吸光度，代入回歸方程，計(jì)算得到粗提物中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為為49.31%。

2.4.2 純化物中多酚含量的測(cè)定

取經(jīng)過D101型大孔樹脂純化處理后的石榴皮多酚凍干粉溶解稀釋，將其配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，空白管為蒸餾水，將其在283 nm波長處測(cè)定吸光度，帶入多酚回歸方程，計(jì)算其結(jié)果。經(jīng)測(cè)定，大孔樹脂純化后的石榴皮多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)（71.64±0.56）%（n=5，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差=0.78%），較以前未純化時(shí)49.31%的石榴皮多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了22.33%，這說明此方法有一定的純化效果，可以用于石榴皮多酚的純化分離。

2.5 RP-HPLC法對(duì)石榴皮多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

表3 未純化與純化后石榴皮提取物中不同多酚物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Polyphenol composition of crude and purified extract from pomegranate peel

由表3可知，純化后不同多酚物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較未純化前均有所提高。

2.6 石榴皮多酚對(duì)脂肪酸合成酶的抑制作用

圖5 不同石榴皮多酚質(zhì)量濃度條件下FAS的活性Fig.5 Fatty acid synthase inhibitory activity of pomegranate peel polyphenols at different concentrations

由圖5可知，純化的石榴皮多酚提取物對(duì)酶活性的抑制率隨石榴皮多酚質(zhì)量濃度增加而增大，其半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）為0.72 mg/mL。

3 結(jié) 論

3.1 通過對(duì)D101、DI40、AB-8、D160、HPD722這5 種樹脂的研究，得出了它們吸附性能的差異。在5 種樹脂中，D101樹脂有較強(qiáng)的吸附解吸效果，所以這里用D101樹脂來分離純化石榴皮多酚比較有效。

3.2 實(shí)驗(yàn)通過大孔樹脂的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)吸附與解吸研究，得到了石榴皮多酚純化的最佳條件：采用D101大孔樹脂，速率為2 BV/h，進(jìn)柱質(zhì)量濃度為10 mg/mL，清洗用水量為5 BV，乙醇洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為70%，使用量為5.5 BV。

3.3 對(duì)石榴皮提取物純化品中多酚物質(zhì)進(jìn)行了RP-HPLC法測(cè)量，測(cè)得不同多酚物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：鞣花酸9.44%、綠原酸0.53%、槲皮素0.75%、表兒茶素0.32%、安石榴苷46.91%；石榴皮提取液凍干粉中不同多酚物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為鞣花酸6.23%、槲皮素0.61%、綠原酸0.41%、表兒茶素0.30%、安石榴苷28.73%。表明石榴皮多酚物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未純化前有所提高。

3.4 石榴皮提取物對(duì)FAS酶活有抑制作用，隨其質(zhì)量濃度的增加，抑制效果越明顯，其EC50為0.72 mg/mL。

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Purification of Polyphenols from Pomegranate Peel and Their Inhibitory Effect on Fatty Acid Synthase

PU Bo1, LI Bing1, YANG Shu-hui2, TANG Peng-cheng1, JIAO Shi-rong1,*
(1. School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Yunnan Golden Rain’s Biotechnology Limited Liability Company, Kunming 650000, China)

The purification of polyphenols from the crude aqueous extract of pomegranate peel by macroporous adsorption resin was investigated by evaluating total polyphenol content, adsorption rate and desorption rate as functions of the adsorption and desorption conditions. Meanwhile, the contents of punicalagin, ellagic acid, chlorogenic acid, quercetin and epicatechin were determined by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). In addition, the inhibitory effect of purified polyphenols on fatty acid synthase was explored. The results showed that D101 macroporous resin was the suitable resin for the purification of polyphenols and the purification process involved the following steps: adjustment of the sample concentration to 10 mg/mL, sample loading at a flow rate of 2 BV/h, column washing with 5 BV of distilled water, and elution with 5.5 BV of 70% ethanol. The purified product contained 71.64%, significantly higher than that (49.31%) reported for the crude extract. The contents of punicalagin, ellagic acid, chlorogenic acid, quercetin and epicatechin in the purified polyphenols were 46.91%, 9.44%, 0.53%, 0.75% and 0.32%, respectively. Moreover, the polyphenols from pomegranate peel had a potent inhibitory effect on fatty acid synthase with an EC50(concentration for 50% of maximal effect) of 0.72 mg/mL.

pomegranate peel polyphenols; fatty acid synthase; purification; inhibition

Q949.761

A

1002-6630（2014）17-0099-05

10.7506/spkx1002-6630-201417020

2013-10-10

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目（12205543）；四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（09ZA158）；西華大學(xué)人才引進(jìn)基金項(xiàng)目（R0820501）

蒲博（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：375243027@qq.com

*通信作者：焦士蓉（1968—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：jsrong2004@163.com