李樹錦,高美須,崔承弼,劉超超,牟 慧,趙 鑫,王志東
輻照對有機(jī)弱酸類防腐劑抑菌性的影響
李樹錦1,2,高美須2,*,崔承弼1,*,劉超超2,牟 慧2,趙 鑫2,王志東2
(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)
為研究輻照對有機(jī)弱酸類防腐劑抑菌性的影響,實(shí)驗(yàn)以革蘭氏陰性(G-)菌腸炎沙門氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌和革蘭氏陽性(G+)菌單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸膜明串珠菌為目標(biāo)菌株,采用酶標(biāo)比濁法測定山梨酸鉀、雙乙酸鈉、丙酸鈉、丙酸鈣和脫氫醋酸鈉在固態(tài)粉末和溶液狀態(tài)下,經(jīng)0、5、10、15 kGy的60Co γ射線輻照后抑菌性的變化,同時(shí)確立酶標(biāo)比濁法的檢測波長和防腐劑質(zhì)量濃度。結(jié)果表明:5 kGy以下的低劑量輻照對防腐劑的抑菌性基本不產(chǎn)生影響,10~15 kGy輻照對防腐劑的抑菌性產(chǎn)生影響,能使多數(shù)防腐劑的抑菌性增加,且輻照劑量越高影響越大;輻照對防腐劑溶液抑菌性的影響比固態(tài)防腐劑粉末大;G+菌對輻照防腐劑抑菌性的變化比G-菌更敏感。
輻照;防腐劑;抑菌性影響;酶標(biāo)比濁法
防腐劑是能抑制微生物活動,防止食品腐敗變質(zhì)的一類食品添加劑[1]。實(shí)踐證明,防腐劑是目前食品加工中最常用的防止食品腐敗變質(zhì)的手段之一。但是防腐劑攝入過多會對人體健康產(chǎn)生危害,超劑量的攝入一些化學(xué)防腐劑會引起食物中毒甚至癌癥。目前,我國超劑量使用或應(yīng)用不合格的防腐劑不是個(gè)例,不僅降低了食品的食用安全性也給食品加工的信譽(yù)帶來了不良影響。因此,降低防腐劑的使用量是目前食品加工中亟待解決的問題?,F(xiàn)階段,食品的防腐保鮮手段多樣,且往往是幾種手段的綜合作用。因此,除了考慮各種手段的單一效應(yīng)外,還要考慮它們之間的相互影響效應(yīng)。輻照作為一種有效的冷殺菌技術(shù),以其能耗低、無毒物殘留、無污染、滅菌徹底、不破壞營養(yǎng)成分等獨(dú)特優(yōu)勢成為食品加工技術(shù)的主要領(lǐng)域之一[2]。食品輻照技術(shù)也常用于對加入防腐劑后的食品進(jìn)行殺菌處理,比如近年來因其麻辣有滋、皮韌肉香而深受消費(fèi)者歡迎的泡椒鳳爪就綜合利用了輻照和防腐劑的處理來延長其貨架期。有研究表明,輻照會造成一些分子的結(jié)構(gòu)和功能的變化[3-7]。楊桂霞等[8]研究發(fā)現(xiàn)對大分子質(zhì)量的海藻酸鈉進(jìn)行60Co γ輻照時(shí),隨著劑量的增加,海藻酸鈉的分子質(zhì)量減小,并產(chǎn)生少量新組分;Ant?nio等[9]發(fā)現(xiàn)輻照可以使麥芽凝集素的構(gòu)象產(chǎn)生變化,形成不容性非晶聚集物,降低其致敏活性。然而,雖然實(shí)際生產(chǎn)加工中經(jīng)常綜合利用輻照和防腐劑的方法對食品進(jìn)行防腐,但目前為止輻照對防腐劑的影響還未有見過報(bào)道。
山梨酸鉀、雙乙酸鈉、丙酸鈉、丙酸鈣、脫氫醋酸鈉均屬于有機(jī)弱酸類防腐劑,這些防腐劑安全性較高,是食品加工中 最為普遍利用的防腐劑類型。本實(shí)驗(yàn)就輻照對這幾種防腐劑抑菌性的影響進(jìn)行了研究,以期為合理有效的利用這兩種防腐方式,為獲得長貨架期的安全食品提供技術(shù)支持。
1.1 材料
1.1.1 防腐劑、菌種與培養(yǎng)基
山梨酸鉀、丙酸鈣、雙乙酸鈉 上海源葉生物科技有限公司;丙酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;脫氫醋酸鈉 美國Sigma公司。
腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、福氏志賀氏菌、腸膜明串珠菌 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。
營養(yǎng)肉湯、MRS肉湯、腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司。
1.1.2 儀器與設(shè)備
LX-C不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;BSD-100振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;I-mark酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 菌懸液的制備
挑取斜面菌種至含有20 mL相應(yīng)無菌液態(tài)培養(yǎng)基的錐形瓶中,在適宜溫度下培養(yǎng)22~24 h后,用無菌液態(tài)培養(yǎng)基稀釋至105CFU/mL備用。
1.2.2 酶標(biāo)比濁法實(shí)驗(yàn)條件的篩選[10-11]
1.2.2.1 檢測波長的篩選
分別精確稱取0.8 g的山梨酸鉀、雙乙酸鈉、丙酸鈉和丙酸鈣以及0.16 g的脫氫醋酸鈉,溶于50 mL蒸餾水中得到16 mg/mL 和3.2 mg/mL 的溶液,再稀釋至適宜的質(zhì)量濃度。以蒸餾水做參比,用紫外-可見分光光度計(jì)在190~900 nm波長范圍內(nèi)分別對其進(jìn)行掃描。
1.2.2.2 防腐劑質(zhì)量濃度的篩選
分別配制32 mg/mL 的山梨酸鉀、雙乙酸鈉、丙酸鈉和丙酸鈣溶液和6.4 mg/mL 的脫氫醋酸鈉溶液。將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1~2 孔加入100 μL所配防腐劑溶液,并加入100 μL 2 倍濃度的無菌營養(yǎng)肉湯(相應(yīng)的無菌液態(tài)培養(yǎng)基)混勻,第3~12孔分別加入100 μL 1 倍濃度的無菌營養(yǎng)肉湯。分別從1~2 孔中吸取100 μL到3~4 孔混勻,再從3~4孔吸取100 μL到5~6 孔……最后11~12 孔中吸取100 μL棄去。接著將各孔加入100 μL培養(yǎng)24 h的菌懸液(以100 μL無菌營養(yǎng)肉湯+100 μL培養(yǎng)24 h的菌懸液做為空白對照)?;靹蚝罅⒓粗糜诿笜?biāo)儀中測其OD630nm值。
1.2.3 防腐劑的輻照
分別將配制好的32 mg/mL的山梨酸鉀、雙乙酸鈉、丙酸鈉和丙酸鈣溶液以及6.4 mg/mL的脫氫醋酸鈉溶液,及其固態(tài)粉末在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所輻照中心(60Co源)進(jìn)行輻照,設(shè)置輻照劑量為0、5、10、15 kGy,用重鉻酸鉀(銀)劑量計(jì)進(jìn)行劑量追蹤,測得的實(shí)際吸收劑量分別為0、4.2、10.2、13.8 kGy,方便起見在實(shí)驗(yàn)中仍然用輻照劑量進(jìn)行描述。
1.2.4 輻照對防腐劑抑菌性的影響
將輻照后的固態(tài)以及高質(zhì)量濃度的液態(tài)防腐劑用相應(yīng)的液態(tài)培養(yǎng)基配成所需質(zhì)量濃度。吸取100 μL到細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中,再將備用菌懸液吸取100 μL到孔中混勻(每個(gè)樣做3 個(gè)平行)。立即用酶標(biāo)儀測其光密度值,然后在所需培養(yǎng)溫度下振蕩培養(yǎng)24 h后再次用酶標(biāo)儀測其光密度值。以兩次光密度值的差值來表示每個(gè)孔中菌含量的變化。
1.3 數(shù)據(jù)分析
利用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2.1 酶標(biāo)比濁法實(shí)驗(yàn)條件的確定
2.1.1 檢測波長的確定
為了避開實(shí)驗(yàn)中防腐劑本身對菌液光密度值的影響,對防腐劑溶液進(jìn)行了190~900 nm波長掃描以避開防腐劑的最大吸收波峰,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,防腐劑的吸收峰波長處于190~332 nm
圖1 不同防腐劑的全波段吸收曲線Fig.1 Absorption spectra of different preservatives within the whole wavelength band
之間,616 nm后趨于零。對于菌懸液,理論上測其光密度值時(shí)波長并沒有嚴(yán)格限制。故為了避免防腐劑的干擾選擇630 nm作為檢測波長。
2.1.2 防腐劑質(zhì)量濃度的選擇
表1 防腐劑在不同質(zhì)量濃度下大腸桿菌懸液的OD630 nm值Table 1 OD630 nm values of E. coli suspension with preservatives at various concentrations
表2 防腐劑腐劑在不同質(zhì)量濃度下金黃色葡萄球菌懸液的OD630 nm值Table 2 OD630 nmvalues of S. aureus suspension with preservatives at various concentrations
表1、2為不同質(zhì)量濃度的防腐劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌懸液OD630nm值的影響。此外,還測定了不同防腐劑質(zhì)量濃度下沙門氏菌、李斯特菌、志賀氏菌、明串珠菌、枯草芽孢桿菌懸液的OD630nm值(未列出)。山梨酸鉀和雙乙酸鈉的質(zhì)量濃度即使為8 mg/mL,對各個(gè)菌懸液OD630nm值的影響與空白對照相比差異也不顯著;丙酸鈉在4 mg/mL及其以下的質(zhì)量濃度對各個(gè)菌懸液OD630nm值的影響與空白對照相比差異不顯著;丙酸鈣在2 mg/mL及其以下質(zhì)量濃度對各個(gè)菌懸液OD630nm值的影響與空白對照相比差異不顯著;脫氫醋酸鈉在0.4 mg/mL及其以下質(zhì)量濃度對各個(gè)菌懸液OD630nm值的影響與空白對照相比差異不顯著。結(jié)合實(shí)際食品加工中幾種防腐劑的用量標(biāo)準(zhǔn)[12],以及翁佩芳[10]、楊曉韜[13]等的研究結(jié)果,并綜合幾次預(yù)實(shí)驗(yàn)所出的結(jié)果,選擇丙酸鈣2 mg/mL、丙酸鈉4 mg/mL、山梨酸鉀2 mg/mL、雙乙酸鈉1 mg/mL、脫氫醋酸鈉0.4 mg/mL分別作為輻照對防腐劑抑菌性的影響實(shí)驗(yàn)中防腐劑的質(zhì)量濃度。
2.2 輻照對防腐劑抑菌性的影響
本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)前后菌液中含菌量的變化來表示防腐劑抑菌性的大小,含菌量變化越大則防腐劑抑菌性越小。表3~7顯示了對各個(gè)防腐劑溶液及其固態(tài)粉末進(jìn)行不同劑量輻照后其抑菌性的變化。
表3 丙酸鈣輻照后的抑菌性Table 3 Antibacterial activity of calcium propionate after irradiation
由表3可知,丙酸鈣固態(tài)輻照時(shí),劑量在10 kGy以內(nèi)抑菌性沒有顯著變化,15 kGy時(shí)引起對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌的抑菌性顯著增強(qiáng);液態(tài)輻照,在劑量為5 kGy時(shí),對李斯特菌等幾個(gè)革蘭氏陽性(G+)菌的抑菌性顯著增強(qiáng)(明串珠菌除外),而革蘭氏陰性(G-)菌在10 kGy以內(nèi)抑菌性變化不顯著,15 kGy對沙門氏菌和志賀氏菌的抑制性增強(qiáng)。
表4 丙酸鈉輻照后的抑菌性Table 4 Antibacterial activity of sodium propionate after irradiation
由表4可知,除明串珠菌和枯草芽孢桿菌外,固態(tài)輻照時(shí),劑量在15 kGy以內(nèi)基本不引起丙酸鈉抑菌性變化;液態(tài)輻照時(shí),10 kGy可引起丙酸鈉對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、李斯特菌的抑菌性增強(qiáng),對其他菌種抑菌性無顯著性變化。
由表5可知,固態(tài)輻照,劑量在5 kGy時(shí),山梨酸鉀對志賀氏菌的抑菌性上升,而對明串珠菌抑菌性下降;15 kGy時(shí)對枯草芽孢桿菌的抑菌性下降,而對其他菌無變化。當(dāng)液態(tài)輻照劑量達(dá)到5 kGy時(shí)對志賀氏菌的抑菌性顯著上升,10 kGy 可使金黃色葡萄球菌和福氏志賀氏菌的抑菌性顯著上升,15 kGy引起大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑菌性的增強(qiáng),而對其他菌的抑菌性沒有顯著變化。
表5 山梨酸鉀輻照后的抑菌性Table 5 Antibacterial activity of potassium sorbate after irradiation
表6 雙乙酸鈉輻照后的抑菌性Table 6 Antibacterial activity of sodium diacetate after irradiation
由表6可知,固態(tài)輻照劑量為5 kGy時(shí),雙乙酸鈉對腸膜明串珠菌的抑菌性與對照組相比顯著下降;10 kGy時(shí),對志賀氏菌的抑菌性與對照組相比顯著增強(qiáng);15 kGy時(shí),對金黃色葡萄球菌的抑菌性與對照相比顯著下降,對其他菌種的抑制性無變化;液態(tài)輻照時(shí)除明串珠菌和大腸桿菌外,10 kGy以內(nèi)的劑量可引起雙乙酸鈉的抑菌性顯著上升。
表7 脫氫醋酸鈉輻照后的抑菌性Table 7 Antibacterial activity of sodium dehydroacetate after irradiation
由表7可知,固態(tài)輻照時(shí),除腸炎沙門氏菌外,10 kGy以內(nèi)的劑量可引起脫氫醋酸鈉的抑菌性與對照組相比顯著上升;液態(tài)輻照5 kGy時(shí)引起脫氫醋酸鈉對金黃色葡萄球菌的抑菌性與對照組相比顯著下降,而對李斯特菌的抑菌性上升,10 kGy以內(nèi)的輻照對其他細(xì)菌的抑制性無變化,15 kGy可引起對大多數(shù)細(xì)菌抑制性的變化。
由表3~7可知,當(dāng)輻照劑量為5 kGy時(shí),除了引起防腐劑對極個(gè)別的幾個(gè)細(xì)菌抑制性的變化外,其他基本不變;10 kGy時(shí),液態(tài)輻照可引起一些防腐劑部分抑菌性的變化,固態(tài)輻照的抑菌性變化 依然很??;相比之下,15 kGy的輻照可引起多數(shù)防腐劑抑菌性的變化。即低劑量輻照對防腐劑的抑菌性不產(chǎn)生影響,高劑量的輻照影響防腐劑的抑菌性,可使大部分防腐劑的抑菌性增強(qiáng),且劑量越高影響越大。另外,輻照可以使大部分防腐劑的抑菌性增強(qiáng)而只有少數(shù)抑菌性減弱。
3.1 G+和G-菌對防腐劑抑菌性變化的敏感性
實(shí)驗(yàn)選擇了多種不同種類的細(xì)菌來研究輻照對防腐劑抑菌性的影響,其中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、明串珠菌和李斯特菌為G+菌,而沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌為G-菌。從結(jié)果來看,輻照后,丙酸鈣、丙酸鈉、山梨酸鉀對G+菌的抑制性變化顯著,而雙乙酸鈉、脫氫醋酸鈉抑菌性的變化與G+菌或G-菌的關(guān)系不大。由此可見,G+菌對防腐劑抑菌性的變化較為敏感,而G-菌則不敏感。
這可能與食品防腐劑的抑菌機(jī)理有關(guān),本實(shí)驗(yàn)所用的防腐劑均為有機(jī)弱酸類防腐劑,這些弱酸在未解離時(shí)是親脂性的,可透過原生質(zhì)膜而進(jìn)入細(xì)胞,進(jìn)入細(xì)胞后在高pH值環(huán)境中分解成離子,對細(xì)胞中有代謝作用的酶、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)、遺傳物質(zhì)、營養(yǎng)吸收以及細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等亞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響和破壞而具有抑菌作用[1,14-15]。G+菌和G-菌的細(xì)胞壁有顯著的不同,造成這兩類細(xì)菌對抑菌劑的敏感性有很大差異,G+菌細(xì)胞壁只有肽聚糖層,防腐劑極易進(jìn)入這些細(xì)胞內(nèi)部,而G-菌細(xì)胞壁包括內(nèi)外壁,外層為脂多糖層,它在控制細(xì)胞對防腐劑或其他小分子物質(zhì)的親和性方面有很大作用,因而對防腐劑的適應(yīng)性較強(qiáng)[16-17]。因此,當(dāng)輻照使防腐劑的抑菌性產(chǎn)生變化時(shí),G+菌對這種變化也表現(xiàn)的較為敏感。
3.2 不同狀態(tài)下輻照對防腐劑抑菌性的影響
對表3~7進(jìn)行分析對比可知,液態(tài)輻照時(shí),輻照5~10 kGy的劑量后,山梨酸鉀、雙乙酸鈉、丙酸鈉和丙酸鈣對大部分細(xì)菌的抑制性增強(qiáng),脫氫醋酸鈉對金黃色葡萄球菌的抑制性下降,對李斯特菌的抑制性上升;15 kGy時(shí)可引起多數(shù)防腐劑抑菌性的變化。而固態(tài)輻照時(shí),輻照5~10 kGy的劑量后,脫氫醋酸鈉對部分細(xì)菌的抑菌性上升;15 kGy以內(nèi)山梨酸鉀、雙乙酸鈉、丙酸鈉和丙酸鈣只對個(gè)別菌的抑制性有變化,大部分無顯著變化??傮w來說,液態(tài)輻照更易引起防腐劑抑菌性的變化。
這可能與防腐劑接受輻照時(shí)的狀態(tài)有關(guān),γ輻照的基本原理是原子或分子獲得γ射線傳遞的能量后破壞分子的化學(xué)鍵,并使水分子電離形成短壽命自由基,從而破壞物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),也會使之與其他分子和離子相互作用,形成新的分子[2,18-19]。當(dāng)防腐劑在溶液狀態(tài)輻照時(shí),防腐劑分子處于舒展?fàn)顟B(tài)甚至是電離狀態(tài)更易遭到結(jié)構(gòu)的破壞,且易與輻照水分子分解產(chǎn)生的自由基產(chǎn)物相互作用產(chǎn)生間接影響,因而其功能和性質(zhì)更易產(chǎn)生變化。
3.3 輻照對防腐劑產(chǎn)生作用的部位
從前面的分析中可以看出,輻照后 丙酸鈉與丙酸鈣的抑菌穩(wěn)定性均較強(qiáng),雙乙酸鈉、山梨酸鉀的抑菌穩(wěn)定性稍微弱些,脫氫醋酸鈉的抑菌穩(wěn)定性最弱。這可能與其分子構(gòu)成有關(guān),丙酸鈉與丙酸鈣輻照后的抑菌性變化基本一致,而與其他的不一致,說明輻照起作用的部分不是金屬離子而是有機(jī)酸集團(tuán)。許多研究證明[20-22]含有雙鍵的多官能團(tuán)單體更易受輻射影響,本實(shí)驗(yàn)中丙酸是這幾種防腐劑的有機(jī)酸集團(tuán)中結(jié)構(gòu)最簡單的,且飽和度最大的,比較耐輻照,穩(wěn)定性較強(qiáng);而山梨酸和脫氫醋酸均含有碳碳雙鍵,對輻照較敏感,穩(wěn)定性較弱,可能有這方面的原因。
輻照可以影響防腐劑的抑菌性,低劑量的輻照對防腐劑抑菌性產(chǎn)生影響較小,中高劑量的輻照可使大部分防腐劑抑菌性增強(qiáng),且劑量越高對防腐劑抑菌性的影響越大;防腐劑在溶液狀態(tài)下輻照時(shí)其抑菌性的變化比在固態(tài)粉末狀態(tài)下輻照時(shí)更為明顯;G+菌對抑菌性的變化比G-菌更為敏感。
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LI Shu-jin1,2, GAO Mei-xu2,*, CUI Cheng-bi1,*, LIU Chao-chao2, MOU Hui2, ZHAO Xin2, WANG Zhi-dong2
(1. College of Agriculture, Yanbian University, Yanji 133002, China; 2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)
This study was intended to investigate the effect of60Co γ-ray irradiation on the antimicrobial activity of weak organic acid preservatives, potassium sorbate, sodium diacetate, sodium propionate, calcium propionate and sodium acetate dehydrogenation. Irradiation dosages were set as 0, 5, 10 and 15 kGy. The target strains were Gram-negative (G-) bacteria including Salmonella enteritidis, Shigella flexneri, Escherichia coli, and Gram-positive (G+) bacteria including Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Leuconostoc mesenteroides. Meanwhile, the detection wavelength and suitable preservative concentrations for microtiter plate assay were established. The results showed that low dose irradiation under 5 kGy had little effect on the antimicrobial activity of preservatives, but 10-15 kGy irradiation could increase the antimicrobial activity of most preservatives with a positive dose-effect relationship. Irradiation made the antimicrobial activity of preservatives more sensitive in solution than in the solid state. It was observed that the change in antimicrobial activity of preservatives to G+bacteria after irradiation was more sensitivity than to G-bacteria.
irradiation; preservatives; antimicrobial activity; microtiter plate assay
TQ047.6
A
1002-6630(2014)17-0058-05
10.7506/spkx1002-6630-201417012
2013-08-22
“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAA03B05)
李樹錦(1989—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail:lsj19870601@163.com
*通信作者:高美須(1965—),女,副研究員,本科,研究方向?yàn)槭称份椪蘸椭旅舻鞍?。E-mail:meixugao@263.net
崔承弼(1968—),男,教授,博士,研究方向?yàn)楣δ苄允称费芯颗c開發(fā)。E-mail:cuichengbi@ybu.edu.cn