丹參對(duì)奶牛脂肪變性肝細(xì)胞NF
---κB和CYP450表達(dá)的影響

■王安忠 路麗芹 李鵬飛 秦建華 馬玉忠

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001）

脂肪肝是奶牛的常見疾病，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降，并伴發(fā)多種疾病，給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。近年來，奶牛的脂肪肝發(fā)病率成逐年上升趨勢(shì)，越來越受到人們的重視。有關(guān)研究表明，脂肪肝的形成與細(xì)胞色素酶P450（CYP450）有關(guān)。CYP450主要位于肝臟內(nèi)，是肝臟微粒體氧化酶系的主要代謝酶，在肝臟的代謝中起著重要的作用。傳統(tǒng)中藥丹參能明顯抑制肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)CYP450合成，改善肝臟脂變程度[3]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)脂肪肝的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但不夠深入[4-5]。本試驗(yàn)在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)和研究的基礎(chǔ)上，采用膠原酶兩步灌流法分離培養(yǎng)奶牛肝細(xì)胞，用DL-乙硫氨酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型，用丹參處理脂肪變性的肝細(xì)胞，來探討核因子NF-κB和CYP450在奶牛脂肪肝形成中的作用，為臨床上奶牛脂肪肝的中藥防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑

DL-乙硫氨酸（Alfa Aesar），Williams E培養(yǎng)基和Hanks（Sigma），膠原酶Ⅰ（Invitrogen），F(xiàn)BS（杭州四季青公司），油紅O(上?；瘜W(xué)試劑公司)，ALT、AST、SOD、MDA、TG、牛TNF-α ELISA等試劑盒（中生北控公司）、CYP450抗體（ADL）、p-NF-κB p65抗體（Santa Cruz）、堿磷酶標(biāo)記IgG（北京中杉金橋公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 奶牛肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)

膠原酶兩步灌流法分離肝細(xì)胞。先用含0.5 mM EGTA的Hanks液漂洗肝臟5 min，再用150 U/ml膠原酶Ⅰ消化8 min，最后用Hanks液漂洗5 min后分離肝細(xì)胞。肝細(xì)胞懸浮于Williams E培養(yǎng)基（含0.1 μM地塞米松，1×ITS，10%FBS）中，37 ℃/5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 奶牛脂肪肝體外造模劑量的篩選

肝細(xì)胞接種于96孔板（104/孔），不同濃度的DL-乙硫氨酸處理24、48 h后，加入5 g/l MTT 20 μl，4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，加DMSO 150 μl，緩慢振蕩10 min，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，并計(jì)算細(xì)胞成活率。細(xì)胞成活率（%）=不同濃度模型組吸光度/正常組吸光度×100。

將肝細(xì)胞接種于12孔板培養(yǎng)24 h后，加入不用濃度的DL-乙硫氨酸，按照試劑盒的操作步驟檢測(cè)24、48 h后裂解液中TG含量。

制備細(xì)胞爬片，10%甲醛固定30 min，油紅染色30 min，60%異丙醇漂洗5～10 s，水洗15 s。蘇木精復(fù)染50 s，1%鹽酸酒精分化，水洗至細(xì)胞核變藍(lán)，甘油明膠封片，顯微鏡下觀察并照相。1.2.3 丹參處理脂肪變性肝細(xì)胞

用培養(yǎng)基將丹參提取物稀釋成濃度為0、1、5、20、100、500 μg/ml。造模成功后，按照此濃度依次加入各培養(yǎng)孔中，只加DL-乙硫氨酸不用丹參處理的孔為模型組，不作任何處理的孔設(shè)為空白對(duì)照組。收集上清液，測(cè)定ALT、AST、TNF-α含量；裂解細(xì)胞，檢測(cè)SOD、MDA、TG的含量或活性。

用細(xì)胞裂解液收集蛋白，按照考馬斯亮藍(lán)Bradford試劑盒的步驟測(cè)定蛋白濃度，10%SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶封閉，NF-κB或CYP450一抗孵育過夜，TBST洗膜3次，堿磷酶標(biāo)記二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，NBT/BCIP顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛肝細(xì)胞的形態(tài)變化

2.1.1 正常奶牛肝細(xì)胞的形態(tài)特征

所獲得的肝細(xì)胞生長(zhǎng)良好，成活率在90%左右。培養(yǎng)6 h后，肝細(xì)胞呈圓球狀，單個(gè)散在，隱約可見細(xì)胞核，大部分貼壁。24 h后，體積稍微增大，部分連接呈島嶼狀（見圖1）。

圖1 正常奶牛肝細(xì)胞形態(tài)

2.1.2 油紅染色后的肝細(xì)胞形態(tài)

對(duì)照組肝細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞漿內(nèi)有少量脂滴分散，脂滴較小。隨著DL-乙硫氨酸濃度的加大，肝細(xì)胞內(nèi)充滿大小不等的橘紅色脂滴。肝細(xì)胞邊緣模糊不清，脂滴連接成片充滿整個(gè)胞漿，甚至細(xì)胞膜破裂，紅色脂滴溢到細(xì)胞外（見圖2）。

圖2 油紅染色后奶牛肝細(xì)胞形態(tài)

2.2 DL-乙硫氨酸對(duì)肝細(xì)胞成活率和TG含量的影響 的最佳濃度。最終確定最佳造模條件為，2 mmol/l的DL-乙硫氨酸培養(yǎng)24 h。

圖3 DL-乙硫氨酸對(duì)肝細(xì)胞成活率的影響

由圖3可知，培養(yǎng)24 h時(shí)，當(dāng)濃度增加到5 mmol/l時(shí)，肝細(xì)胞成活率顯著下降；48 h時(shí)，當(dāng)濃度增加到2 mmol/l時(shí)，細(xì)胞成活率顯著下降。故應(yīng)舍去對(duì)肝細(xì)胞成活率有顯著影響的造模濃度。

數(shù)據(jù)顯示，DL-乙硫氨酸作用于肝細(xì)胞24、48 h后，2 mmol/l組與對(duì)照組之間TG含量均呈極顯著差異(P＜0.01)(見表1)。結(jié)合MTT所測(cè)肝細(xì)胞成活率及油紅O染色結(jié)果，選取肝細(xì)胞成活率與對(duì)照組相比無顯著性差異，明顯觀察到肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴，TG含量較對(duì)照組顯著增加的濃度，作為奶牛脂肪肝體外造模

表1 DL-乙硫氨酸對(duì)肝細(xì)胞TG含量的影響(mmol/l，n=8)

2.3 丹參處理脂肪變性肝細(xì)胞后ALT、AST、TG、TNF-α、SOD、MDA的變化（見表2）

由表2可知，與正常組比較，模型組ALT、AST、TG、TNF-α、MDA的水平顯著升高（P＜0.01），SOD活性明顯降低（P＜0.01），提示模型組存在明顯的肝細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝紊亂及脂質(zhì)過氧化損傷。與模型組相比，5、20、100、500 μg/ml丹參處理組能顯著降低ALT、AST水平（P＜0.05或P＜0.01）；5、20、100、500 μg/ml處理組中TG水平顯著降低（P＜0.01）；5、20、100、500 μg/ml組 TNF-α含量明顯下降；20、100、500 μg/ml組能明顯降低MDA含量，提高SOD含量。

表2 丹參處理24 h后ALT、AST、TG、TNF-α、SOD、MDA的變化(n=8)

2.4 丹參對(duì)奶牛肝細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響（見圖4）

由圖4可知，24 h時(shí)，丹參對(duì)NF-κB的表達(dá)無明顯影響；48 h時(shí)，隨丹參濃度的增加，NF-κB的表達(dá)呈逐漸降低的趨勢(shì)。

2.5 丹參對(duì)奶牛肝細(xì)胞CYP450的影響（見圖5）

由圖5可知，隨丹參濃度增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CYP450的表達(dá)呈逐漸降低的趨勢(shì)。

圖4 丹參對(duì)奶牛肝細(xì)胞NF-κB的影響

圖5 丹參對(duì)奶牛肝細(xì)胞CYP450的影響

3 討論

本試驗(yàn)采用Seglen[6]改良的“膠原酶兩步灌流法”成功獲得了形態(tài)完整、活力強(qiáng)、純度高的原代奶牛肝細(xì)胞。由于乙硫氨酸能取代甲基而提供乙基引起肝臟蛋白合成障礙,使負(fù)責(zé)把轉(zhuǎn)運(yùn)TG的載脂蛋白減少,從而導(dǎo)致TG在肝臟蓄積，最終形成脂肪肝，所以本試驗(yàn)采用DL-乙硫氨酸制作奶牛脂肪變性肝細(xì)胞的體外模型。結(jié)果顯示，2 mmol/l的DL-乙硫氨酸作用24 h后，肝細(xì)胞的TG含量顯著升高，油紅染色結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中存在大量脂滴。說明DL-乙硫氨酸成功地誘導(dǎo)了奶牛脂肪變性肝細(xì)胞的體外模型，這為進(jìn)一步研究奶牛脂肪肝的發(fā)病機(jī)制提供了新的方法。

脂肪肝的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，當(dāng)前被眾多學(xué)者所接受的是“二次打擊”學(xué)說[7]，其中氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在第二次打擊中起著重要作用。氧化應(yīng)激可使體內(nèi)活性氧自由基（ROS）大量生產(chǎn)，使氧化程度超出氧化物的清除能力，最終致使氧化—抗氧化系統(tǒng)失衡；而自由基和脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物如MDA會(huì)損害細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，導(dǎo)致肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生嚴(yán)重?fù)p害[8]，進(jìn)一步加劇了脂肪肝的形成。此外，ROS的大量產(chǎn)生引起細(xì)胞因子如TNF-α等的過量釋放，致使肝組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。另外，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以通過促進(jìn)外周脂肪動(dòng)員，刺激肝臟脂質(zhì)合成，或通過對(duì)過氧化物及其他炎性因子的刺激而引起肝組織的損傷[9-10]。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于真核細(xì)胞胞漿內(nèi)。NF-κB一旦被激活后，可以移位至細(xì)胞核內(nèi)并與雙鏈DNA分子結(jié)合，因而可以調(diào)控下游的細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子等多種基因的表達(dá)[11]，來參與肝損害的發(fā)生。CYP450是物質(zhì)代謝的主要酶系，大部分位于肝臟內(nèi)，在很多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝過程中發(fā)揮著極其重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，CYP2E1可加重氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧，增強(qiáng)第二次打擊，導(dǎo)致脂肪肝的進(jìn)一步發(fā)展。脂肪肝患者中，CYP2E1蛋白表達(dá)的結(jié)果與肝臟損傷情況和脂肪變性程度關(guān)系密切[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，丹參對(duì)奶牛脂肪變性肝細(xì)胞有顯著的預(yù)防和治療作用，其作用機(jī)制可能與以下幾方面因素有關(guān)：對(duì)DL-乙硫氨酸引起的肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用；通過降低TG含量、減輕脂質(zhì)沉積來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂；通過降低MDA含量，升高SOD的活性，使氧化與抗氧化保持在相對(duì)平衡狀態(tài)；通過抑制腫瘤細(xì)胞壞死因子（TNF-α）的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，而NF-κB的表達(dá)的降低一方面可進(jìn)一步調(diào)控TNF-α的釋放，減輕肝細(xì)胞炎癥損害，促進(jìn)肝細(xì)胞的恢復(fù)，另一方面可能通過影響CYP450蛋白表達(dá)水平來減輕肝細(xì)胞脂肪變性引起的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷，改善脂肪變性程度，但其詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。