酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)和非特異性免疫力的影響

■楊奇慧 譚北平 王鳳美 董曉慧 遲淑艷 劉泓宇

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088）

近年來(lái)，對(duì)蝦的規(guī)模化和集約化養(yǎng)殖程度不斷提高，凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）成為主要養(yǎng)殖的品種之一。凡納濱對(duì)蝦飼料中魚(yú)粉用量通常高達(dá)30%左右，成為對(duì)蝦飼料成本中最大的組成部分。長(zhǎng)期以來(lái)，由于海洋漁業(yè)資源的減少及捕撈量的下降，魚(yú)粉資源供應(yīng)嚴(yán)重不足。我國(guó)使用的魚(yú)粉主要靠進(jìn)口，2011年魚(yú)粉進(jìn)口量已高達(dá)100萬(wàn)噸以上，成為制約我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸。因此，尋求可替代魚(yú)粉的蛋白源，成為水產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)與飼料研究的熱點(diǎn)之一。

水產(chǎn)動(dòng)物不僅對(duì)飼料蛋白需求量高（凡納濱對(duì)蝦飼料蛋白水平高達(dá)40%以上），而且其對(duì)蛋白質(zhì)的消化能力較弱（馮昭信，2008）。因此，水產(chǎn)動(dòng)物極易出現(xiàn)蛋白質(zhì)的消化不良和水質(zhì)變差的現(xiàn)象。因此，選擇優(yōu)質(zhì)氮源才能使水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)潛力最大程度地發(fā)揮。大量研究已證實(shí)，蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)動(dòng)物消化后，是以小肽和氨基酸的形式被吸收（楊鳳，2005）。與氨基酸的吸收相比，小肽的吸收競(jìng)爭(zhēng)低、耗能低、速度快、效率高（Gilbert等，2008）。小肽作為氮源有以下幾方面的優(yōu)勢(shì)：①可以緩解動(dòng)物的消化負(fù)擔(dān)，提高飼料利用率（Sun等，2009）；②維持腸道結(jié)構(gòu)正常、促進(jìn)消化道和消化器官的生長(zhǎng)發(fā)育、提高消化酶活性（楊義，2005）；③增強(qiáng)免疫能力（楊義，2005）；④促進(jìn)體蛋白沉積（Boza等，1995；樂(lè)國(guó)偉等，1998）。因此，將蛋白原料進(jìn)行體外酶解生產(chǎn)的小肽產(chǎn)品，既符合水產(chǎn)動(dòng)物的生理需求特點(diǎn)，又能更有效地利用蛋白資源。植物蛋白源具有資源豐富、供應(yīng)穩(wěn)定、安全等方面的優(yōu)勢(shì)，成為制備小肽產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料。

酶解植物蛋白（Enzymolysis plant protein，EPP）是以大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白等優(yōu)質(zhì)蛋白為原料，經(jīng)組合液態(tài)酶解工藝，生產(chǎn)的富含小肽的產(chǎn)品。本試驗(yàn)旨在研究凡納濱對(duì)蝦飼料中添加不同水平的酶解植物蛋白與進(jìn)口魚(yú)粉組合，對(duì)凡納濱對(duì)蝦生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)和非特異性免疫能力的影響，尋找在凡納濱對(duì)蝦配合飼料中可替代魚(yú)粉的非常規(guī)蛋白源的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼料

試驗(yàn)選擇健康對(duì)蝦苗720尾，平均分為6個(gè)處理組，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，放入18個(gè)0.5 m3的玻璃纖維鋼桶中，每桶40尾，分別投喂6種試驗(yàn)飼料。以對(duì)蝦商業(yè)飼料作參考配制基礎(chǔ)飼料，以魚(yú)粉（秘魯進(jìn)口魚(yú)粉，含粗蛋白68%）、豆粕、花生粕作為蛋白源，魚(yú)油及大豆油作為脂肪源，并補(bǔ)充無(wú)機(jī)鹽、維生素等配制成基礎(chǔ)飼料?；A(chǔ)飼料中分別添加0、2%、4%、6%、8%和10%的酶解植物蛋白（等量替代進(jìn)口魚(yú)粉），配制成6種試驗(yàn)飼料（見(jiàn)表1）。在配制飼料過(guò)程中，各種原料粉碎過(guò)60目篩，按表1的配方準(zhǔn)確稱量各種飼料原料，微量添加成分采取逐級(jí)擴(kuò)大法混合均勻，再添加30%左右的水分，再次混勻后，壓制成粒徑為1.0 mm和1.5 mm的顆粒飼料。風(fēng)干后，用自封袋密封，放于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料配方及主要營(yíng)養(yǎng)成分（%）

1.2 飼料管理

試驗(yàn)在廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行。每天按對(duì)蝦體重的8%～10%投餌，分別在07：00、11：30、17：30、21：00共投喂4次。試驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)沉淀和過(guò)濾的海水，每天觀察對(duì)蝦攝食、蛻殼、生長(zhǎng)情況并記錄投喂量、水溫、pH值、鹽度、溶氧等水質(zhì)參數(shù)，每周定期測(cè)定水中氨氮含量，試驗(yàn)期為56 d。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束前24 h停止投喂。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，稱重并記尾數(shù)，計(jì)算增重率和成活率。每桶中隨機(jī)選取5尾蝦，保存于-20℃冰箱中，用于全蝦體成分分析；每桶再選取10尾蝦，用1 ml注射器從圍心腔中抽血，將血液置于1.5 ml Eppendorf中，待4℃冰箱中靜置過(guò)夜后離心，取上清液備用。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)

增重率（%）=100×[終末均重(g)-初始均重(g)]∕初始均重(g)；特定生長(zhǎng)率（%∕d）=100×{ln[終末均重(g)]-ln[初始均重(g)]}∕試驗(yàn)天數(shù)(d)；飼料系數(shù)=攝食量(g)∕[終末體重(g)-初始體重(g)]；蛋白質(zhì)效率(%)=100×[終末體重(g)-初始體重(g)]∕（攝食量×飼料蛋白質(zhì)含量）；成活率（%）=100×終末蝦尾數(shù)∕初始蝦尾數(shù)。

1.4.2 體成分分析

參照AOAC（1995）方法，分別測(cè)定全蝦樣品中的水分、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的含量。其中：水分含量的測(cè)定通過(guò)用恒溫烘箱在105℃下，烘干至恒重測(cè)定水分含量；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用自動(dòng)凱氏定氮儀（2300-Auto-analyzer，F(xiàn)oss Tecator，Sweden）測(cè)定；脂肪含量的測(cè)定采用自動(dòng)脂肪測(cè)定儀（Soxtec System 2050，F(xiàn)oss Tecator，Sweden）；灰分含量的測(cè)定是在550℃馬福爐中灼燒12 h后測(cè)得。

1.4.3 血清中非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定血清酚氧化酶(Phenol antioxidant enzyme,PO)、超氧化物歧化酶（Surperoxide dismutase,SOD）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (Alanine aminotransferase，GPT)活性。血清中的超氧化物歧化酶活性按鄧碧玉等（1991）改良的聯(lián)苯三酚自氧化法測(cè)定；酚氧化酶活性參照Ashida等（1971）以L-dopa為底物比色的方法測(cè)定。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性用賴氏法測(cè)定。以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)值用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）”表示，采用SPSS（12.0）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），對(duì)組間有顯著差異的（P＜0.05），結(jié)合Duncan's法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦生產(chǎn)性能的影響（見(jiàn)表2）

由表2可知，飼料中添加4%的酶解植物蛋白，對(duì)凡納濱對(duì)蝦的末重、增重率、飼料系數(shù)和特定生長(zhǎng)率無(wú)顯著影響（P＞0.05）。添加6%～10%的酶解植物蛋白使飼料系數(shù)增加，而其它指標(biāo)均降低。隨酶解植物蛋白水平的升高，成活率未出現(xiàn)顯著的變化（P＞0.05）。

表2 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦生產(chǎn)性能的影響

2.2 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表3）

表3 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清葡萄糖、膽固醇和甘油三酯的含量均有不同程度的影響，對(duì)總蛋白含量的影響不顯著（P＞0.05）。在此配方條件下，飼料中添加6%的酶解植物蛋白，對(duì)血清葡萄糖、膽固醇和甘油三酯含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

2.3 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦全蝦體成分的影響

由表4可知，飼料中添加2%～6%的酶解植物蛋白，可以提高凡納濱對(duì)蝦體蛋白含量。隨酶解植物蛋白添加水平的升高，凡納濱對(duì)蝦其他體成分的變化無(wú)明顯的規(guī)律性。

表4 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦全蝦體成分的影響(%)

2.4 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清酶活性的影響（見(jiàn)表5）

由表5可知，飼料中添加6%的酶解植物蛋白，對(duì)蝦血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；但谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

表5 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清酶活性的影響(U∕ml)

3 討論

3.1 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦生產(chǎn)性能的影響

對(duì)蝦飼料中魚(yú)粉用量很高，隨著魚(yú)粉資源的短缺，尋找魚(yú)粉的替代蛋白源已成為水產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)與飼料研究的熱點(diǎn)。水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)蛋白需求量高且對(duì)蛋白質(zhì)消化能力較弱，使其對(duì)蛋白原料的質(zhì)量要求很高。已有大量研究表明，與常規(guī)植物蛋白原料相比，酶解植物蛋白可以促進(jìn)鯽（Carassius aumtus）（劉文斌等，2007；Gui等，2010）、鯉（Cyprinus carpiovar Jian）（馮琳等，2008）、凡納濱對(duì)蝦（冷向軍等，2006）的生長(zhǎng)和降低餌料系數(shù)，說(shuō)明了酶解植物蛋白可以作為水產(chǎn)飼料中的一種優(yōu)質(zhì)氮源。研究結(jié)果顯示，適宜水平的酶解植物蛋白（2%～4%的富力肽）可部分地替代對(duì)蝦飼料中的進(jìn)口魚(yú)粉，不會(huì)影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)和飼料利用效率。表2結(jié)果進(jìn)一步表明，成活率并未隨酶解植物蛋白水平的變化而顯著變化，與劉文斌等（2007）和冷向軍等（2006）的研究結(jié)果一致。酶解植物蛋白是以優(yōu)質(zhì)的植物蛋白為原料，經(jīng)組合液態(tài)酶解生產(chǎn)的小肽產(chǎn)品，其符合水產(chǎn)動(dòng)物的生理需求特點(diǎn)，可以作為水產(chǎn)飼料中魚(yú)粉的替代蛋白源。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)飼料中添加6%～10%的酶解植物蛋白，對(duì)蝦的生長(zhǎng)和飼料利用效率降低。與馮琳等（2008）在建鯉上的研究結(jié)果一致，但高水平的酶解植物蛋白導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，這可能與其自身的消化生理特點(diǎn)有關(guān)。一方面，動(dòng)物的消化道需要充分鍛煉；另一方面，需要適當(dāng)補(bǔ)充小肽。因此，只有當(dāng)飼料中氨基酸、小肽和蛋白質(zhì)需要合理組合，才能使動(dòng)物的生產(chǎn)潛力最大程度發(fā)揮，但對(duì)于不同動(dòng)物其適宜的組合比例不同。

3.2 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率的影響

血清葡萄糖濃度可以反映動(dòng)物體內(nèi)糖代謝狀況，同時(shí)也是反映飼料營(yíng)養(yǎng)是否適當(dāng)和肝臟機(jī)能是否良好的指標(biāo)（趙萬(wàn)鵬等，2002）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加2%～6%的酶解植物蛋白對(duì)血清葡萄糖濃度無(wú)顯著影響（P＞0.05），添加更高水平酶解蛋白時(shí)，血清葡萄糖濃度降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，添加適宜水平的酶解植物蛋白，可以保證水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)正常的糖代謝，不會(huì)造成肝臟代謝負(fù)擔(dān)。而血清甘油三酯含量的提高說(shuō)明了體內(nèi)能量增加，細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)加速，甘油三酯可為新的細(xì)胞膜和細(xì)胞器提供脂類（駱作勇等，2007）。膽固醇不僅是皮質(zhì)類激素和性激素的前體，還能用于合成新的細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜等（沈同等，1996）。正常情況下，甘油三酯含量的升降往往伴隨著膽固醇的升降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，2%～6%的酶解植物蛋白對(duì)血清甘油三脂和膽固醇含量無(wú)顯著影響，更高水平時(shí)二者的濃度降低。研究結(jié)果表明，添加適宜水平的酶解植物蛋白，可以保證水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)正常的脂肪代謝、細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)發(fā)育。血清總蛋白含量反映動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)代謝狀況（胡俊茹等，2010）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著酶解植物蛋白水平的升高，血清總蛋白水平無(wú)顯著變化，但高水平有降低趨勢(shì)。高水平的酶解植物蛋白會(huì)降低血清葡萄糖、甘油三酯和膽固醇含量，即一定程度影響體內(nèi)脂肪和碳水化合物的代謝，這可能是高水平酶解植物蛋白導(dǎo)致對(duì)蝦生產(chǎn)性能下降的原因之一。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是廣泛存在于動(dòng)物線粒體中重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用（楊義，2005）。在適宜的營(yíng)養(yǎng)條件下，動(dòng)物蛋白代謝保持穩(wěn)定，血清轉(zhuǎn)氨酶活性大小反映了氨基酸代謝強(qiáng)度的大小。表4結(jié)果顯示，使用2%～6%的酶解植物蛋白，可提高對(duì)蝦血清谷草和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，即增強(qiáng)了對(duì)蝦體內(nèi)氨基酸代謝的強(qiáng)度，這表明了酶解植物蛋白可以增強(qiáng)對(duì)蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝，這也與蝦體組成中蛋白質(zhì)含量一定程度升高有關(guān)。

3.3 酶解植物蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫能力的影響

酚氧化酶系統(tǒng)是對(duì)蝦體內(nèi)重要的異物識(shí)別和防御系統(tǒng)，酚氧化酶催化生成的黑色素及黑化反應(yīng)的中間產(chǎn)物均具有細(xì)胞毒性或抗微生物功能，所以酚氧化酶系統(tǒng)激活對(duì)于維持甲殼動(dòng)物體液的無(wú)菌性十分重要（Sritunyalucksana等，2000）。表5結(jié)果可見(jiàn)，添加2%～8%的酶解植物蛋白，可顯著提高對(duì)蝦血清酚氧化酶活性，即增強(qiáng)對(duì)蝦清除病原體的能力。超氧化物歧化酶（SOD）能催化超氧陰離子的歧化作用，產(chǎn)生過(guò)氧化氫和氧，是一種重要的抗氧化酶。SOD活性變化可反映對(duì)蝦的免疫狀態(tài)，衡量對(duì)蝦的機(jī)能健康狀況（趙紅霞等，2010）。結(jié)果表明，使用酶解植物蛋白后，對(duì)蝦血清SOD活性持續(xù)升高，即對(duì)蝦的免疫能力持續(xù)增強(qiáng)。結(jié)果表明，使用不同水平的酶解植物蛋白均可以增強(qiáng)對(duì)蝦的免疫能力。但對(duì)蝦的成活率并未隨酶解植物蛋白水平的升高而顯著提高，這與冷向軍等（2006）的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

酶解植物蛋白可以增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)代謝，促進(jìn)體蛋白沉積；酶解植物蛋白可以增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫能力，提高疾病抵抗力；酶解植物蛋白具有小肽所特有的生理功能優(yōu)勢(shì)，但需與魚(yú)粉等蛋白質(zhì)原料合理組合，才能充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，激發(fā)動(dòng)物的最大生產(chǎn)潛力；本試驗(yàn)條件下以生產(chǎn)性能為標(biāo)識(shí)，酶解植物蛋白可以等量替代4%的進(jìn)口魚(yú)粉。