β-呋喃果糖苷酶在離子液體中的酶學(xué)特性研究

■馬歌麗 韓甜甜 李全喜 魏 濤 毛多斌

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase，EC3.2.1.26)是一種重要的工具酶，主要用于催化合成功能性低聚糖和糖苷類化合物。國內(nèi)外有關(guān)β-呋喃果糖苷酶的催化反應(yīng)研究多在水介質(zhì)中進(jìn)行。近年來，離子液體作為一種新型溶劑已成為酶催化反應(yīng)的重要介質(zhì)，不僅具有不易揮發(fā)、對(duì)環(huán)境友好、可設(shè)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，而且其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)還可以增加酶的穩(wěn)定性[1-2]。離子液體是由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成的、在100℃以下呈液體狀態(tài)的鹽類。用于酶催化反應(yīng)的離子液體通常由烷基取代的咪唑陽離子([R1R3IM]+)與非配位性的四氟硼酸根()、六氟磷酸根()、三氟甲磺酸根()等陰離子組成。在離子液體的酶催化反應(yīng)研究中，文獻(xiàn)報(bào)道較多的是脂肪酶、蛋白酶和氧化還原酶，而糖苷酶在離子液體中的催化反應(yīng)報(bào)道很少[3-4]，所以將β-呋喃果糖苷酶引入到離子液體介質(zhì)中進(jìn)行研究具有重要意義。

主要通過探索離子液體的種類和濃度、反應(yīng)溫度、pH值、底物濃度對(duì)酶活性的影響，研究了黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶在離子液體中的酶學(xué)特性，以期得到離子液體中β-呋喃果糖苷酶的最佳作用條件，了解酶在離子液體中的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為離子液體中酶催化反應(yīng)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉YA03，鄭州輕工業(yè)學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室誘變選育。

1.1.2 主要試劑

蔗糖，分析純，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；葡萄糖，分析純，BioBasic公司；果糖，優(yōu)級(jí)純，Amresco公司；蔗果三糖(1-Kestose)，色譜純，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；乙腈，色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；[BMIM][PF6]和[BMIM][BF4]，分析純，上海成捷化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

JY1001電子天平，上海浦春計(jì)量儀器有限公司；UV1000紫外可見分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-22M高速冷凍離心機(jī)，賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；702型微量進(jìn)樣器，Hamil?ton公司；2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)儀，美國Waters公司；1525型高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 β-呋喃果糖苷酶的制備

黑曲霉YA03菌種經(jīng)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液進(jìn)行真空抽濾，收集菌體，用pH值5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液溶解，冰浴下超聲波破碎，于4℃、10 000 r/min離心20 min，上清液即為胞內(nèi)粗酶液。

向胞內(nèi)粗酶液中緩慢加入硫酸銨至95%飽和度，邊加邊緩慢攪拌至硫酸銨完全溶解，在4℃冰箱中放置3 h，于4℃、8 000 r/min離心20 min，棄去上清液，得沉淀。沉淀物用pH值5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液溶解，殘留的不溶性物質(zhì)通過離心除去，上清酶液于4℃下透析24 h，中間更換透析液兩次，得粗酶液。

1.2.2 酶活測(cè)定——高效液相色譜法(HPLC)

1.2.2.1 離子液體中酶催化反應(yīng)體系

取1 ml 60%蔗糖溶液（用pH值5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液配制），加至1 ml離子液體中，再加入酶液0.5 ml，于40℃恒溫水浴反應(yīng)24 h[5]，沸水浴中10 min終止反應(yīng)。

1.2.2.2 酶活定義

在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol蔗果三糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)，用U/ml表示。

1.2.2.3 酶活計(jì)算

式中：m——蔗果三糖的量(mg)；

504.44——蔗果三糖的摩爾質(zhì)量（g/mol）；

t——反應(yīng)時(shí)間(min)；

V——酶液體積(ml)。

1.2.2.4 蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.02 g蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并定容至10 ml，配制成2 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)母液，再分別稀釋成濃度為1、0.4、0.2、0.1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用HPLC進(jìn)行檢測(cè)分析，以蔗果三糖濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.2.5 樣品處理

酶反應(yīng)后的樣品液離心，除去蛋白沉淀，上清液用純水適當(dāng)稀釋，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，然后進(jìn)行HPLC分析。

1.2.2.6 HPLC檢測(cè)條件[6-7]

檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)儀，色譜柱為Amide柱（46 mm×250 mm，內(nèi)經(jīng)×長度），流動(dòng)相為乙腈∶水=80∶20，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl，柱溫35 ℃，管溫70 ℃，分析時(shí)間40 min，對(duì)照為1.0 mg/ml的蔗果三糖、蔗糖、葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 離子液體種類對(duì)酶活的影響

選擇疏水性離子液體[BMIM][PF6]和親水性離子液體[BMIM][BF4]純?nèi)軇┘尤敕磻?yīng)體系中[8-10]，酶催化反應(yīng)后通過HPLC測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物蔗果三糖的量，考察離子液體種類對(duì)β-呋喃果糖苷酶催化活性的影響。

1.2.4 離子液體濃度對(duì)酶活的影響

選擇1.2.3得到的最佳離子液體，用緩沖液配制成濃度為25%、50%、75%、100%（V/V）的離子液體溶液，加入反應(yīng)體系中，酶催化反應(yīng)后通過HPLC測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物蔗果三糖的量，考察離子液體濃度對(duì)β-呋喃果糖苷酶催化活性的影響。

1.2.5 離子液體中酶學(xué)特性研究

1.2.5.1 溫度對(duì)酶活的影響

將反應(yīng)體系分別置于 35、40、45、50、55 ℃和60℃水浴中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取樣進(jìn)行HPLC分析，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

1.2.5.2 酶的熱穩(wěn)定性研究

將酶液分別置于30、40、50、60、70、80 ℃水浴中5 h，分別取上述酶液加入反應(yīng)體系中，進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取樣進(jìn)行HPLC分析，確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.5.3 pH值對(duì)酶活的影響

分別用pH值4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液配制60%的蔗糖溶液，添加到離子液體反應(yīng)體系中，再加入酶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取樣進(jìn)行HPLC分析，確定酶的最適pH值。

1.2.5.4 酶的pH值穩(wěn)定性研究

分別用pH值3～8的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液溶解經(jīng)硫酸銨沉淀后的酶，室溫保持5 h，分別取上述酶液加入反應(yīng)體系中，反應(yīng)結(jié)束后取樣進(jìn)行HPLC分析，確定酶的pH值穩(wěn)定性。

1.2.5.5 底物對(duì)酶活性的影響

分別配制15%、30%、45%和60%濃度的蔗糖溶液，添加到離子液體中，再加入酶液，反應(yīng)24 h后取樣進(jìn)行HPLC分析，確定最佳底物濃度。

1.2.5.6 水相和離子液體中酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

用pH值5.2的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液配制不同濃度（0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mol/l）的蔗糖溶液，各取1 ml，加入0.5 ml酶液，再加入1 ml緩沖液。于40℃恒溫水浴反應(yīng)2 h，置沸水浴中10 min，終止反應(yīng)，取樣進(jìn)行HPLC分析。

用pH值5.2的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液配制不同濃度（0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mol/l）的蔗糖溶液，各取1 ml，加入0.5 ml酶液，再加入1 ml 50%離子液體[BMIM][PF6]。于40℃恒溫水浴反應(yīng)2 h后，置沸水浴中10 min，終止反應(yīng)，取樣進(jìn)行HPLC分析。

反應(yīng)初速度(V)定義為單位時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)體系中的蔗果三糖濃度的增加量，計(jì)算公式如下。

式中：M——反應(yīng)時(shí)刻蔗果三糖的濃度(mmol/l)；

M0——反應(yīng)初使時(shí)刻蔗果三糖的濃度(mmol/l，M0=0)；

t——反應(yīng)時(shí)間(min)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蔗果三糖濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

將終濃度為1.0 mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)糖液進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)糖液的HPLC圖譜

2.3 離子液體種類對(duì)酶活的影響

將60%蔗糖底物和酶液分別加入疏水性離子液體[BMIM][PF6]和親水性離子液體[BMIM][BF4]中，在相同條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，以水相為對(duì)照，HPLC分析結(jié)果如圖3～圖5可知。

分別對(duì)圖3～圖5中的蔗果三糖峰面積進(jìn)行積分，得到不同反應(yīng)體系中酶催化反應(yīng)產(chǎn)物蔗果三糖的量，由外標(biāo)法計(jì)算得到β-呋喃果糖苷酶在水相、[BMIM][PF6]和[BMIM][BF4]中的酶活力分別為0.155 7、0.294 8 U/ml和0.083 8 U/ml。由此可見，在相同的反應(yīng)條件下，β-呋喃果糖苷酶在疏水性離子液體[BMIM][PF6]中的催化活性比水相中提高了89.3%，而在親水性離子液體[BMIM][BF4]中的催化活性比水相中降低了46.2%。分析原因可能是反應(yīng)體系的極性影響酶的活性。由于離子液體[BMIM][BF4]的極性大于[BMIM][PF6]，在極性較高的環(huán)境中，酶分子的構(gòu)象變化較大從而導(dǎo)致酶催化位點(diǎn)的部分失活。另外，離子液體的親水性會(huì)導(dǎo)致維持酶結(jié)構(gòu)與功能的水分子被離子液體剝奪，對(duì)酶活性產(chǎn)生一定影響。由于離子液體[BMIM][BF4]的親水性大于[BMIM][PF6]的親水性，使酶在[BMIM][BF4]中的部分活性喪失[11-12]。因此選擇疏水性離子液體[BMIM][PF6]為反應(yīng)介質(zhì)。

圖3 水相中酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜

圖4 離子液體[BMIM][PF6]中酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜

圖5 離子液體[BMIM][BF4]中酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜

2.4 離子液體濃度對(duì)酶活的影響

分別在25%、50%、75%、100%（V/V）的疏水性離子液體[BMIM][PF6]中進(jìn)行酶催化反應(yīng)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，離子液體濃度對(duì)酶活的影響結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，隨著疏水性離子液體[BMIM][PF6]濃度的增大，酶活呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)疏水性離子液體[BMIM][PF6]濃度為50%時(shí)，β-呋喃果糖苷酶的轉(zhuǎn)移活性最大。原因可能是適當(dāng)濃度的離子液體能促進(jìn)底物和酶的結(jié)合，使酶活增大；但離子液體濃度過大，反應(yīng)體系的黏度增大和離子強(qiáng)度較高，增大了傳質(zhì)阻力，影響底物和酶分子的結(jié)合，從而使酶活降低[13]。因此選擇50%疏水性離子液體[BMIM][PF6]作為后續(xù)反應(yīng)的最佳濃度。

2.5 溫度對(duì)酶活的影響

將60%蔗糖與酶液加入50%疏水性離子液體[BMIM][PF6]中，分別于35、40、45、50、55、60 ℃水浴中反應(yīng)24 h，測(cè)定酶活，溫度對(duì)酶活的影響結(jié)果如圖7所示。

圖6 離子液體濃度對(duì)酶活性的影響

圖7 β-呋喃果糖苷酶的最適溫度

溫度不僅影響酶的活性，還會(huì)影響離子液體的黏度。溫度升高，離子液體的黏度降低，使酶和底物在反應(yīng)介質(zhì)中分散更均勻；但溫度過高，酶的活性構(gòu)象遭到破壞，導(dǎo)致酶活降低甚至喪失[14]。由圖7可知，在小于40℃范圍內(nèi)，β-呋喃果糖苷酶的活性隨著反應(yīng)溫度的升高而增大；在40～60℃范圍內(nèi)，酶活隨著溫度的升高而降低。由此確定，β-呋喃果糖苷酶的最適溫度為40℃。

2.6 酶的熱穩(wěn)定性研究

將酶液分別置于30、40、50、60、70、80 ℃水浴中保溫5 h，分別取上述酶液和60%蔗糖加入疏水性離子液體[BMIM][PF6]中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定剩余酶活，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，β-呋喃果糖苷酶在30～50℃范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，保溫5 h后殘余酶活達(dá)80%以上；溫度大于50℃時(shí)，酶活力急劇下降；當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，酶活幾乎全部喪失。

2.7 pH值對(duì)酶活的影響

分別將不同pH值(4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0）緩沖液配制的60%蔗糖溶液和酶液加入疏水性離子液體[BMIM][PF6]中催化反應(yīng)24 h，測(cè)定酶活，pH值對(duì)酶活的影響結(jié)果如圖9所示。

圖8 β-呋喃果糖苷酶的熱穩(wěn)定性

圖9 β-呋喃果糖苷酶的最適pH值

pH值不僅會(huì)影響酶的活性，還會(huì)影響底物與酶復(fù)合物的解離狀態(tài)，從而影響酶與底物的結(jié)合；過酸或過堿的環(huán)境還可使酶變性失活。由圖9可知，β-呋喃果糖苷酶的最適pH值為5.2，小于或大于此pH值β-呋喃果糖苷酶的轉(zhuǎn)移活性均降低。

2.8 酶的pH值穩(wěn)定性

將酶在不同pH值緩沖液中放置5 h，分別取上述酶液和60%蔗糖加入疏水性離子液體[BMIM][PF6]中反應(yīng)24 h，測(cè)定剩余酶活，結(jié)果如圖10所示。

圖10 β-呋喃果糖苷酶的pH值穩(wěn)定性

由圖10可知，在pH值4.5～6.5范圍內(nèi)，β-呋喃果糖苷酶具有較好的穩(wěn)定性，酶活力保持在80%以上；pH值達(dá)到8.0時(shí)，酶活力損失最多。

2.9 底物濃度對(duì)酶活的影響

分別將不同濃度（15%、30%、45%、60%）的蔗糖溶液與酶液加入疏水性離子液體[BMIM][PF6]中，反應(yīng)24 h后測(cè)定酶活力，結(jié)果如圖11所示。

圖11 底物濃度對(duì)酶活性的影響

由圖11可以看到，蔗糖濃度在15%～60%范圍內(nèi)，β-呋喃果糖苷酶的轉(zhuǎn)移活性隨著蔗糖濃度的增大而升高，說明增大底物濃度，有利于反應(yīng)的進(jìn)行和產(chǎn)物的合成。由于蔗糖溶解度的原因，蔗糖濃度不再增大。由此確定，β-呋喃果糖苷酶的最適底物濃度為60%。

2.10 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

為進(jìn)一步了解離子液體對(duì)β-呋喃果糖苷酶催化蔗糖反應(yīng)生成蔗果三糖的影響，比較研究了水相和離子液體中酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)[13]。

米氏方程兩側(cè)取倒數(shù)，得到下面方程式：

以底物濃度的倒數(shù)l/[S]為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速度的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖12所示。

圖12 β-呋喃果糖苷酶的Lineweaver-Burk圖

由圖12可知，l/[S]對(duì)1/V進(jìn)行線性擬合，計(jì)算得到水相中動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值分別為1.475 mol/l和1.131 mmol/(min·l)，50%疏水性離子液體[BMIM][PF6]中動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值分別為1.081 mol/l和1.585 mmol/(min·l)。根據(jù)酶反應(yīng)理論，米氏常數(shù)Km為酶促反應(yīng)的特征常數(shù)，反映了酶與底物的親和能力，Km值大，表示酶與底物的親和力小，反之則大[15]。由上面結(jié)果可知，在50%疏水性離子液體[BMIM][PF6]中酶的Km值比水相中的小，說明疏水性離子液體[BMIM][PF6]的存在增強(qiáng)了β-呋喃果糖苷酶和底物的親和能力，從而使β-呋喃果糖苷酶在疏水性離子液體[BMIM][PF6]中的活性增加。最大反應(yīng)速度Vmax則表示酶催化反應(yīng)能力的大小，Vmax大，反應(yīng)能力越強(qiáng)。由上面的結(jié)果可知，50%疏水性離子液體[BMIM][PF6]中的Vmax值比水相中的大，說明50%離子液體[BMIM][PF6]的反應(yīng)體系比水相體系更有利于提高β-呋喃果糖苷酶的轉(zhuǎn)移活性。

3 結(jié)論

①與水相對(duì)比，β-呋喃果糖苷酶在疏水性離子液體[BMIM][PF6]中的酶催化活性提高了89.3%，而在親水性離子液體[BMIM][BF4]中的酶催化活性降低了46.2%，且50%疏水性離子液體[BMIM][PF6]是β-呋喃果糖苷酶催化蔗糖合成蔗果三糖的最佳反應(yīng)介質(zhì)。

②在50%疏水性離子液體[BMIM][PF6]中，β-呋喃果糖苷酶的最適蔗糖濃度為60%，最適溫度為40℃，最適pH值為5.2，酶在30～50℃及pH值4.5～6.5范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

③疏水性離子液體[BMIM][PF6]的存在增強(qiáng)了β-呋喃果糖苷酶和底物的親和能力，更有利于提高β-呋喃果糖苷酶的轉(zhuǎn)移活性。