一種低溫α-淀粉酶的酶學性質研究

■閆祥洲 劉金愛 吳 勃 杜曉陽 陳敏杰 何俊佳

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院，河南鄭州450002；2.杭州保安康生物技術有限公司，浙江杭州311508）

淀粉是單胃動物能量的主要來源，其供能占總能量需求的60%～80%。幼齡動物消化系統(tǒng)發(fā)育不成熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。隨著動物日糧配方的富營養(yǎng)化、飼養(yǎng)條件應激和環(huán)境污染問題越來越突出，成年健康動物添加“外源性營養(yǎng)消化酶”的作用也越來越明顯，意義也越來越大。通過添加外源性淀粉酶來提高飼料淀粉的消化吸收，對于提高動物生產(chǎn)性能、節(jié)約飼料資源意義重大。

目前飼料專用淀粉酶的研究開發(fā)較少，一般均采用食品加工、化纖、印染等工業(yè)用酶。中溫α-淀粉酶是飼料工業(yè)中應用最多的淀粉酶，其最適作用溫度為70～80℃，pH值5.0以下失活嚴重。動物生理環(huán)境溫度一般為37～42℃，胃內pH值較低，中溫淀粉酶在動物消化道內發(fā)揮作用甚微。低溫淀粉酶最適作用溫度比中溫淀粉酶要低20～30℃，因此，研究開發(fā)低溫淀粉酶對飼料用酶而言具有重要意義。

飼用淀粉酶應具備以下幾個條件：在動物體溫（37～42℃）的溫度條件下能發(fā)揮高的活性；最適pH值與消化道內食糜的pH相一致；對淀粉有高的酶解效率（內切酶）；具有良好的穩(wěn)定性（在飼料高溫制粒過程中的穩(wěn)定性、保存過程中的穩(wěn)定性以及在動物消化道中對胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金屬離子等的耐受性）[7]。本研究根據(jù)飼用α-淀粉酶的所需條件，對低溫α-淀粉酶的酶學性質進行了研究，為飼料專用淀粉酶的開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌種

從采集到的樣品中分離純化并經(jīng)誘變育種得到。

1.2 培養(yǎng)基

固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成：麩皮50%、大豆粉25%、玉米粉15%、玉米芯7%、葡萄糖2%、酵母膏0.35%、Mg?SO40.04%、KH2PO40.1%、CaCl20.01%、NH4Cl 0.5%。

1.3 藥品和試劑

1.3.1 0.05 mol硫代硫酸鈉

將13 g Na2S2O3·5H2O和0.1 g無水碳酸鈉溶解定容至1 000 ml。

1.3.2 費林試劑

銅溶液：硫酸銅34.66 g溶解在水中，定容至500 ml。

酒石酸鉀鈉堿溶液：酒石酸鉀鈉173 g和氫氧化鈉50 g溶解在水中，定容至500 ml。

使用前，精確地取等體積的銅溶液和堿液充分混合。

1.3.3 1 mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH值5.0）

1 mol/l乙酸鈉溶液：三水合乙酸鈉溶解在水中，定容至250 ml；1 mol/l乙酸溶液：冰乙酸15 ml溶解在水中，定容至250 ml；將1 mol/l乙酸鈉溶液加入到1 mol/l的乙酸溶液中，調pH值至5.0。

1.3.4 30%碘化鉀溶液

將碘化鉀150 g溶解于350 ml水中，保存在褐色試劑瓶中，避免陽光直射。

1.3.5 25%硫酸溶液

硫酸125 g溶于373 ml水中。

1.3.6 可溶性淀粉溶液（pH值5.0）

將可溶性淀粉（試劑級）在105℃干燥4 h后稱量計算含水量。然后，根據(jù)可溶性淀粉的含水量稱取0.5 g（折干）的可溶性淀粉，緩慢加入到50 ml水中，煮沸5 min，用自來水冷卻后，加入1 mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH值5.0）5 ml，用水定容至100 ml。

1.4 低溫淀粉酶活力的測定方法

將可溶性淀粉溶液加到100 ml Erlenmyer三角瓶中，置于（40±0.5）℃恒溫水浴中。預熱10～15 min，加入樣品稀釋酶液，準確加熱30 min后。加入費林試劑使酶失活。將三角燒瓶直接在煤氣噴燈（或電爐）上加熱2 min后，立即放在自來水中冷卻。隨后，加入30%碘化鉀溶液和25%硫酸溶液，用0.05 mol/l硫代硫酸鈉溶液滴定游離出的碘，以藍色消失作為滴定終點T30（ml）。

空白對照試驗：以水取代酶液。在另一個三角燒瓶中用上述同樣的操作步驟測定空白對照值T0，臨近終點時，加入1%可溶性淀粉溶液1～2滴，以藍色消失作為滴定終點。

酶活力單位定義為：1 g固體酶粉（或1 ml液體酶），于40℃、pH值5.0條件下，反應30 min，反應液中產(chǎn)生相當于10 mg葡萄糖的還原糖所需的酶量為1個酶活力單位。

式中：T30——酶反應液滴定消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積(ml)；

T0——空白溶液滴定消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積(ml)；

f——0.05 mol硫代硫酸鈉溶液濃度的校正系數(shù)；

1.62——換算系數(shù)；

1/10——該分析方法的常數(shù)（相當于10 mg葡萄糖的還原糖）；

n——樣品的稀釋倍數(shù)。

2 試驗結果

2.1 產(chǎn)酶菌株的發(fā)酵培養(yǎng)與活力檢測

在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的碳、氮源及微量的無機鹽，將經(jīng)過篩選和育種得到的菌株接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)50 h。烘干、粉碎后測定低溫淀粉酶活力，發(fā)現(xiàn)固體發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮50%、大豆粉25%、玉米粉15%、玉米芯7%、葡萄糖2%、酵母膏0.35%、MgSO40.04%、KH2PO40.1%、CaCl20.01%、NH4Cl 0.5%時，酶活高達3 820 U/g。

2.2 酶學性質的研究

2.2.1 低溫α-淀粉酶作用溫度的研究

在pH值5.0的酶活測定反應體系中，分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃溫度下測定酶活，溫度對酶活的影響如圖1。

圖1 溫度對酶活的影響

由圖1可知，該低溫α-淀粉酶最適作用溫度為50℃，在35～60℃之間均有較高的酶活。

2.2.2 低溫α-淀粉酶的最適作用pH值

在40℃的酶活測定反應體系中，分別調節(jié)pH值為2.2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，測定結果如圖2所示。

由圖2可知，該低溫淀粉酶最適作用pH值為5.2，在pH值4.0～6.0之間均有較高的酶活。

2.2.3 低溫α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性

為了準確評估低溫淀粉酶經(jīng)飼料高溫制粒后的實際存留率，本試驗在飼料中添加20%的低溫α-淀粉酶，然后進行85℃高溫制粒后進行評估，試驗結果見圖3。

圖2 pH值對酶活的影響

圖3 酶的熱穩(wěn)定性

由圖3可知，制粒前低溫α-淀粉酶理論值為624 U/g，實際檢測值為603 U/g，經(jīng)過85℃制粒后酶活為531 U/g，酶活存留率達到88.1%，說明在高溫制粒過程中低溫α-淀粉酶具有較好的耐受性能，適用于飼料制粒工藝。

2.2.4 低溫α-淀粉酶的耐酸性評估

將制得的酶液分別用pH值3.5、4.0、4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理0、1、2、3、4 h，測定淀粉酶活力，結果如圖4所示。

圖4 低溫淀粉酶的耐酸性

用pH值3.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4 h后，淀粉酶活力存留80%以上，經(jīng)pH值4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4 h后，淀粉酶活力存留90%以上，說明該淀粉酶耐酸性良好。

2.2.5 體外模擬耐胃蛋白酶試驗

模擬動物體內生理環(huán)境，在溫度40℃條件下，加入1 mg/ml的新鮮胃蛋白酶鹽溶液（0.1 N，pH值3.5），處理5 h，每隔1 h測定淀粉酶活，見圖5。

由圖5可知，在pH值3.5、溫度40℃、用1 mg/ml的胃蛋白酶溶液處理淀粉酶5 h后，淀粉酶活力存留仍在80%以上。

圖5 耐胃蛋白酶試驗

2.2.6 HPLC對酶解產(chǎn)物的分析

取一定量5%的淀粉溶液，預熱保溫40℃，加入一定量的低溫淀粉酶，控制反應時間為30 min，然后沸水浴5 min使酶失活，微孔膜過濾后，利用HPLC分析樣品中各物質的分子量分布，圖譜峰見圖6。

圖6 低溫淀粉酶酶解產(chǎn)物HPLC圖譜

從圖6可以看出，低溫淀粉酶酶解產(chǎn)物分子量多集中于5 000以下，占酶解物總量的70.26%。

3 結論與討論

通過分離純化篩選到的菌株，產(chǎn)淀粉酶活力能夠達到3 820 U/g，同國內報道的低溫淀粉酶菌株相比，具有較高的研究應用價值。該淀粉酶是一種內切型α-淀粉酶，最適反應溫度為50℃，最適作用pH值為5.2，在pH值4.0～6.0之間具有較高活性；該低溫淀粉酶有較好的耐酸性和耐熱性，用pH值4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液處理4 h后，淀粉酶活力存留90%以上，經(jīng)過85℃高溫制粒后，酶活存留率為88.1%。采用體外模擬耐胃蛋白酶試驗，證明胃蛋白酶對其無影響。

從酶學性質分析，該菌株生產(chǎn)的低溫α-淀粉酶適合動物消化道環(huán)境條件，能夠耐受高溫制粒，在飼料行業(yè)有很大的應用前景。