纖維素降解細菌的篩選及其產(chǎn)酶條件研究

■王 蕾 李賢宇

（天津渤海職業(yè)技術學院，天津300402）

植物纖維素是植物細胞壁的主要成分，是地球上最豐富、最廉價而又可再生的資源。目前，我國飼料原料資源短缺，因此，開發(fā)利用纖維素資源對我國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重要的意義。即使能夠利用纖維素的反芻動物也因內(nèi)源酶不足極大地降低了飼料的消化率及利用率。因此，高效的纖維素酶的開發(fā)成為植物纖維用于飼料的關鍵。

纖維素酶作為一種安全、高效的生物催化劑已廣泛應用到飼料、食品、紡織、生物能源開發(fā)等行業(yè)，有著非常廣闊的應用前景。但是飼料工業(yè)中纖維素酶還存在一系列問題，如菌株產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高、酶活力下降迅速等。同時，目前纖維素酶生產(chǎn)菌株多為真菌，相對于細菌來說，存在諸多缺點。因此，本研究從牛瘤胃中篩選出纖維素分解菌，旨在為有效處理高纖維素類物質(zhì)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品采集

牛瘤胃內(nèi)容物采自泰安市三合水廠附近養(yǎng)牛場。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：微晶纖維素5.0 g、NaNO31.0 g、Na2HPO4·12H2O 0.65 g、KH2PO40.9 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、酵母膏0.5 g、水解酪蛋白 0.5 g，蒸餾水1 000 ml，pH值自然，121℃滅菌20 min。

羧甲基纖維素鈉剛果紅培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g、酵母膏1.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂15 g、剛果紅0.2 g、土豆 10 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 5.0 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g、胰蛋白胨5 g、酵母膏1 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離篩選

菌種的富集培養(yǎng)：在將樣品稀釋涂布到鑒別纖維素分解菌的羧甲基纖維素鈉剛果紅培養(yǎng)基之前，先通過選擇培養(yǎng)富集纖維素分解菌，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。對取來的牛瘤胃內(nèi)容物進行預處理，將其研磨成小顆粒，取1 g加入到50 ml富集培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，適時振蕩。取富集培養(yǎng)液作分離篩選實驗。

菌種的分離篩選：取1 ml富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋，挑選合適濃度在羧甲基纖維素納剛果紅平板上進行平板涂布，28℃恒溫培養(yǎng)3 d。在眾多不同形態(tài)菌落中挑取能夠產(chǎn)生水解圈的菌382株。將挑選菌株點接于羧甲基纖維素納剛果紅平板，28℃恒溫培養(yǎng)3 d后，根據(jù)水解圈大小進行初步篩選。測定CMC相對酶活，平板劃線分離單菌落，觀察記錄菌落形態(tài)，接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，進行菌種保藏。

1.2.2 酶活力的測定

CMC相對酶活的測定：測量點接于羧甲基纖維素鈉剛果紅培養(yǎng)基上的菌株水解圈直徑，計算CMC酶相對酶活。CMC相對酶活A（cm/d）=水解圈直徑（cm）/培養(yǎng)時間（d）。

CMC酶活力的測定：采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測定酶解液中還原糖含量。將各菌分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3 d。取2 ml發(fā)酵液和2 ml 0.5%CMC-Na溶液加入比色管，振蕩均勻，50℃水浴加熱30 min。取出后，在每個比色管中加入1.5 ml DNS試劑，沸水浴5 min,立即冷卻，并定容至25 ml。520 nm處測其光密度值，對比標準曲線，計算酶活力。在該條件下，1 ml發(fā)酵液在30 min內(nèi)催化生產(chǎn)1 mg還原糖稱為1個酶活力單位。

計算公式表示如下：

酶活力單位(U)=1 mg葡萄糖/(1 ml發(fā)酵液·30 min)。

1.2.3 培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)溫度為28℃，轉速160 r/min、pH值自然，研究不同發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響；培養(yǎng)溫度為28℃，轉速160 r/min，培養(yǎng)時間64 h，研究不同pH值對產(chǎn)酶的影響；pH值6.0，轉速160 r/min，培養(yǎng)時間64 h，研究不同溫度對產(chǎn)酶的影響；培養(yǎng)溫度為28℃，pH值6.0，培養(yǎng)時間64 h，研究不同轉速對產(chǎn)酶的影響。

2 結果與分析

2.1 菌株分離篩選

2.1.1 纖維素降解菌的初篩

將經(jīng)富集培養(yǎng)挑選的菌株點接于羧甲基纖維素納剛果紅平板，28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，根據(jù)水解圈大小進行初步篩選，選擇相對酶活較高的菌株，結果見表1。

表1 相對酶活力值（28℃5 d）

通過觀察羧甲基纖維素鈉剛果紅平板各菌落發(fā)現(xiàn)，C1、C2、C6、C8、C9、C10、C11菌株逆光觀察菌落周圍有正圓形水解圈，但顏色較淺，C5菌株有明顯水解圈，邊緣明確，培養(yǎng)基表面下凹。這一結果和表1中各菌落水解圈直徑及相對酶活一致。

2.1.2 纖維素降解菌復篩

對初篩獲得8株菌株進行搖瓶復篩，結果見表2。

由表2可以看出，在相同條件培養(yǎng)下，C5號菌酶活力較其它菌株最強。

2.1.3 C5菌株的初步鑒定

將篩選到的C5菌株培養(yǎng)3 d，菌落成圓形、乳白色不透明、低突起、表面濕潤、邊緣光滑。細胞呈短桿狀，有芽孢，菌株為革蘭氏陽性菌（見圖1），經(jīng)穿刺培養(yǎng)表明為需氧或兼性厭氧菌，因此，該菌株為芽孢桿菌屬菌株。

2.2 培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響

圖1 C5菌株革蘭氏染色效果

2.2.1 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)溫度為28℃，轉速160 r/min、pH值自然，分別在12、20、28、36、44、52、60、68、76、84 h進行酶活測定，結果見圖2。

圖2 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

由圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間延長，纖維素酶活力逐漸提高，64 h達到最大值，之后隨著發(fā)酵時間的延長，纖維素酶活力略微下降。

2.2.2 發(fā)酵液初始pH值對產(chǎn)酶的影響

設定初始pH值分別為4、5、6、7、8、9、10，培養(yǎng)溫度為28℃，轉速160 r/min，培養(yǎng)時間64 h后測定其酶活，結果見圖3。

圖3 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

由圖3可以看出，在28℃恒溫且其它條件都相同的情況下培養(yǎng)64 h，纖維素酶活隨著pH值升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，pH值為6.0時，CMC酶活力達到最大，說明C5菌生長適宜中性偏酸環(huán)境。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

pH值6.0，轉速160 r/min，分別在16、20、24、28、32、36℃下培養(yǎng)64 h，測定其酶活變化，結果見圖4。

由圖4可以看出，溫度對微生物產(chǎn)酶有著重要的影響，在16～28℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，C5菌產(chǎn)酶能力逐漸提高，然后隨著溫度升高，產(chǎn)酶能力呈現(xiàn)下降趨勢。因此，C5菌最適產(chǎn)酶溫度為28℃。

2.2.4 轉速對產(chǎn)酶的影響

轉速分別設定120、140、160、180、200、220、240 r/min,培養(yǎng)溫度為28℃，pH值6.0，培養(yǎng)時間64 h后測定酶活，結果見圖5。

圖4 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

圖5 轉速對產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，轉速對C5產(chǎn)酶能力有著一定影響，低轉速及高轉速對產(chǎn)酶均不利。當轉速達到180 r/min時，酶活力最高。

3 結論

從牛瘤胃內(nèi)容物中經(jīng)富集培養(yǎng)、初篩、復篩獲得纖維素酶相對較高的菌株C5，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌屬菌株。經(jīng)發(fā)酵試驗證明，菌株C5在28℃生長較好，產(chǎn)酶的最適初始培養(yǎng)基pH值為6.0，最佳搖床轉速為180 r/min，發(fā)酵64 h后，酶活力達到最高峰，該菌株在生產(chǎn)中具有一定的應用前景。

（參考文獻10篇，刊略，需者可函索）