聚乳酸/乙醇酸可吸收醫(yī)用膜對(duì)兔腹腔術(shù)后粘連的預(yù)防作用研究

龐秀炳，潘永明，華菲，孫朝英，陳亮，陳方明，朱科燕，徐劍欽，陳民利

1 浙江普洛醫(yī)藥科技有限公司，東陽(yáng)市，322118

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州市，310053

聚乳酸/乙醇酸可吸收醫(yī)用膜對(duì)兔腹腔術(shù)后粘連的預(yù)防作用研究

【作 者】龐秀炳1，潘永明2，華菲1，孫朝英1，陳亮2，陳方明2，朱科燕2，徐劍欽2，陳民利2

1 浙江普洛醫(yī)藥科技有限公司，東陽(yáng)市，322118

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州市，310053

目的 研究聚乳酸/乙醇酸可吸收醫(yī)用膜對(duì)兔腹腔術(shù)后粘連的預(yù)防作用。方法 日本大耳白兔66只，隨機(jī)分成3組，正常對(duì)照組n=6，模型對(duì)照組n=30，PLGA膜組n=30。除正常對(duì)照組外均采用多因素法復(fù)制腹腔術(shù)后粘連模型，PLGA膜組在盲腸創(chuàng)面貼敷PLGA膜。術(shù)后1、2、4、6、12周后打開(kāi)腹腔，評(píng)定腹膜粘連程度，并對(duì)盲腸組織行羥脯氨酸水平測(cè)定和HE組織病理學(xué)觀察。 結(jié)果 (1) 模型對(duì)照組的粘連程度和羥脯氨酸水平均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05, P＜0.01)，且PLGA膜組的粘連程度和羥脯氨酸水平均顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)。(2) HE染色顯示模型對(duì)照組盲腸漿膜層有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生。PLGA膜能抑制纖維細(xì)胞的增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少和膠原纖維明顯減少。結(jié)論 PLGA膜能抑制成纖維細(xì)胞的增生和膠原蛋白的形成，減輕了兔術(shù)后粘連發(fā)生的程度和范圍。

聚乳酸/乙醇酸可吸收醫(yī)用膜；腹腔粘連；兔

腹部粘連是臨床術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥和嚴(yán)重的外科問(wèn)題[1]，不僅給患者帶來(lái)痛苦，還耗費(fèi)了大量醫(yī)療資源并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但是，粘連不僅是腹膜應(yīng)對(duì)多種損傷（如創(chuàng)傷、異物、輻射）等有害因素刺激的保護(hù)性生理反應(yīng)[2]，又是一種有害的病理性反應(yīng)。近來(lái)認(rèn)為引起腹腔粘連的共同途徑是纖維蛋白的滲出[3]，且預(yù)防腹膜粘連，使受損腹膜出現(xiàn)再上皮化修復(fù)是當(dāng)前外科基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)雖然透明質(zhì)酸、殼聚糖、氧化纖維素等材料相繼被研發(fā)，但由于降解速率快慢程度、生物抗原性以及材料使用單一等問(wèn)題，使得這些防粘連效果存在參差不齊的缺點(diǎn)。因而，復(fù)合材料的應(yīng)用將有很好的發(fā)展前景，是近來(lái)防粘連產(chǎn)品研發(fā)的新方向。聚乳酸/乙醇酸（poly（L-lactic/ glycolic acid, PLGA）是由乳酸和乙醇酸聚合而成的可生物降解的醫(yī)用復(fù)合高分子材料，具有較高的生物相容性，其最終降解產(chǎn)物為二氧化碳和水，對(duì)生物體并無(wú)危害。為此，本實(shí)驗(yàn)采用多因素法復(fù)制兔腹腔術(shù)后粘連模型，觀察聚乳酸/乙醇酸可吸收醫(yī)用膜對(duì)預(yù)防腹腔術(shù)后粘連的作用，為聚乳酸/乙醇酸可吸收醫(yī)用膜在臨床中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)日本大耳白兔66只，體質(zhì)量為(1.9～2.1) kg，雌雄各半，來(lái)源于上虞市星火兔業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)[SCXK(浙)2008-0036]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心兔飼養(yǎng)室[SYXK(浙)2008-0116]，環(huán)境溫度為(20～22)oC，相對(duì)濕度為50%～70%，飼喂全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水，12 h/12 h明暗交替。

1.2 材料及試劑設(shè)備

聚乳酸/乙醇酸可吸收醫(yī)用膜(PLGA膜)，乳白色，柔軟，規(guī)格：50 mm×60 mm×H012，輻照滅菌；由浙江普洛家園生物醫(yī)學(xué)材料有限公司研制；羥脯氨酸(HyP)和蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；DU800紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Beckman公司，病理切片設(shè)備，美國(guó)Microm公司，NIKON H550S倒置顯微鏡，日本NIKON公司。

1.3 方法

1.3.1 分組及處理

經(jīng)適應(yīng)性觀察1周后，空腹取兔耳中動(dòng)脈抗凝血，測(cè)定血液學(xué)和生化指標(biāo)，經(jīng)檢測(cè)指標(biāo)無(wú)明顯異常后，隨機(jī)分成3組，即：正常對(duì)照組6只，模型對(duì)照組30只、PLGA膜組30只，其中模型對(duì)照組和PLGA膜組分別在術(shù)后1、2、4、6、12周時(shí)各處理6只，正常對(duì)照組于12周時(shí)處理6只，雌雄各半。

1.3.2 兔腹部術(shù)后粘連模型的制備

按文獻(xiàn)[4]采用多因素法復(fù)制兔腹部術(shù)后粘連模型。術(shù)前禁食20 h后，各兔用3%戊巴比妥鈉溶液以30 mg/kg耳緣靜脈麻醉，待麻醉穩(wěn)定后仰臥位固定，腹部剃毛和常規(guī)無(wú)菌消毒后，沿腹正中線縱向切開(kāi)5 cm，提出盲腸，置于無(wú)菌紗布上，使?jié){膜干燥，使用銼刀在控制損傷面積內(nèi)(5×3) cm2輕刮盲腸漿膜面10遍，直至控制面積內(nèi)的盲腸漿膜面輕度點(diǎn)狀滲血，再滴3滴無(wú)水乙醇于創(chuàng)面，然后用銼刀刮傷對(duì)應(yīng)的雙側(cè)腹壁各10下，每側(cè)損傷面積控制在(5×2) cm2以內(nèi)。回納盲腸，分兩層以1～0號(hào)絲線關(guān)閉腹腔，消毒創(chuàng)口后放回飼養(yǎng)籠。模型對(duì)照組行盲腸和腹壁損傷后即關(guān)腹處理，PLGA膜組行盲腸和腹壁損傷后，在關(guān)閉腹腔前將(5×3) cm2的PLGA可吸收醫(yī)用膜平放于盲腸漿膜損傷面上，正常對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)處理（行腹部正中切開(kāi)，不做其它損傷處理）。手術(shù)結(jié)束后，觀察各兔蘇醒情況，并在術(shù)后肌注青霉素4萬(wàn)單位，連續(xù)2 d。

1.3.3 一般情況觀察及腹膜粘連程度評(píng)分

試驗(yàn)期間觀察各組動(dòng)物的體重、外觀體征、行為活動(dòng)、傷口愈合情況、糞便、尿液以及飲食飲水等情況。并參考Nair[5]制定的五級(jí)粘連分級(jí)法，將粘連程度分為0～4級(jí)，進(jìn)行目視分級(jí)評(píng)分：0 級(jí)，無(wú)任何粘連，分值0分；Ⅰ級(jí)，臟器與臟器或臟器與腹壁間有一處粘連帶，分值1分；Ⅱ級(jí)，臟器與臟器間或臟器與腹壁間有二處粘連帶，分值2分；Ⅲ級(jí)，臟器與臟器間或臟器與腹壁間有二處以上粘連帶，或有腸間粘連，分值3分；Ⅳ級(jí)，不論粘連帶的多少及程度，臟器直接粘連到腹壁，分值4分。

1.3.4 盲腸壁羥脯氨酸（HyP）含量的測(cè)定

取兔的粘連盲腸壁組織，加入9倍冷的生理鹽水沖入勻漿管中，在冰水中用勻漿機(jī)反復(fù)勻漿，制成10%的勻漿液，勻漿后以3 500 rpm離心10 min，取上清液，用生理鹽水稀釋成1%勻漿。然后用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定組織中蛋白的含量，再用消化法測(cè)定組織中羥脯氨酸（HyP）含量，測(cè)定方法均按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。

1.3.5 盲腸組織 HE染色觀察

取粘連盲腸組織一段，10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、包埋、切片，行蘇木素伊紅HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組實(shí)驗(yàn)兔盲腸組織的病理形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間粘連分級(jí)和病理組織評(píng)分比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。其它指標(biāo)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊，采用ANOVA單因素方差分析，并采用LSD法行多樣本均數(shù)間的兩兩比較。若方差不齊，則改用Dunnett's T3法與Dunnett's C法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

試驗(yàn)期間，各組實(shí)驗(yàn)兔在術(shù)中均未出現(xiàn)異常情況，且PLGA膜由于呈白色易識(shí)別，放置操作簡(jiǎn)單、膜柔軟并對(duì)組織的貼附性好。術(shù)后各組實(shí)驗(yàn)兔的傷口愈合良好，未見(jiàn)充血、潰瘍、滲出及感染化膿等發(fā)生，活動(dòng)正常，口、眼、耳、鼻部無(wú)分泌物，但模型對(duì)照組兔術(shù)后精神略顯萎頓、毛色欠缺光澤，進(jìn)食相對(duì)較差，糞便顆粒小且略帶稀，體重增重緩慢，至術(shù)后3周后癥狀略有緩解；PLGA膜組術(shù)后飲食比模型對(duì)照組相對(duì)較好，毛色略有光澤并緊貼身體，體重增重比模型對(duì)照組好，且在術(shù)后4周開(kāi)始與正常對(duì)照組相當(dāng)。正常對(duì)照組術(shù)后飲食和體重增重情況均無(wú)異常。

2.2 粘連程度評(píng)分結(jié)果

模型對(duì)照組術(shù)后1～6周時(shí)間點(diǎn)均發(fā)生I級(jí)以上粘連，部分盲腸與腹壁粘連緊密，粘連帶厚實(shí)難以剝離，術(shù)后12周后粘連程度有所降低；與模型對(duì)照組比，PLGA膜組粘連程度有所減緩，甚至無(wú)粘連出現(xiàn)，粘連帶易分離。各組粘連程度均存在顯著性差異(P＜0.01)，模型對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)粘連程度分值均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，PLGA膜組各時(shí)間點(diǎn)粘連程度分值均明顯低于模型對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組術(shù)后粘連程度分值 （x ± s，n=6 ）Tab.1 Comparison of post-surgical adhesion grade in each group

2.3 對(duì)盲腸壁組織HyP含量的影響

與正常對(duì)照組比，模型對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔盲腸壁組織HyP含量在術(shù)后2周開(kāi)始明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，并在4周時(shí)達(dá)到峰值；與模型對(duì)照組比，PLGA膜組術(shù)后2周開(kāi)始盲腸壁組織HyP含量均明顯低

2.4 盲腸組織HE染色觀察

HE染色光鏡下觀察可見(jiàn)，正常對(duì)照組的盲腸漿膜面結(jié)構(gòu)正常，無(wú)纖維結(jié)締組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖K)；模型對(duì)照組在術(shù)后1周、2周、4周時(shí)盲腸漿膜層有大量纖維結(jié)締組織增生，小血管明顯增多，成纖維細(xì)胞增生活躍，伴有較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，漿膜層增厚明顯(見(jiàn)圖A、C、E)，術(shù)后6周、12周時(shí)仍可見(jiàn)盲腸漿膜層有大量纖維結(jié)締組織增生，小血管明顯增加，成纖維細(xì)胞增生活躍，但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況相對(duì)術(shù)后前4周有所減少，并出現(xiàn)重度的膠原化改變(見(jiàn)圖G、I)。PLGA膜組盲腸漿膜層纖維組織與血管增生明顯減輕，少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并且漿膜層增厚程度和膠原化程度均有所減輕(見(jiàn)圖B、D、F、H、J)。

表2 各組盲腸組織HyP含量的變化（x ±s，mg/gprot，n=6 ）Tab. 2 Comparison of HyP in cecum tissues in each group (x ± s, mg/gprot, n=6)

圖1 各組盲腸組織HE染色結(jié)果 （HE×100）Fig. 1 Results of H&E staining in cecum tissue (HE×100)

3 討論

據(jù)報(bào)道，術(shù)后粘連中因腹部術(shù)后形成的粘連所占比重最大，高達(dá)80%以上，但出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀的患者不足10%[3,6]。倘若患者出現(xiàn)腹部不適就診后需要再次腹部手術(shù)時(shí)，腹腔粘連不僅影響手術(shù)的暴露，而且也增加了腹部臟器損傷的危害，容易導(dǎo)致出現(xiàn)更大范圍的腹腔粘連。因此，如何預(yù)防和避免術(shù)后腹腔粘連就顯得尤為重要。近來(lái)發(fā)現(xiàn)術(shù)后粘連的發(fā)生一般是由于手術(shù)操作過(guò)程過(guò)于粗暴、腹腔積血、炎癥感染或異物殘留等原因造成的，是多因素、復(fù)雜的形成過(guò)程。故本試驗(yàn)采用摩擦、牽拉等手術(shù)創(chuàng)傷加化學(xué)刺激等因素進(jìn)行多因素造模，復(fù)制兔腹腔術(shù)后粘連模型，不僅更符合臨床實(shí)際，而且保證了造模的成功率。結(jié)果顯示，模型對(duì)照組兔腹部術(shù)后1周開(kāi)始就發(fā)生明顯的粘連現(xiàn)象，且粘連等級(jí)相對(duì)穩(wěn)定，基本維持在3分左右，表明該模型成功率高、手術(shù)易于操作，方法穩(wěn)定，無(wú)動(dòng)物死亡現(xiàn)象，觀察指標(biāo)直接、客觀，能較好地反映實(shí)際情況。

在當(dāng)前臨床中雖然通過(guò)提高手術(shù)技巧、抗感染和促腸蠕動(dòng)等處理措施可降低腹腔粘連的發(fā)生率，但是防粘連的效果一般。目前普遍認(rèn)為在臨床術(shù)中使用屏障隔離物可有效預(yù)防腹腔粘連，并被臨床醫(yī)生越來(lái)越多地采用。聚乳酸/乙醇酸（PLGA）是一種新型的醫(yī)用生物材料，研究表明PLGA具有力學(xué)性能好，在生理狀態(tài)下可自行降解，最終分解成為H2O和CO2，其代謝產(chǎn)物對(duì)生物體無(wú)危害[7-8]，且該材料無(wú)細(xì)胞毒性和無(wú)致瘤性，具有良好的生物相容性[9-10]，并發(fā)現(xiàn)PLGA中GA含量越高，共聚物的降解速率越快，PLGA的降解符合本體水解的特征[11]。因此，PLGA材料在臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用上將具有廣闊的應(yīng)用前景，該材料已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)PLGA用于醫(yī)學(xué)使用，包括體內(nèi)植入[12]。本研究結(jié)果顯示，PLGA膜組兔的腹腔粘連范圍明顯比模型對(duì)照組少，程度也較輕，表明PLGA膜可減少腹腔粘連的發(fā)生率，且PLGA膜在體內(nèi)2周時(shí)就開(kāi)始部分降解，直至12周時(shí)PLGA膜便降解明顯，術(shù)區(qū)腸壁呈透明的薄膜狀，降解后崩解成的顆?；颈唤M織吸收完全，偶見(jiàn)幾粒被腸壁纖維包裹。這與Dinarvand[13]報(bào)道的PLGA膜能預(yù)防小鼠腹壁和腹膜粘連較為一致?？梢?jiàn)，PLGA膜比殼聚糖等單純材料的降解速率長(zhǎng)，能起到隔離創(chuàng)面并能維持相當(dāng)一段時(shí)間的完整性，以充分保證隔離時(shí)間，直至創(chuàng)口愈合的優(yōu)勢(shì)。

另外，術(shù)后粘連的形成還與組織過(guò)度修復(fù)有關(guān)，腹膜受損后滲出的纖維蛋白若未被及時(shí)溶解吸收，便會(huì)形成纖維蛋白性粘連，隨后被成纖維細(xì)胞增生取代，不斷合成膠原產(chǎn)生膠原纖維，將沉積物纖維化成永久性粘連。羥脯氨酸（HyP）是形成膠原的前體，組織中HyP可反映膠原代謝情況，同時(shí)也可反映組織修復(fù)愈合程度[14]。結(jié)果表明粘連模型對(duì)照組的盲腸壁HyP水平顯著高于正常對(duì)照組，與上述理論相符。PLGA膜組粘連程度、HyP水平均低于模型對(duì)照組，說(shuō)明PLGA膜通過(guò)減少膠原過(guò)度合成發(fā)揮抗粘連作用，同時(shí)又不影響損傷的正常修復(fù)。同樣，HE染色顯示，模型對(duì)照組術(shù)后出現(xiàn)明顯的纖維結(jié)締組織的增生以及膠原化程度明顯，并有小血管增生明顯和大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而PLGA膜組只有輕度纖維組織增生并伴有散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明PLGA膜具有較好的抗炎作用和抑制成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)盲腸壁的修復(fù)和保護(hù)作用。可見(jiàn)，PLGA膜通過(guò)機(jī)械屏障隔離作用，可抑制成纖維細(xì)胞的增生和膠原蛋白的形成，減輕了兔術(shù)后粘連發(fā)生的程度和范圍，是今后臨床上預(yù)防腹腔術(shù)后粘連理想的生物醫(yī)學(xué)材料。

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Effects of PLGA Absorbable Membrane on Preventing Postoperative Abdominal Adhesion in Rabbits

【W(wǎng)riters】Pang Xiubing1, Pan Yongming2, Hua Fei1, Sun Chaoying1, Chen Liang2, Chen Fangming2, Zhu Keyan2, Xu Jianqin2, Chen Minli2
1 Zhejiang Apeloa Medical Technology Co. Ltd., Dongyang, 322118
2 Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310053

PLGA absorbable membrane, abdominal adhesion, rabbit

R318.08

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.05.022

1671-7104(2014)05-0389-04

2014-01-15

浙江省生物可降解醫(yī)用材料工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目”(2011E10021)；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目

龐秀炳，高級(jí)工程師，E-mail: xb.pang@apeloajiayuan.com

陳民利，教授，E-mail: minlichen01@aliyun.com

【 Abstract 】Objective To investigate the effects of PLGA absorbable membrane in prevention of postoperative abdominal adhesion in rabbits. Methods 66 Japanese white rabbits were randomly divided into three groups: the normal control group n=6, model control group n=30 and PLGA group n=30. Rabbits were received multifactor methods to establish postoperative abdominal adhesion models except for normal control group. The cecum wound was covered PLGA membrane in the PLGA group. At postoperative 1, 2, 4, 6 and 12 weeks, the abdominal cavities were reopened and the adhesive severity was graded blindly, and the hydroxyproline level in cecum tissue was measured and the cecum histopathology was observed. Results (1) the degree of adhesion and hydroxyproline level in model control group were signifcantly higher than those of normal control group (P＜0.05, P＜0.01), while the degree of adhesion and hydroxyproline level in PLGA group were signifcantly lower than those of model control group (P＜0.05). (2) HE staining showed that cecum serosa had obviously infammatory cell infltration and fbroblast proliferation, while PLGA could inhibit fibroblast proliferation and reduce the inflammatory cell infiltration and collagen. Conclusion PLGA absorbable membrane can inhibit fibroblast proliferation and collagen to prevent the experimental postoperative peritoneal adhesions.