大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型的構(gòu)建

董長征 趙文清 李文玲 岳向勇 孔艷莉 康進(jìn)生 梁傳棟 王蘊(yùn)欣

大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型的構(gòu)建

董長征 趙文清 李文玲 岳向勇 孔艷莉 康進(jìn)生 梁傳棟 王蘊(yùn)欣

目的探討“無鎂細(xì)胞外液”誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元產(chǎn)生癲癇樣放電的可行性，以期建立難治性癲癇離體細(xì)胞模型。方法選取24 h內(nèi)新生Wistar大鼠，分離海馬神經(jīng)元后進(jìn)行原代培養(yǎng)，體外培養(yǎng)至第12天時，用“無鎂細(xì)胞外液”處理3 h，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄海馬神經(jīng)元的放電情況。結(jié)果在培養(yǎng)第12天時，神經(jīng)元突起間彼此接觸形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在“無鎂細(xì)胞外液”處理3 h后神經(jīng)元產(chǎn)生穩(wěn)定的放電，恢復(fù)正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，神經(jīng)元仍可檢測到自發(fā)的“癲癇樣放電”。結(jié)論體外培養(yǎng)第12天海馬神經(jīng)元，在“無鎂細(xì)胞外液”處理后可形成穩(wěn)定的自發(fā)性癲癇樣放電，為今后在細(xì)胞分子水平研究癲癇發(fā)病機(jī)制提供了一種理想模型。

海馬;神經(jīng)元;膜片鉗;癲癇樣放電;動作電位;原代培養(yǎng)

藥物難治性癲癇是神經(jīng)科常見病之一，其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，既往研究多來源于完整腦組織切片，遺傳模型以及培養(yǎng)神經(jīng)元模型，每一種癲癇模型都有其自身的優(yōu)勢和不足;除非使用藥物或電刺激，否則很難形成一個反復(fù)自發(fā)性癲癇模型［1］。體外培養(yǎng)的單純神經(jīng)元環(huán)路被認(rèn)為適合用于進(jìn)行復(fù)雜生物物理以及藥理遺傳學(xué)的研究來理解病理狀態(tài)下癲癇的傳播和維持。然而，盡管已經(jīng)有能力在培養(yǎng)的微小神經(jīng)元上誘發(fā)出藥理學(xué)意義上的癲癇樣活動［2］，但在培養(yǎng)神經(jīng)元中產(chǎn)生持久的自發(fā)性反復(fù)性癲癇發(fā)作尚困難重重。本研究擬將體外培養(yǎng)第12天的大鼠海馬神經(jīng)元，用“無鎂細(xì)胞外液”處理3 h，用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測神經(jīng)元動作電位的變化，建立海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型，為進(jìn)一步研究癲癇發(fā)病機(jī)制以及神經(jīng)肽Y藥物干預(yù)提供理想的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生24 h內(nèi)Wistar大鼠20只，由英國利茲大學(xué)生物系實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～23℃，濕度45% ～50%，清潔級。

1.2 主要試劑 Neurobasal TM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、L-多聚賴氨酸、B27、D-Hanks液、胰蛋白酶為GIBCO公司制品;氯化鎂(MgCl2·6H2O)分析純?yōu)橛鳩isher Scientific公司;正常細(xì)胞外液組成成分(mmol/L):NaCl 147，HEPES 10，Glucose 13，KCl2，CaCl2，MgC12;用 5 mmol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至7.3，調(diào)整滲透壓為280～320 mmol/L。無鎂細(xì)胞外液組成成分(mmol/L):NaCl 147，HEPES 10，Glucose 13，KCl 2，CaCl22;用5 mmol/L Na0H調(diào)節(jié)pH值至7.3，調(diào)整滲透壓為280～320 mmol/L。

1.3 主要儀器設(shè)備 膜片鉗放大器(Axon 200B)，模/數(shù)轉(zhuǎn)換器(Digidata 1320A 16-bit Aequisition System)，灌流控制系統(tǒng)(BPS-8)，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus240)，倒置相差顯微鏡(Olympus1 CK2)，微電極拉制儀(Model P-97)，微電極拋光儀(2002-C)，一次性細(xì)胞塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶(Costra)，AG135電子天平(Mettler Toled)。

1.4 方法

1.4.1 原代海馬神經(jīng)元的分離、種植與培養(yǎng):新生24 h Wistar大鼠，75%酒精消毒，斷頭取腦，移至盛有冷的事先配好的1×解剖液的培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡輔助下，去除腦組織表面的血管和軟腦膜，分離雙側(cè)大鼠海馬組織。將分離好的月牙形狀的海馬組織放進(jìn)盛有解剖液的1.5 ml eppendorf管中，移至細(xì)胞超凈臺。把500 μl 0.25%的胰蛋白酶-EDTA加到盛有500 μl的1×解剖液的eppendorf管中配置成2×解剖液備用;吸出盛有海馬標(biāo)本的eppendorf管中的1×解剖液，加入配好的1 ml 2×解剖液，37℃ CO2培養(yǎng)箱中消化15 min。吸出消化液，加入1 ml NM5培養(yǎng)基，中和胰酶，輕輕搖晃均勻;再次吸出NM5培養(yǎng)基，再次搖勻，再次吸掉NM5培養(yǎng)基，加入1 ml NM5培養(yǎng)基，用手動單道可調(diào)式移液器輕輕吹打組織塊15次(不超過20次)，制作成單細(xì)胞懸液。靜置3～5 min。向預(yù)先用0.1 mg/ml多聚賴氨酸過夜處理過的35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1.5 ml NM5培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿中預(yù)先放入4個載玻片。吸出含有海馬神經(jīng)元的上清液，勿吸入管底的細(xì)胞殘渣，用計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為(2～5)×105cells/ml，然后將細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞放入5%CO2，37℃，95%濕度的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 h后用NM5培養(yǎng)基全量換液;3 d后，用NM5培養(yǎng)基半量換液;自第6天起，用加入10 μmol/L阿糖胞苷(Ara-C)NM1培養(yǎng)基半量換液。每天在倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長狀況，包括細(xì)胞突起、形態(tài)、輪廓及細(xì)胞密度等。培養(yǎng)第12天的細(xì)胞用于后續(xù)膜片鉗試驗。

1.4.2 膜片鉗記錄海馬神經(jīng)元動作電位變化:將體外培養(yǎng)至第12天的海馬神經(jīng)元分為2組:正常細(xì)胞外液組，無鎂細(xì)胞外液處理組。后者，在神經(jīng)元換液后，改無鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h，恢復(fù)原維持液培養(yǎng)，然后，應(yīng)用膜片鉗系統(tǒng)進(jìn)行全細(xì)胞模式的電流鉗記錄。分別檢測2組神經(jīng)元動作電位情況。設(shè)定參數(shù):記錄模式為CClamp，C-fast 7.86 pF，C-Slow 50.00 pF，Amplitude 5.0 mV，length 5.0 ms，Gain 2 mV/PA。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)檢測 分離的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)12 h后大部分貼壁，24 h后細(xì)胞形態(tài)多樣，突起明顯增多。48 h后細(xì)胞突起不斷延長。培養(yǎng)第6天后，可見錐體形狀的神經(jīng)元，有立體感，細(xì)胞核呈空泡狀，核仁清晰。培養(yǎng)第12天后，細(xì)胞周圍有光暈，胞體略突出飽滿、折光性良好，細(xì)胞突起長，細(xì)胞之間形成廣泛的突觸聯(lián)系，典型的神經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成。16～18 d后神經(jīng)元突起斷裂，部分細(xì)胞開始裂解。選取小形態(tài)一致的多角形，胞體飽滿，周圍帶光暈發(fā)育良好神經(jīng)元用于后續(xù)膜片鉗試驗。見圖1。

2.2 海馬神經(jīng)元癲癇樣放電的記錄 體外培養(yǎng)正常海馬神經(jīng)元可見自發(fā)性興奮性突觸后電位，偶有動作電位發(fā)放;無鎂細(xì)胞外液處理神經(jīng)元3 h后，可檢測到頻發(fā)的動作電位發(fā)放，頻率15～25個/s，波幅70～98 mV。改用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，仍可檢測到較多的高波幅的異常放電，說明無鎂細(xì)胞外液處理神經(jīng)元3 h，可以形成穩(wěn)定的反復(fù)自發(fā)性癲癇樣放電模型，可以很好模擬人體內(nèi)神經(jīng)元癲癇樣放電狀態(tài)。見圖2～4。

圖1 原代培養(yǎng)第12天海馬神經(jīng)元形態(tài)

圖2 正常海馬神經(jīng)元偶有動作電位發(fā)放

圖3 無鎂細(xì)胞外液處理神經(jīng)元3 h頻繁動作電位發(fā)放

圖4 無鎂細(xì)胞外液處理神經(jīng)元24 h較多的動作電位發(fā)放

3 討論

近年來，對大多數(shù)的有關(guān)癲癇的機(jī)制研究多采用臨床手術(shù)標(biāo)本以及各種化學(xué)藥物或物理方法誘導(dǎo)的各種急慢性癲癇模型［3］，為了從細(xì)胞水平研究癲癇的發(fā)病機(jī)制，構(gòu)建一個能模擬人體內(nèi)神經(jīng)元放電的模型非常必要。

Mg2+在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常電生理活動和神經(jīng)元的突觸聯(lián)系中起著重要作用［4］。鎂離子在某些癲癇動物模型中顯示具有抑制癲癇發(fā)作和神經(jīng)保護(hù)作用，表現(xiàn)在下列幾方面:抑制Caspase-3的表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡;非競爭性阻斷NMDA受體，減少神經(jīng)毒性作用;能競爭磷脂離子連接位點起到抗氧自由基作用，抑制了脂質(zhì)過氧化。因此，移除細(xì)胞生存環(huán)境的鎂離子，可以誘發(fā)神經(jīng)元的高興奮性狀態(tài)，模擬神經(jīng)元異常放電［5］。Sombati等［6］研究提示無鎂誘發(fā)的神經(jīng)元出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)性發(fā)放的動作電位與臨床癲癇發(fā)作時的電生理活動極為類似，抗癲癇藥物如苯妥英鈉能抑制這類動作電位的發(fā)生。本部分研究根據(jù)上述鎂離子的生理特性，移除細(xì)胞外液鎂離子來模擬“癲癇微環(huán)境”，誘導(dǎo)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電。結(jié)果顯示經(jīng)無鎂細(xì)胞外液處理3 h后，100%神經(jīng)元出現(xiàn)頻發(fā)的高波幅動作電位發(fā)放。與處理前相比，動作電位的幅度和頻率明顯增高和增多;換用正常細(xì)胞外液培養(yǎng)后24 h，監(jiān)測90%以上的神經(jīng)元仍然存在反復(fù)自發(fā)性癲癇樣放電，有利的證實了此癲癇神經(jīng)元放電模型的穩(wěn)定可靠性。試驗中我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元經(jīng)無鎂細(xì)胞外液處理后易激惹，細(xì)胞活性較正常弱，但仍可進(jìn)行膜片鉗記錄電活動，無鎂細(xì)胞外液處理5 h后的神經(jīng)元活性較前減弱，較難用于膜片鉗封接，鑒于此，我們認(rèn)為無鎂細(xì)胞外液處理3 h時的神經(jīng)元最適合用來研究癲癇的細(xì)胞分子水平的電生理研究。

我們利用原代培養(yǎng)第12天的海馬神經(jīng)元進(jìn)行電生理研究，因為此時，培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元貼壁后形成許多突起，并且彼此之間形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，表明我們培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在體外仍能形成廣泛的突觸聯(lián)系，具備突觸間生物信息傳遞的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，能很好模擬在體神經(jīng)元的生理狀態(tài)。這與既往文獻(xiàn)報道相吻合［7］。我們先前研究已經(jīng)通過動物實驗觀察了神經(jīng)肽Y對癲癇大鼠發(fā)作的影響［8］;海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型的成功建立，為我們下一步在細(xì)胞分子學(xué)水平上研究神經(jīng)肽Y對癲癇神經(jīng)元興奮性的影響打下堅實基礎(chǔ)。

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4 Igelstrm KM，Shirley CH，Heyward PM.Low-magnesium medium induces epileptiform activity in mouse olfactory bulb slices.J Neurophysiol，2011，106:2593-2605.

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Establishment of the epileptiform discharge model in rat hippocampal neuron

DONG Changzheng，ZHAO Wenqing，LI Wenling，et al.Department of Functional Neurosurgery，，Hebei Procincial People＇s Hospital，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo explore the feasibility of epileptiform discharge of rat hippocampal neurons cultured in vitro and induced by magnesium-free extracellular fluid in order to establish refractory epilepsy model in cultured cells.MethodsThe neonatal Wistar rats within 24h were used to isolate hippocampal neuron to carry out primary culture in vitro.After 12d，the hippocampal neurons were treated with magnesium free extracellular fluid for 3h，then neuronal discharge activities were recorded by whole cell patch clamping technique.ResultsAfter 12 － day cell culture，neuronal dendrites touched each other to form neural network.After 3 － hour treatment by magnesium-free extracellular fluid，the neurons produced stable discharge，however，after 24 － hour treatment with normal cell culture fluid，the spontaneous epileptiform activity in neurons could still be observed.ConclusionThe stable spontaneous epileptiform activity can be formed in hippocanlpal neurons cultured in vitro for 12d，after exposed in magnesium free extracellular fluid for 3h，which provides an ideal model for pathogenetic research about epilepsy at cell and molecular level.

hippocampus;neurons;whole-cell patch-clamp technique;epileptiform discharges;action potential;primary culture

R 338

A

1002－7386(2014)14－2093－03

10.3969/j.issn.1002 －7386.2014.14.004

050051 石家莊市，河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科(董長征、趙文清、李文玲、岳向勇、孔艷莉、康進(jìn)生、梁傳棟)，麻醉科(王蘊(yùn)欣)

李文玲，050051 河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科;E-mail:liwelling@163.com

2014－01－11)