胃癌細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)與其侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性研究

李志海

胃癌細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)與其侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性研究

李志海

目的探討胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC-7901的多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)與其侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC-7901的多藥耐藥相關(guān)基因（包括ABCB1、MMP2、CDH1、CD44）的mRNA表達(dá)水平。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷徙實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)兩株胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)而探討胃癌細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)與侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系。結(jié)果熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株BGC-823的ABCB1、CDH1、CD44基因表達(dá)較SGC-7901高，而MMP2基因的表達(dá)在SGC-7901中較高。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷徙實(shí)驗(yàn)顯示胃癌細(xì)胞株BGC-823的遷徙能力比SGC-7901強(qiáng)。結(jié)論胃癌細(xì)胞的多藥耐藥與侵襲轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系，CD44的高表達(dá)在胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中可能起主要作用。

多藥耐藥；侵襲轉(zhuǎn)移；ABCB1；MMP2；CDH1；CD44

胃癌是目前最為常見的惡性腫瘤之一，隨著新的化療藥物的不斷出現(xiàn)，化療對(duì)胃癌的療效較以往有了顯著提高。然而大部分病人最終因腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性而使化療失敗，并常伴有侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)而導(dǎo)致病人最后死亡。腫瘤的化療多藥耐藥（multidrug resistance,MDR）和侵襲轉(zhuǎn)移（invasion/metastasis）成為了目前腫瘤治療中的兩大難題。為了克服化療耐藥性，減少腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，眾多學(xué)者在過去的幾十年一直致力于對(duì)兩者關(guān)系的研究。本研究選取在癌細(xì)胞多藥耐藥與侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用的E-鈣粘蛋白[1]（CDH1基因編碼）、金屬基質(zhì)蛋白酶-2（MMP-2基因編碼）[2]及與多藥耐藥密切相關(guān)的P-糖蛋白（MDR1基因編碼）[3]和CD44[4]等四個(gè)基因?yàn)閷?duì)象，進(jìn)一步在人胃癌細(xì)胞株上尋找有關(guān)腫瘤多藥耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性的證據(jù)。

材料與方法

一、材料

細(xì)胞人胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC-7901；購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

其他材料細(xì)胞培養(yǎng)使用的DMEM培養(yǎng)基干粉購自GIBCO Life Technology公司（Grand Island，NY）；DMEM培養(yǎng)基按GIBCO配方自制；小牛血清購自Hyclone公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自BD Falcon公司（BD Biosciences）。用于Western blot分析的抗體Anti-periostin抗體由國外合作實(shí)驗(yàn)室提供；Horseradish peroxidase-conjugated IgG抗體購自美國Zymed公司（San Francisco,CA）；其它抗體均購自Santa Cruz公司（Santa Cruz,CA）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）購自Millipore公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別購自Invitrogen或MBI公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

本文選用的細(xì)胞都是貼壁細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基或?qū)嶒?yàn)中特殊設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中通氣培養(yǎng)。通常當(dāng)細(xì)胞生長密度到達(dá)80%～90%時(shí)，需要傳代，首先將培養(yǎng)液吸去。加入適量胰酶消化溶液，使其均勻覆蓋細(xì)胞層，室溫放置1～2 min，吸去胰酶消化溶液。待細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫落下來后，加入少量培養(yǎng)液終止胰酶的作用，并用移液管數(shù)次吹打細(xì)胞使其分散。加入適宜體積的培養(yǎng)液，吹打混勻后根據(jù)需要接種到不同的培養(yǎng)皿中以備下一步實(shí)驗(yàn)之用。

三、實(shí)時(shí)定量qPCR

從BGC-823、SGC-7901中抽提總RNA，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin（肌動(dòng)蛋白）基因（HumanACTB）為內(nèi)參基因，根據(jù)ABCB1、MMP2、CD44、CDH1基因序列信息設(shè)計(jì)并合成PCR引物，序列見表1。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用目的基因特異性引物和內(nèi)參引物擴(kuò)增待檢測(cè)的目的基因片段和看家基因。

表1 ABCB1、MMP2、CD44、CDH1基因qPCR檢測(cè)引物信息

四、細(xì)胞刮痕實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長期的目的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，計(jì)數(shù)、制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為1× 106）接種于6-well中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到約95%。在單層細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞上，用200 μL槍頭沿培養(yǎng)板底部整齊垂直呈“一”字形劃痕，劃線時(shí)一定要呈直線，讓細(xì)胞斷層邊緣盡量的平滑，便于觀察細(xì)胞遷移。無血清培養(yǎng)基洗滌多次，去掉漂浮在上清里的細(xì)胞，然后每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在6孔板板蓋上用記號(hào)筆垂直于劃痕畫4～5道線，拍照時(shí)光斑落在交叉區(qū)域，利于不同時(shí)間點(diǎn)拍照時(shí)在同一個(gè)地方進(jìn)行觀察。培養(yǎng)板放回37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

五、Transwell實(shí)驗(yàn)

在接種細(xì)胞前，向小室中加入600 μL PBS，室溫下放置30 min充分浸潤小室；吸出PBS后，在安全柜中自然晾干，約30 min；用胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度到2×106/mL；加入0.1 mL細(xì)胞懸液于小室中，同時(shí)加入0.65 mL完全培養(yǎng)基于下層孔板中；用鑷子將小室仔細(xì)放到加有培養(yǎng)基的孔板中（應(yīng)避免底部產(chǎn)生氣泡），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每天觀察遷移情況，一般在48～72 h時(shí)，停止培養(yǎng)；取出小室，去除被子中的上清，用濕潤的棉簽仔細(xì)擦掉小室上層的細(xì)胞；室溫，PBS稍洗滌。吸取0.5 mL Regent A（洗滌液）于24孔板中，放入小室輕輕搖晃孔板，潤洗小室，棄洗液。吸取0.5 mL Regent B（染色液）于另一個(gè)孔中，放入小室進(jìn)行染色，室溫放置20 min。取0.5 mL Regent A于步驟1的洗滌孔中，將小室放回洗滌孔中洗滌，重復(fù)6次，直到regent A無色時(shí)，然后顯微鏡下拍照。

六、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析或配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用方差分析。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、qPCR檢測(cè)兩株細(xì)胞株中ABCB1、MMP2、CDH1和CD44基因的表達(dá)水平

ABCB1在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)量非常低。MMP2在BGC-823細(xì)胞中表達(dá)量非常低。CD44在兩株胃癌細(xì)胞株中表達(dá)較高。CDH1在兩株胃癌細(xì)胞株中表達(dá)較高。兩株胃癌細(xì)胞株中4個(gè)多藥耐藥相關(guān)基因表達(dá)的柱狀圖比較如圖1A和1B所示。ABCB1在BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)量較低。MMP2基因在BGC-823細(xì)胞中表達(dá)量較低，在SGC-7901中表達(dá)量中等。CDH1、CD44在BGC-823和SGC-7901中均有較高的表達(dá)。

圖1 ABCB1、MMP2、CDH1和CD44基因在BGC-823和SGC-7901中的表達(dá)

二、細(xì)胞劃痕結(jié)果

細(xì)胞劃痕后0～30 h內(nèi)每5 h觀測(cè)一次劃痕的距離并拍照記錄。相同時(shí)間內(nèi)，BGC-823細(xì)胞的移動(dòng)距離較遠(yuǎn)，遷移能力強(qiáng)，SGC-7901的遷移能力較弱，其劃痕結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表2所示。

表2 細(xì)胞劃痕結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析（μm）

三、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在24孔板加入0.5 mL的Regent C（裂解液），放入小室輕輕搖晃孔板，37℃孵育5 min，使小室下層粘附的細(xì)胞都裂解于Regent C中，呈藍(lán)紫色澄清溶液，去掉小室，吸取孔板中的溶液100 μL到一個(gè)清潔的96孔板中。用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的吸光值，然后計(jì)算細(xì)胞遷移。SGC-7901的細(xì)胞遷移能力要弱于BGC-823。見表3。

表3 OD值檢測(cè)遷移值結(jié)果統(tǒng)計(jì)

討論

化療在胃癌的治療中占有非常重要的低位，尤其是對(duì)于不可切除或有轉(zhuǎn)移的病例。但大部分患者會(huì)在化療開始時(shí)及表現(xiàn)為耐藥或經(jīng)過初始的治療反應(yīng)后變得耐藥[5]。多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時(shí)，對(duì)其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物亦產(chǎn)生交叉抗藥性[6-7]。多藥耐藥分為兩種：一種是首次使用化療藥物就產(chǎn)生耐藥，稱為原發(fā)性耐藥（primary resistance）或天然性耐藥（initial resistance）[8-9]；另一種則是在化療過程中產(chǎn)生耐藥，稱為繼發(fā)性耐藥（secondary resistance）或稱獲得性耐藥（acquired resistance）[7,10]。

多藥耐藥的機(jī)制包括：由P-gp或其他MRP家族成員的膜蛋白把藥物泵出細(xì)胞外，藥物作用靶點(diǎn)的性質(zhì)改變，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）對(duì)化療藥物的解毒作用增強(qiáng)，化療藥物在人體內(nèi)未能有效激活，細(xì)胞對(duì)藥物的代謝增強(qiáng)使其變成低毒的小分子，細(xì)胞修復(fù)功能增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡受影響等[11]。侵襲轉(zhuǎn)移是另一個(gè)導(dǎo)致胃癌患者死亡的原因。隨著時(shí)間的推移，大約50%的患者終會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。胃癌細(xì)胞侵犯基底膜和漿膜，越過細(xì)胞間隙及細(xì)胞外基質(zhì)，是形成轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。目前公認(rèn)的癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制是有Liotta提出的三步理論[12]細(xì)胞表面的受體與細(xì)胞外基質(zhì)粘附，分泌水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)開辟道路，癌細(xì)胞移動(dòng)到被降解的基質(zhì)區(qū)域。就這樣不斷地粘附-降解-移動(dòng)，最終導(dǎo)致局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在這一過程中，細(xì)胞粘附分子的相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白酶、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)到系統(tǒng)均起到非常重要的作用，并構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。

在本實(shí)驗(yàn)中，BGC-823中MMP2基因表達(dá)較低，而MDR1、CD44、E-cadherin的表達(dá)均較SGC-7901高。在癌細(xì)胞的遷徙功能檢測(cè)中，BGC-823的遷徙能力較強(qiáng)。因此，我們推測(cè)在本研究中對(duì)漢族起作用的基因不是MMP2，因?yàn)镸MP2的高表達(dá)可導(dǎo)致癌細(xì)胞遷徙能力增強(qiáng)，BGC-823細(xì)胞中MMP2較低表達(dá)與其遷徙能力較強(qiáng)不一致。另外，BGC-823細(xì)胞株來自于胃癌原發(fā)組織，而SGC-7901來自于胃癌的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)，轉(zhuǎn)移性病灶較原發(fā)灶有更強(qiáng)的耐藥性和侵襲能力，因此實(shí)驗(yàn)前我們推測(cè)SGC-7901的遷徙能力可能會(huì)較BGC-823強(qiáng)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確顯示BGC-823的遷徙能力強(qiáng)。這項(xiàng)結(jié)果與之前的推測(cè)不一致，可能是由于這兩株胃癌細(xì)胞不是來自同一患者，即不是同一親代細(xì)胞來源的克隆，基因表達(dá)譜不同，而BGC-823來源的標(biāo)本術(shù)后病理為低分化腺癌，惡性程度較高，可解釋上述不一致。

本實(shí)驗(yàn)中，兩株胃癌細(xì)胞的MDR1基因表達(dá)均較低，考慮原因?yàn)閮芍晡赴┘?xì)胞均為術(shù)后標(biāo)本直接取材培養(yǎng)，未經(jīng)化療藥物的誘導(dǎo)，故MDR1低表達(dá)。所以，在本實(shí)驗(yàn)中期主要作用的基因?yàn)镃D44、E-cadherin。而CD44、E-cadherin的作用相反，CD44介導(dǎo)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，E-cadherin則使腫瘤組織趨于穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)中CD44、E-cadherin在BGC-823中表達(dá)較高，故CD44在促進(jìn)BGC-823的遷徙中起著關(guān)鍵作用。

1Xu CY,Guo JL,Jiang ZN,et al.Prognostic role of estrogen receptor α and estrogen receptor β in gastric cancer.Ann Susg Oncol,2010, 17(9):2503-2509.

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3Sharma G,Mirza S,Parshad R,et al.CpG hypomethylation of MDR1 gene in tumor and serum of invasive ductal breast carcinoma patients.Clin Biochem,2010,43(4-5):373-379.

4Yuan G,Regel I,Lian F,et al.WNT6 is a novel target gene of caveolin-1 promoting chemoresistance to epirubicin in human gastric cancer cells.Oncogene,2012,32(3):375-387.

5Kim HK,Choi IJ,Kim CG,et al.A gene expression signature of acquired chemoresistance to cisplatin and fluorouracil combination chemotherapy in gastric cancer patients.PLoS One,2011,6(2): e16694.

6Song W,Jiang R,Zhao CM.Role of integrin-linked kinase in multi-drug resistance of human gastric carcinoma SGC7901/DDP cells. Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(11):5619-5625.

7Qi J,McTigue MA,Rogers A,et al.Multiple mutations and bypass mechanisms can contribute to development of acquired resistance to MET inhibitors.Cancer Res,2011,71(3):1081-1091.

8Miranda C,Nucifora M,Molinari F,et al.KRAS and BRAF mutations predict primary resistance to imatinib in gastrointestinal stromal tumors.Clin Cancer Res,2012,18(6):1769-1776.

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10 Roukos DH.Targeting gastric cancer with trastuzumab:new clinical practice and innovative developments to overcome resistance.Ann Surg Oncol,2010,17(1):14-17.

11 Geng M,Wang L,Chen X,et al.The association between chemosensitivity and Pgp,GST-π and Topo II expression in gastric cancer.Diagn Pathol,2013,8:198.

12 Liotta LA,Kleinerman J,Catanzaro P,et al.Degradation of basement membrane by murine tumor cells.J Natl Cancer Inst,1977,58 (5):1427-1431.

（本文編輯：南清振）

醫(yī)學(xué)論文中有關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用的要求

應(yīng)告知研究設(shè)計(jì)的名稱和主要方法。如調(diào)查設(shè)計(jì)分為前瞻性、回顧性還是橫斷面調(diào)查研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)告知具體的設(shè)計(jì)類型，臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)告知屬于第幾期臨床試驗(yàn)，采用了何種盲法措施等；主要做法應(yīng)圍繞重復(fù)、隨機(jī)、對(duì)照、均衡概要說明，尤其要告知如何控制重要非試驗(yàn)因素的干擾和影響。應(yīng)注明所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法，在P值前標(biāo)注統(tǒng)計(jì)量，如t值、F值、χ2值等。統(tǒng)計(jì)學(xué)符號(hào)按GB 3358-82《統(tǒng)計(jì)學(xué)名詞及符號(hào)》的有關(guān)規(guī)定書寫，一律用斜體。

醫(yī)學(xué)論文中有關(guān)數(shù)字使用的要求

執(zhí)行GB/T 15835-1995《關(guān)于出版物上數(shù)字用法的規(guī)定》。公歷世紀(jì)、年、月、日、時(shí)刻和計(jì)數(shù)、計(jì)量均用阿拉伯?dāng)?shù)字。小數(shù)點(diǎn)前或后超過3位數(shù)字時(shí)，每3位數(shù)字1組，組間空1/4個(gè)漢字空，對(duì)于恰好為小數(shù)點(diǎn)前后四位數(shù)的數(shù)字，可以不分節(jié)。序數(shù)詞和年份、頁數(shù)、部隊(duì)番號(hào)、儀表型號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)不分節(jié)。百分?jǐn)?shù)的范圍和偏差及附帶尺寸單位的數(shù)值相乘，應(yīng)寫成5%～95%、（50.2± 0．6）%及4 cm×3 cm×5cm。

The expression of multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability of gastric cancer cell

LI Zhi-hai.Department of Gastroenterology,Xiangyang People′s Hospital;441001

Objective To investigate the relationship between the expression of multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability of gastric cancer cell.Methods mRNA of multidrug resistance related genes(including ABCB1,MMP2,CDH1,CD44)in gastric cell lines BGC-823 and SGC-7901 were validated by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)technique.Invasion/metastasis ability was assessed by cell scratch test and transwell migrating test.Then,the relationship between the expression of multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability was explored.Results FQ-PCR test revealed that the expression level of ABCB1,CDH1,and CD44 was higher in cell line BGC-823,while the expression level of MMP2 was higher in cell line SGC-7901.Cell scratch test and transwell migrating test revealed cell line BGC-823 had more powerful migrating ability.Conclusion Multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability of gastric cancer cell were relevant.High expression of CD44 may play an important role in invasion/metastasis.

Multidrug resistance;Invasion/metastasis;ABCB1;MMP2;CDH1;CD44

2014-07-07）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.04.003

441001襄陽市襄州區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科