蓽茇寧對小鼠酒精性脂肪肝的預(yù)防作用

昭日格圖，白朝魯門，博格日勒圖，娜日蘇，領(lǐng) 小

（內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

蓽茇寧對小鼠酒精性脂肪肝的預(yù)防作用

昭日格圖，白朝魯門，博格日勒圖，娜日蘇，領(lǐng) 小

（內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

目的：探討蓽茇成分蓽茇寧（piperlonguminine，GBN）對小鼠酒精性脂肪肝肝損傷的預(yù)防作用。方法：將成年雄性昆明小鼠隨機(jī)分為空白對照組、酒精性脂肪肝模型組以及GBN（低、高）劑量組?？瞻讓φ战M以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余各組以高脂飼料喂養(yǎng)并每天用白酒按0.8 mL/30 g灌胃；GBN低劑量（10 mg/（kg?d））和高劑量組（40 mg/（kg?d））組分別按設(shè)計(jì)的藥物和劑量給予小鼠灌胃，給藥體積為0.8 mL/30 g體質(zhì)量，空白對照組、模型組給予相同體積的水灌胃，連續(xù)給藥6 周。于實(shí)驗(yàn)第6周末，測定各組小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活力、總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）含量，并做肝臟病理學(xué)檢查。結(jié)果：GBN低、高劑量組肝臟指數(shù)分別為（4.42±0.50）%、（4.53±0.44）%，與模型組比較均顯著降低；血清ALT與AST活力極顯著降低（P＜0.01）；血清TC與TG含量極顯著降低（P＜0.01）；同時(shí)病理組織學(xué)顯示GBN能明顯改善酒精性脂肪肝小鼠的肝細(xì)胞脂肪變性。結(jié)論：GBN夠有效預(yù)防酒精性脂肪肝的發(fā)生或發(fā)展。

蓽茇寧；酒精性脂肪肝；血脂；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；肝臟組織切片

臨床上依據(jù)飲酒與否，可將脂肪肝分為酒精性脂肪肝病（alcoholic fatty liver disease，AFLD）和非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）。人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)病率急劇上升，我國部分地區(qū)人脂肪肝病的發(fā)病率已高達(dá)20%，而這其中纖維化的比例高達(dá)25%，約1.5%～8.0%的患者可發(fā)展為肝硬化，因此脂肪肝病已成為較嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題[1]。單純性酒精引起脂肪肝的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，脂肪代謝異常、脂質(zhì)過氧化損傷以及氧化應(yīng)激等因素可能起一定的作用[2-3]。目前國內(nèi)市場上在治療酒精性脂肪肝方面還沒有療效十分顯著的創(chuàng)新藥，不過最近報(bào)道3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑辛伐他丁可顯著改善酒精性脂肪肝患者的肝功能[4]。

蓽茇為一種藥食兩用植物，喜高溫潮濕氣候，主產(chǎn)于中國云南省。博日吉汗·格日勒圖等[5-9]曾報(bào)道蓽茇成分蓽茇寧（piperlonguminine，GBN）具有降血脂作用。本實(shí)驗(yàn)探討和研究了GBN對酒精性脂肪肝的預(yù)防作用。用小鼠酒精性脂肪肝動物模型進(jìn)行GBN的體內(nèi)保肝實(shí)驗(yàn)，探討GBN是否具有保肝生物活性，為GBN防治酒精性脂肪肝提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成年雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，許可證號：SCXK（京）2006-2009，級別SPF/AF，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

蓽茇寧（GBN）由內(nèi)蒙古大學(xué)蒙藥化學(xué)研究所制備，純度＞98%，上述藥物臨用前用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液制成相應(yīng)濃度的混懸液。

草原白酒（酒精度52%） 內(nèi)蒙古太仆寺旗草原釀酒有限責(zé)任公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司。

高脂飼料配方（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：膽固醇3%、豬油10%、膽酸鈉0.5%、基礎(chǔ)飼料86.5%（配方：面粉20%、米粉10%、玉米20%、麩皮25%、豆料20%、骨粉2%、魚粉2%、食鹽0.9%、維生素0.1%）。

1.2 儀器與設(shè)備

5) 多系統(tǒng)聯(lián)動。系統(tǒng)生成的報(bào)警信息，操作人員可以派單至巡檢系統(tǒng)，同時(shí)將巡檢情況回傳至診斷系統(tǒng)，真正實(shí)現(xiàn)閉環(huán)管理。

電子天平 梅特勒-托利多公司；奔騰加強(qiáng)型全自動生化分析儀 意大利奔騰公司；TDL-5-A離心機(jī)上海創(chuàng)萌生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥方法

成年雄性昆明小鼠40 只，體質(zhì)量（20±2）g，實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下（室溫20～24 ℃，相對濕度50%～60%，自由飲水）飼喂3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成4 組，每組10 只，分別為空白對照組、酒精性脂肪肝模型組、GBN低劑量組和GBN高劑量組?？瞻讓φ战M基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余各組以高脂飼料喂養(yǎng)，并每天用白酒（將酒精度52%白酒稀釋為30%）灌胃（0.8 mL/30 g）；GBN低劑量組（10 mg/kg）和GBN高劑量組（40 mg/kg）分別按設(shè)計(jì)的藥物和劑量給予小鼠灌胃，給藥體積為0.8 mL/30 g體質(zhì)量，空白對照組、模型組給予相同體積的水灌胃，連續(xù)給藥6 周。

1.3.2 標(biāo)本的采集和處理

第6周周末最后一次灌胃后，禁食12 h，稱體質(zhì)量。斷頭取血，解剖取肝臟稱質(zhì)量。計(jì)算其肝臟指數(shù)。采集的血液放置于4 ℃冰箱冷藏過夜，低溫離心機(jī)3 500 r/min離心10 min，取上層血清于－70 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。肝臟在稱質(zhì)量后立即放入體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液固定24 h保存，數(shù)周后用石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）法染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.3.3 生化指標(biāo)的測定

血清ALT、AST、TC、TG水平，嚴(yán)格按照中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GBN對脂肪肝小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量以及肝臟指數(shù)的影響

表1 GBN對酒精性脂肪肝小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響（x±s，n=10）Table 1 Effects of GBN on the body weight and liver index (x ±s,n=10)

由表1可知，實(shí)驗(yàn)始末各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。然而與空白對照組比較，模型組長期飲酒（30%，0.8 mL/30 g）會導(dǎo)致肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)極顯著增長（P＜0.01），因?yàn)榫凭灾靖蔚奶卣髦皇歉文[大[10-12]，與模型組相比較，GBN高、低劑量組能極顯著降低肝臟質(zhì)量（P＜0.01）和顯著降低肝臟指數(shù)（P＜0.05），說明GBN高、低劑量組均能改善肝腫大。

2.2 GBN對酒精性脂肪肝小鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性的影響

小鼠肝臟HE染色后顯微鏡下病理切片照片顯示，空白對照組（圖1A）小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝內(nèi)無脂肪變性、沒有炎癥和壞死的細(xì)胞，肝細(xì)胞索排列整齊，肉眼觀察肝臟呈鮮紅色，表明肝內(nèi)沒有明顯的脂肪堆積。酒精性脂肪肝模型組（圖1B）肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞普遍明顯腫大，具有嚴(yán)重脂肪變性現(xiàn)象，核增大，肝細(xì)胞索排列無規(guī)律，肉眼觀察肝臟顏色呈淡紅色，表明肝內(nèi)明顯積聚了脂肪。GBN低劑量組（圖1C）肝細(xì)胞普遍中度脂肪變性。GBN高劑量組（圖1D）肝細(xì)胞普遍輕度脂肪變性。結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組的肝細(xì)胞脂肪變性明顯；與模型組相比，各給藥組的肝細(xì)胞脂肪變性明顯減輕，說明GBN對酒精性脂肪肝具有一定的防治作用。

圖1 各組小鼠肝臟HE染色后顯微鏡下病理切片照片（HE，×400）Fig.1 Pathology slice images of mouse liver in each group under the microscope after HE staining (HE, × 400)

2.3 GBN對酒精性脂肪肝小鼠血清ALT、AST活力的影響

表2 GBN對酒精性脂肪肝小鼠血清ALT、AST活力的影響（x±s，n=10）Table 2 Effects of GBN on serum levels of ALT and AST (x±s，n=10)

由 表2可知，空白對照組血清A L T活力為（42.39±11.94）U/L；AST活力為（186±57）U/L，模型組血清ALT活力為（413.78±145.80）U/L；AST活力為（2 977±770）U/L，表明酒精灌胃法已對小鼠肝臟造成損傷，肝細(xì)胞可能發(fā)生炎癥、壞死。酒精性脂肪肝模型制備成功。

本動物模型實(shí)驗(yàn)中，GBN樣品可以顯著降低轉(zhuǎn)氨酶（ALT、AST）。表2中顯示GBN高、低劑量組血清ALT活力為（76.17±67.78）、（117.62±96.12）U/L以及血清AST活力為（280±156）、（208±94）U/L。與模型組相比較，GBN（低、高）劑量組均能極顯著降低血清ALT、AST活力（P＜0.01），表明GBN對酒精造成的肝損傷具有一定的預(yù)防作用。

2.4 GBN對酒精性脂肪肝小鼠血清TC、TG水平的影響

由表3可知，模型組 TG、TC含量比較空白對照組明顯升高，有極顯著性差異（P＜0.01）；給予GBN后，實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的TC和TG含量比模型組明顯降低，有極顯著性差異（P＜0.01）。由此可知GBN具有抑制TC生成、促進(jìn)TG氧化分解的作用，從而影響脂質(zhì)分布、運(yùn)轉(zhuǎn)與清除。

表3 GBN對酒精性脂肪肝小鼠血清TC、TG含量的影響（x±s， n=10）Table 3 Effects of GBN on serum levels of TC and TG (x±s , n=10

3 討 論

3.1 蓽茇寧對酒精性脂肪肝模型小鼠血脂的影響

甘油三酯是體內(nèi)能量的重要來源，也是人體內(nèi)含量最多的脂類，其合成的主要場所在肝臟。當(dāng)肝臟功能受損時(shí)，可能會阻礙肝臟合成甘油三酯、磷脂或載脂蛋白，致使甘油三酯無法轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟。如此，機(jī)體脂類代謝紊亂、過氧化損傷、肝細(xì)胞甘油三酯蓄積，致使肝細(xì)胞脂肪變性及脂肪肝形成[13-14]。本課題組首次發(fā)現(xiàn)蓽茇寧具有降血脂作用，并獲得發(fā)明專利一項(xiàng)[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組TG、TC含量比空白對照組明顯升高，差異極顯著（P＜0.01）；給予GBN后，實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的TC和TG含量比高脂模型對照組明顯降低，差異極顯著（P＜0.01）。由此可知GBN具有抑制TC生成、促進(jìn)TG氧化分解的作用，從而影響脂質(zhì)分布、運(yùn)轉(zhuǎn)與清除。

3.2 蓽茇寧對酒精性脂肪肝模型小鼠血清ALT、AST活力的影響

乙醇代謝過程中產(chǎn)生的活性氧可損害細(xì)胞膜以及線粒體膜，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，使肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)氨酶滲透至血液中，造成血液中ALT和AST活力的升高[16-17]。在生物體內(nèi)，AST和ALT是反映肝細(xì)胞損害的常用酶學(xué)檢查指標(biāo)，是肝細(xì)胞損害的敏感標(biāo)志[18]。本實(shí)驗(yàn)中，GBN樣品各組可以顯著降低血清中轉(zhuǎn)氨酶（ALT、AST）。GBN高、低劑量組與模型組相比較血清ALT、AST指標(biāo)，GBN（低、高）劑量組均能極顯著降低血清ALT、AST活力（P＜0.01），表明GBN對酒精造成的肝損傷具有一定的預(yù)防作用。

3.3 蓽茇寧對酒精性脂肪肝模型小鼠肝臟組織

肝臟在脂類的吸收、運(yùn)輸、合成、貯存、分解等過程中均起到重要的作用。長期攝入乙醇及高脂食物會導(dǎo)致肝臟脂肪代謝紊亂[19-21]。本實(shí)驗(yàn)中空白對照組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝內(nèi)無脂肪變性、沒有炎癥和壞死的細(xì)胞，肝細(xì)胞索排列整齊，肉眼觀察肝臟呈鮮紅色，表明肝內(nèi)沒有明顯的脂肪堆積。酒精性脂肪肝模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)欠清晰，肝細(xì)胞普遍明顯腫大，具有嚴(yán)重脂肪變性，核增大，肝細(xì)胞索排列無規(guī)律，肉眼觀察肝臟顏色呈淡紅色，表明肝內(nèi)明顯積聚了脂肪。GBN低劑量組肝細(xì)胞普遍中度脂肪變性。GBN高劑量組肝細(xì)胞普遍輕度脂肪變性。結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組的肝細(xì)胞脂肪變性明顯；與模型組相比，各給藥組的肝細(xì)胞脂肪變性明顯減輕，說明GBN對酒精性脂肪肝具有一定的防治作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)條件下，GBN可通過降低酒精性脂肪肝小鼠血脂水平，調(diào)節(jié)肝功能指標(biāo)，從而有效的預(yù)防了酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展。該病是一種可預(yù)防的疾病，具有可逆性，但由于人體長期飲酒對酒精易產(chǎn)生依賴性，所以患者能否做到酒精戒斷是影響該病治療效果的重要條件，只有在戒酒的基礎(chǔ)上配合以藥物治療才能取得好的療效，這就需要全社會對飲酒的危害性給予關(guān)注并進(jìn)行廣泛深入的宣傳。

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Preventive Effects of Piperlonguminine on Alcoholic Fatty Liver Disease in Mice

ZHAO Ri-ge-tu, BAI Chao-lu-men, BO Ge-ri-le-tu, NA Ri-su, LING Xiao
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

This study aimed to investigate the preventive and therapeutic effects of piperlonguminine (GBN) on alcoholic fatty liver disease (AFLD) in mice. Adult male Kunming mice were randomly divided into four groups: normal control, model, GBN low dose and high dose groups. The mice in normal control group were fed with a normal diet, and those in the other groups were fed with high-fat diet, and, at the same time, administered with alcohol daily at a level of 0.8 mL/30 g bw. The mice in GBN low and high dose groups were intragastrically administered with 0.8 mL/30 g bw of GBN at doses of 10 and 40 mg/(kg·d), respectively, and the normal control and model groups were given equal volume of distilled water, continuously for 6 weeks. After 12 h of fasting following the last administration, all the mice were sacrificed for the measurement of liver index, aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) levels in serum and the pathological histological observation of liver tissue. Compared with the model group, the low and high dose groups significantly decreased liver index to (4.42 ± 0.50)% and (4.53 ± 0.44)%, respectively. Also, the levels of AST, ALT, TC and TG in serum were significantly decreased (P ＜ 0.01). And pathological histology showed that GBN obviously improved hepatocyte fatty degeneration of alcoholic fatty liver in mice. In conclusion, GBN can effectively prevent the occurrence and development of alcoholic fatty liver.

piperlonguminine; alcoholic fatty liver disease; blood fat; alanine transaminase; aspartate transaminase; liver tissue slices

R151.3

A

1002-6630（2014）13-0232-04

10.7506/spkx1002-6630-201413045

2014-04-02

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2009ZX09103-103）

昭日格圖（1969—），男，助理研究員，博士，主要從事保健品、食品研究。E-mail：zhrgt@163.com