山楂對(duì)果蠅抗氧化相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的影響

申婷婷，馬 娜,2，黃 杰,2，花爾并，薛文琛，王 浩*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

山楂對(duì)果蠅抗氧化相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的影響

申婷婷1，馬 娜1,2，黃 杰1,2，花爾并1，薛文琛1，王 浩2,*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

以果蠅為動(dòng)物模型，研究給予不同劑量山楂提取物（0、0.8、4 mg/mL）對(duì)果蠅壽命、抗氧化酶活力及抗氧化相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：添加山楂提取物可以延長(zhǎng)果蠅壽命；體內(nèi)抗氧化 酶活力測(cè)定結(jié)果顯示，添加0.8 mg/mL山楂提取物可以顯著升高銅鋅超氧化物歧化酶（CuZn-superoxide dismutase，CuZn-SOD）酶活力（P＜0.05），給予4 mg/mL山楂提取物可以極顯著升高CuZn-SOD酶活力（P＜0.01）和顯著升高過氧化氫酶（catalase，CAT）酶活力（P＜0.05），且降低丙二醛（malondialdehy de，MDA）水平。實(shí)時(shí)定量PCR（real timepolymerase chain reaction，real time-PCR），結(jié)果顯示，給予4 mg/mL山楂提取物顯著上調(diào)CuZn-SOD、CAT mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；給予0.8 mg/mL山楂提取物磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGSH-Px） mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），4 mg/mL組表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01）。綜上，山楂在機(jī)體內(nèi)抗氧化活性可能是通過上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶來實(shí)現(xiàn)的。

果蠅；山楂提取物；壽命；酶活力；基因表達(dá)

山楂是一種傳統(tǒng)的藥食同源植物，富含黃酮類、花青素、熊果酸、皂苷和胡蘿卜素等多種活性成分[1]。毒理學(xué)研究證明長(zhǎng)期食用山楂有益身體健康，且?guī)缀鯚o副作用[2]。藥理學(xué)研究亦顯示，山楂活性成分具有增加血液抗氧化活性及降低低密度脂蛋白膽固醇的作用[3-5]。

果蠅作為比較成熟的抗衰老模式動(dòng)物，與人類衰老基因高度相似[6-7]。本實(shí)驗(yàn)以果蠅為動(dòng)物模型，研究山楂提取物對(duì)果蠅壽命、果蠅體內(nèi)抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性和氧化產(chǎn)物丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的影響。并從分子水平研究山楂對(duì)抗氧化相關(guān)調(diào)控基因SOD、CAT、磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGSH-Px）及Regulatory particle non-ATPase 11（Rpn11）mRNA表達(dá)水平的影響，為山楂提取物在食品中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂果提取物購(gòu)自尖峰天然產(chǎn)物公司。具體提取工藝為山楂鮮果洗凈、切片、去核，冷凍干燥，80%乙醇提取，經(jīng)乙酸乙酯萃取，樹脂（AB-8）純化后凍干成粉。

超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Green 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20 高效液相色譜儀 日本島津公司；冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；My Cycler反轉(zhuǎn)錄PCR、MyiQ2實(shí)時(shí)定量PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜分析山楂提取物活性成分

色譜條件[8]：色譜柱：H y p e r s i l O D S-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：5%乙腈（25 μmol/L NaH2PO4），流動(dòng)相B：25%乙腈（25 mmol/L NaH2PO4）；梯度洗脫：0 min 10% B、20 min 80% B、55 min 80% B、60 min 10% B；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm和360 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2 果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

收集2 d齡的果蠅成蟲，取雄性果 蠅600 只，隨機(jī)分為3 組（對(duì)照組（0 mg/mL），不同劑量山楂提取物組：0.8 mg/mL和4 mg/mL），每組10 管，每管20 只，在25 ℃、相對(duì)濕度50%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，每3 d更換新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行壽命統(tǒng)計(jì)，直至果蠅全部死亡，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)。果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]為：酵母10 g、蒸餾水750 mL、瓊脂6 g、葡萄糖72 g、玉米面72 g、防腐劑40 mL（1 g/100 mL對(duì)羥基苯甲酸乙酯）；山楂實(shí)驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.8 mg/mL和4 mg/mL山楂果提取物。

1.3.3 果蠅抗氧化酶活力測(cè)定

收集2 d齡雄性果蠅成蟲600 只，隨機(jī)分為3 組（對(duì)照組，0.8 mg/mL、4 mg/mL山楂果提物組）每組10 管，每管20 只。飼養(yǎng)30 d后，CO2麻醉后－80 ℃?zhèn)溆?。取果蠅，?∶49（m/V）加生理鹽水，冰上勻漿，4 ℃、2 500 r/min 離心20 min，取上清測(cè)酶活力。

1.3.4 Real time-PCR分析抗氧化基因mRNA表達(dá)

取－80 ℃保存的果蠅，每組5管每管20 只，Trizol法提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，－80 ℃?zhèn)溆?。Real time-PCR法檢測(cè)抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。基因引物信息具體見表1。

表1 果蠅抗氧化基因?qū)崟r(shí)定量PCR引物Table 1 Real-time PCR primers used to determine mRNA expression of Drosophila melanogaster antioxidant genes

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂中活性成分分析

圖1 山楂提取物HPLC分析結(jié)果Fig.1 HPLC analysis of hawthorn fruit ext ract

由圖1液相色譜分析顯示山楂提取物中含有原花青素B219.86%，表兒茶素15.27%，綠原酸3.10%，金絲桃苷2.91%，異槲皮素1.34%。

2.2 山楂提取物對(duì)果蠅壽命的影響

圖2 不同劑量山楂果提取物對(duì)果蠅壽命的影響Fig.2 Effect of consumption of hawthorn fruit extract at various doses on Drosophila melanogaster life span

氧化應(yīng)激導(dǎo)致?lián)p傷是衰老的重要原因之一。果蠅壽命是評(píng)價(jià)抗氧化 和抗衰老效果的重要指標(biāo)，由圖2可知，山楂提取物可以延長(zhǎng)果蠅壽命，且效果與山楂果提取物添加量呈正相關(guān)。

2.3 山楂提取物對(duì)果蠅體內(nèi)Mn-SOD、CuZn-SOD、CAT酶活性及氧化產(chǎn)物MDA含量的影響

圖3 山楂提取物對(duì)果蠅體內(nèi)CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT酶活性和MDA生成量的影響Fig.3 Effect of hawthorn fruit extract on CuZn-SOD, Mn-SOD and CAT activities, and MDA level in Drosophila melanogaster

由圖3可知，給予果蠅山楂提取物30 d后，0.8 mg/mL組果蠅體內(nèi)CuZn-SOD酶活性顯著升高（P＜0.05），4 mg/mL組CuZn-SOD酶活力極顯著升高（P＜0.01）；添加山楂提取物對(duì)果蠅體內(nèi)Mn-SOD酶活性無顯著影響（P＞0.05）。4 mg/mL山楂提取物可以顯著升高果蠅體內(nèi)CAT酶活性（P＜0.05）。果蠅體內(nèi)MDA水平隨山楂提取物添加量增加呈逐漸降低的趨勢(shì)。

2.4 Real time-PCR檢測(cè)抗氧化基因CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT、PHGSH-Px、Rpn11 mRNA表達(dá)水平

圖4 山楂提取物對(duì)果蠅體內(nèi)抗氧化基因CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT、PHGSH-Px、Rpn11 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of hawthorn fruit extract on mRNA expression of CuZn-SOD, Mn-SOD, CAT, PHGSH-Px and Rpn11 in Drosophila melanogaster

由圖4可知，果蠅在攝食山楂果提取物后，與對(duì)照組相比4 mg/mL組CuZn-SOD、CAT mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；山楂提取物對(duì)Mn-SOD基因mRNA表達(dá)水平無顯著影響（P＞0.05）。Rpn11過表達(dá)可以抑制與衰老相關(guān)的26S蛋白酶體活性，從而延長(zhǎng)果蠅壽命[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Rpn11表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，這與Cheng Peng等[10]報(bào)道的藍(lán)莓提取物延長(zhǎng)果蠅壽命結(jié)果中Rpn11表達(dá)水平上調(diào)一致。PHGSH-Px可抑制膜磷脂過氧化，給予0.8 mg/mL山楂果提取物，果蠅體內(nèi)磷脂谷胱甘肽過氧化物酶mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），4 mg/mL組表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01）。

3 討 論

衰老自由基理論認(rèn)為，在有氧環(huán)境中生存的生物產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）是不可避免的，機(jī)體存在自由基清除體系。在生物體內(nèi)，抗氧化物質(zhì)及內(nèi)源性抗氧化酶可以清除體內(nèi)自由基維持內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡，其中SOD能催化O2－·轉(zhuǎn)化為H2O2，CAT和GSH-Px等能將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O。但是，過多的自由基（OH－、O2－·、H2O2）超出了機(jī)體清除能力，就會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA等，最終導(dǎo)致氧化損傷[11-14]。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)后的終產(chǎn)物，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性。目前雖然氧化損傷與衰老（壽命）的關(guān)系還尚未明確，但是多數(shù)研究顯示不同物種組織中氧化物的過多積累會(huì)導(dǎo)致衰老[15-16]。

山楂作為傳統(tǒng)的藥食同源植物，富含黃酮類等天然抗氧化物。有研究表明山楂提取物能清除超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫，且無論是在體內(nèi)還是體外都具有較高的抗氧化活性[17-19]，Wang Hao等[8]研究證明山楂提取物對(duì)SAM模型鼠Cu2+介導(dǎo)LDL氧化損傷具有保護(hù)作用。

果蠅作為典型的抗氧化、抗衰老動(dòng)物模型，結(jié)果顯示給予山楂提取物能夠延長(zhǎng)果蠅壽命；酶活力測(cè)定結(jié)果顯示果蠅體內(nèi)CuZn-SOD、CAT、PHGSH-Px酶活性顯著升高，MDA含量降低，這與Shanthi等[20]報(bào)道的攝食山楂可以阻止抗氧化物如谷胱甘肽、VE水平下降，并保持肝、主動(dòng)脈和心臟抗氧化酶的活性等結(jié)果相一致。Real time-PCR結(jié)果顯示SOD、CAT、Rpn11、PHGSH-Px等抗氧化基因表達(dá)水平上調(diào)。因此，山楂提取物體內(nèi)抗氧化活性很可能是通過上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶的基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

[1] SALEHI S, LONG S R, PROTEAU P J, et al. Hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) extract exhibits atropine-sensitive activity in a cultured cardiomyocyte assay[J]. Journal of Natural Medicines, 2009, 63(1): 1-8.

[2] ZHANG Z S, CHANG Q, ZHU M, et al. Characterization of antioxidants present in hawthorn fruits[J]. Nutrition Biochemistry, 2001, 12: 144-152.

[3] ZHANG Z S, WALTER K H, HUANG Y, et al. Hawthorn fruits is hypolipidemic in rabbits fed a high cholesterol diet[J]. Nutrition, 2002, 132: 5-10.

[4] KIRAKOSYAN A, SEYMOUR E, KAUFMAN P B, et al. Antioxidant capacity of polyphenolic extracts from leaves of Crataegus laevigata and Crataegus monogyna (Hawthorn) subjected to drought and cold stress[J]. Agriculturl and Food Chemistry, 2003, 51: 3973-3976.

[5] BAHORUN T, AUMJAUD E, RAMPHUL H, et al. Phenolic constituents and antioxidant capacities of Crataegus monogyna (Hawthorn) callus extracts[J]. Molecular Nutrition, 2003, 47: 191-198.

[6] HELFAND S L, ROGINA B. Genetics of aging in the fruit fly, Drosophila melanogaster[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetic, 2003, 37: 329-348.

[7] JI L L. Antioxidant enzyme response to exercise and aging[J]. Medicine and Science in Sports and Exercise, 1993, 25(2): 225-231.

[8] WANG Hao, ZHANG Z S, ZUO Y B, et al. Hawthorn fruit increases the antioxidant capacity and reduces lipid peroxidation in senescenceaccelerated mice[J]. European Food Research Technology, 2011, 232: 743-751.

[9] TONOKI A, KURANAGA E, TOMIOKA T, et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process[J]. Molecular Cell Biology, 2009, 29: 1095-1106.

[10] CHENG Peng, ZUO Yuanyuan, CHEN Zhenyu, et al. Blueberry extract prolongs lifespan of Drosophila melanogaster[J]. Experimental Gerontology, 2012, 47: 170-178.

[11] PALACINO J J, SAGI D, GOLDBERG M S, et al. Mitochondrial dysfunction and oxidative damage in parkin-deficient mice[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279: 18614-18622.

[12] REVERTER-BRANCHAT G, CABISCOL E, TAMARIT J, et al. Oxidative damage to specifi c proteins in replicative and chronologicalaged Saccharomyces cerevisiae[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279: 31983-31989.

[13] MINOTTI G. Metals and membrane lipid damage by oxyradicals[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1988, 551: 34-44.

[14] L EE W J, OU H C, WU C M, et al. Sesamin mitigates inflammation and oxidative stress in endothelial cells exposed to oxidazed lowdensity lipoprotein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57: 11406-11417.

[15] KONO Y, FRIDOVICH I. Superoxide radical inhibits catalase[J]. Journal of Biological Chemistry, 1982, 257: 5751-5754.

[16] STADTMAN E R. Protein oxidation in aging and age-related diseases[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2001, 928: 22-38.

[17] BAHORUN T, TROTIN F, POMMERY J, et al. Antioxidant activities of Crataegus monogyna extracts[J]. Planta Medicine, 1994, 60: 323-328.

[18] BAHORUN T, GRESSIER B, TROTIN F, et al. Oxygen species scavenging activity of phenolic extracts from hawthorn fresh plant organs and pharmaceutical preparations[J]. Arzneim-Forsch, 1996, 46: 1086-1089.

[19] 李剛, 梁新紅, 葛曉紅. 山楂化學(xué)成分及其保健功能特性[J]. 江蘇調(diào)味副食品, 2009, 26(6): 25-27.

[20] SHANTHI R, PARASAKTHY K, DEEPALAKSHIMI P D, et al. Hypolipidemic activity of tincture of Crataegus in rats[J]. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 1994, 31: 143-146.

Effect of Hawthorn on the Expression of Antioxidant Defense-Related Genes in Drosophila melanogaster

SHEN Ting-ting1, MA Na1,2, HUANG Jie1,2, HUA Er-bing1, XUE Wen-chen1, WANG Hao2,*
(1. College of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Hawthorn fruits contain flavonoids, which can play roles in antioxidant capacity. The present research was focused on the effect of dietary supplementation of a hawthorn fruit extract rich in flavonoids at various doses (0, 0.8 and 4 mg/mL) on Drosophila melanogaster life span, antioxidant enzymes activities and related gene expression. The results showed that the life span of Drosophila melanogaster could be prolonged by consumption of the hawthorn fruit extract. Moreover, CuZn-SOD ac tivity was increased significantly (0.8 mg/m L, P ＜ 0.05 and 4 mg/mL, P ＜ 0.01); CAT activity was enhanced significantly at the dose of 4 mg/mL (P ＜ 0.05) while the content of MDA was decreased. Real time-PCR showed that the mRNA expression of CuZn-SOD, CAT (4 mg/mL, P ＜ 0.05), and PHGSH-Px (0.8 mg/mL, P ＜ 0.05; 4 mg/mL, P ＜ 0.01) were increased. Taken together, the hawthorn fruit extract can exert antioxidant activity in vivo via up-regulation of endogenous antioxidant enzymes.

Drosophila melanogaster; hawthorn fruit extract; lifespan; enzyme activity; gene expression

TS201.4

A

1002-6630（2014）13-0199-04

10.7506/spkx1002-6630-201413038

2013-07-01

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201322）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B05）；天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20100609）

申婷婷（1988—），女，碩士研究生，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究。E-mail：shenting890101@163.com

*通信作者：王浩（1979—），男，副教授，博士，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究。E-mail：wanghao@tust.edu.cn