酪蛋白糖巨肽對二甲肼干預(yù)的大鼠細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)變化的研究

陳慶森，王金鳳，閻亞麗，龐廣昌

（1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.北京時合生物科技有限公司，北京 100176）

酪蛋白糖巨肽對二甲肼干預(yù)的大鼠細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)變化的研究

陳慶森1，王金鳳2，閻亞麗1，龐廣昌1

（1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.北京時合生物科技有限公司，北京 100176）

目的：探討不同劑量酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）干預(yù)二甲肼處理的大鼠時，外周血和結(jié)腸組織內(nèi)細(xì)胞因子水平的變化情況，從而推斷CGMP對二甲肼處理的大鼠細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的影響。方法：60只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、CGMP低劑量組、CGMP中劑量組和CGMP高劑量組。除正常組外，對每只大鼠每周腹腔注射二甲肼，劑量為30 mg/（kg?周），同時，3 個劑量CGMP組注射二甲肼的同時每天灌胃CGMP，劑量分別為10、50、100 mg/（kg?d）。15周后，處死大鼠，取其結(jié)腸組織和血清，首先檢測結(jié)腸末端異型隱窩 灶個數(shù)，然后利用液相芯片法檢測結(jié)腸組織和血清中的細(xì)胞因子的表達(dá)水平。結(jié)果：乳源CGMP對大鼠體質(zhì)量影響沒有顯著性差異，乳源CGMP對大鼠內(nèi)毒素和活性氧簇的水平具有顯著的抑制作用，其抑制作用呈劑量依賴趨勢。乳源CGMP可顯著 抑制異型隱窩灶的形成，且異型隱窩灶個數(shù)呈劑量依賴性降低。乳源CGMP可以顯著抑制大鼠體內(nèi)Th1/Th2類細(xì)胞因子的失衡，且呈劑量依賴趨勢。結(jié)論：乳源CGMP具有改善二甲肼處理的大鼠結(jié)腸組織損傷的功能，其機(jī)制為乳源CGMP可以有效抑制二甲肼處理的大鼠體內(nèi)異型隱窩灶的形成，并呈劑量依賴性，研究顯示乳源CGMP可以下調(diào)大鼠體內(nèi)IL-4等Th2類細(xì)胞因子的異常升高，促進(jìn)IL-2等Th1類細(xì)胞因子的分泌，改善大鼠體內(nèi)處于失衡狀態(tài)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。

乳源酪蛋白糖巨肽；細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)；異型隱窩灶

乳源酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）是Delfour等[1]于1965年發(fā)現(xiàn)的一種含有唾液酸的糖肽，是牛乳中κ-酪蛋白經(jīng)凝乳酶水解后產(chǎn)生的多肽片段。乳源CGMP是κ-酪蛋白第106位氨基酸（Met）至169位（Val）共64 個殘基構(gòu)成的高度糖基化、并且有磷酸化修飾的多肽。它具有多種生物學(xué)活性，如抑制細(xì)菌和病毒的附著、抑制胃腸道分泌物、結(jié)合霍亂毒素和大腸桿菌毒素[2]、促進(jìn)雙歧桿菌增殖[3]、抑制流感病毒紅細(xì)胞凝集素[4]等。

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界上第三大腫瘤，在美國，其癌癥相關(guān)死亡率在惡性腫瘤中位居第3位。在我國，近幾年的CRC在惡性腫瘤發(fā)病和死亡構(gòu)成中分別占10.56%和7.80%，居第3位和第5位。CRC的發(fā)生在臨床上是一個漫長的過程，其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個多因素參與多階段發(fā)展的復(fù)雜過程，是多種因素長期作用的結(jié)果，其發(fā)病原因尚未完全清楚，主要包括遺傳因素和環(huán)境因素兩大類。研究[5]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的發(fā)病與免疫、炎癥的關(guān)系密切，但機(jī)制不明。

細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一大類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。T細(xì)胞主要分泌IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β及血管內(nèi)皮長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等[6-8]，具有促進(jìn)T細(xì)胞分化、成熟和增殖，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，吞噬殺傷靶細(xì)胞，清除胞內(nèi)病原體，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答作用，使機(jī)體識別和殺傷腫瘤抗原的能力，是機(jī)體免疫監(jiān)視的主要炎性因子。

依據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）主要分為兩類，Th1和Th2由共同的前體細(xì)胞Th0分化而來，Th0在IL-12作用下可分化為Th1，在IL-4作用下可分化為Th2。在抗原存在的情況下，人體內(nèi)IL-12、IFN-γ最初由巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞分泌。Th1細(xì)胞以分泌IFN-γ和IL-2為主，可以增強(qiáng)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，激發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)；Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-10等，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。正常機(jī)體Th1/Th2類細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài)。機(jī)體的抗腫瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，當(dāng)Th1/Th2平衡失調(diào)，由Th1向Th2漂移時會造成免疫抑制狀態(tài)，使腫瘤細(xì)胞能夠逃逸免疫系統(tǒng)的攻擊而繼續(xù)生長[9]。研究發(fā)現(xiàn)胃腸癌患者與對照組相比，其IL-2/IL-4比值降低，表明胃腸癌患者體內(nèi)細(xì)胞免疫為Th1向Th2漂移狀態(tài)[10]。

生物活性肽作為一種生物制劑，可以提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。目前，作為腫瘤治療的重要輔助手段——生物免疫治療法，已經(jīng)越來越受到生物研究領(lǐng)域的重視。而本實驗室多年研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白糖巨肽作為一種食源性短肽，對結(jié)腸炎和結(jié)腸癌都具有一定的改善作用[11]。

本研究進(jìn)一步明確乳源CGMP的生物學(xué)功能，在確定最佳劑量乳源CGMP能有效改善大鼠結(jié)腸損傷情況的前提下，以結(jié)直腸癌大鼠為模型，采用液相芯片法作為技術(shù)手段，進(jìn)一步探討乳源CGMP在細(xì)胞因子水平上對大鼠結(jié)腸損傷改善的情況，為乳源CGMP作為改善結(jié)直腸癌的功能性食品提供更完善的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量在80～100 g，合格證號：0017037，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）新西蘭Tatua公司；二甲肼（1,2-dimethylhydrazine，DMH） 日本東京化成株式會社；Milliplex大鼠細(xì)胞因子檢測試劑盒 美國Merck Millipore公司；內(nèi)毒素、活性氧簇檢測試劑盒 美國IBL-America公司；亞甲基藍(lán)美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及結(jié)直腸癌大鼠模型的建立

SPF級純種Wistar雄性大鼠60 只，質(zhì)量80～100 g。在動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為5 組：正常組、模型組、CGMP低劑量組、CGMP中劑量組和CGMP高劑量組，每組12 只。所有動物在整個實驗期間均飲用純凈水，定期更換墊料以保持清潔與干燥。實驗室溫度控制在（23±2）℃，空氣相對濕度為（60±10）%，室內(nèi)照明以自然采光為主，環(huán)境較安靜。

實驗第1周，除正常組外，其余各組大鼠腹腔注射DMH，劑量為30 mg/（kg?周）（注射劑量經(jīng)預(yù)實驗摸索而定）。實驗第2周始，選擇邊造模邊干預(yù)的方法進(jìn)行研究，即在給Wistar大鼠腹腔注射DMH的同時給予灌胃CGMP進(jìn)行干預(yù)。實驗組各組大鼠腹腔注射DMH的同時，CGMP低、中、高劑量組每天灌胃相應(yīng)劑量的CGMP，劑量分別為10、50、100 mg/（kg?d），正常組不作處理。實驗期間，連續(xù)灌胃至15 周，期間每周記錄大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整灌胃和注射的量，15 周后處死大鼠采集樣品。

1.2.2 樣本采集與處理

1.2.2.1 血清采集

15 周后，大鼠眼眶靜脈采血，于4 ℃、2 000 r/min冷凍離心10 min后，取上清液，置于－20 ℃冰箱凍存。

1.2.2.2 結(jié)腸組織處理

處死大鼠，解剖取結(jié)腸，置于10%中性福爾馬林固定液中進(jìn)行固定。

1.2.2.3 組織提取液制備

處死大鼠，解剖取結(jié)腸，準(zhǔn)確稱取0.1 g后，置于組織勻漿器中，加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS），研磨后得到10%的勻漿組織液，于4 ℃、5 000 r/min冷凍離心20 min后，取上清液，置于－20 ℃冰箱凍存。

1.2.3 大鼠的異型隱窩灶（aberrant crypt foci，ACF）計數(shù)

處死大鼠后，分別在盲腸、結(jié)腸交界和骨盆處剪開取出全結(jié)腸，縱向剖開后漂洗去除腸內(nèi)容物，將腸段盡可能平展于兩層濾紙之間，在10%中性甲醛中固定24 h；固定后的標(biāo)本于0.2%亞甲基藍(lán)溶液中染色，40～60 s后轉(zhuǎn)移到玻片上，40 倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)ACF個數(shù)。

1.2.4 大鼠CGMP干預(yù)后的病理分析

結(jié)腸組織石蠟切片制作，參見文獻(xiàn)[12]。

1.2.5 氧化應(yīng)激分析和內(nèi)毒素分析

按試劑盒說明書測定各組血清中活性氧簇和內(nèi)毒素的水平。

1.2.6 細(xì)胞因子的檢測

采用液相芯片法檢測CGMP干預(yù)后大鼠結(jié)腸組織及外周血中8 種細(xì)胞因子的變化，見表1。

表1 8 種細(xì)胞因子Table 1 List of cytokines tested in this study

96 孔板設(shè)置背景孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、對照孔和樣品孔，背景孔和樣品孔中加入測定緩沖液25 μL，標(biāo)準(zhǔn)品孔和對照孔中加入相應(yīng)試劑25 μL，背景孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和對照孔中加入25 μL基質(zhì)溶液，樣品孔中加入樣品25 μL。渦旋后，每孔加入25 μL混合的珠子，室溫下振蕩孵育2 h。清洗后，加入25 μL檢測抗體，室溫下振蕩孵育1 h。每孔加入25 μL鏈霉親和素-藻紅蛋白。室溫下振蕩孵育30 min，清洗后加入125 μL鞘液，振蕩30 min后讀板。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，進(jìn)行單因素方差分析，處理結(jié)果以±s表示，定義P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGMP對大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量變化的影響

表2 CGMP對大鼠體質(zhì)量變化的影響Table 2 Effect of CGMP on body weight change in rats %

由表2可知，各組大鼠體質(zhì)量均有增長趨勢，經(jīng)SPSS方差分析，每周實驗大鼠體質(zhì)量組與組之間的差異不顯著（P＞0.05），即正常組與模型組體質(zhì)量之間沒有顯著性差異，各劑量組與正常組及模型組相比體質(zhì)量之間也不具有顯著性意義。即CGMP對大鼠體質(zhì)量影響沒有顯著性差異。

2.2 CGMP對大鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響

圖1 各組大鼠結(jié)腸病理組織切片（HE，×40）Fig.1 Histological images of colon samples of rats from 5 groups (HE staining, ×40)

各組大鼠結(jié)腸組織石蠟切片經(jīng)40倍顯微鏡放大后的形態(tài)如圖1所示。正常組大鼠結(jié)直腸黏膜光滑，細(xì)胞無水腫現(xiàn)象出現(xiàn)，腺體規(guī)則，未發(fā)生病變。而模型組大鼠結(jié)直腸黏膜出現(xiàn)局灶性增厚，未發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤，細(xì)胞核增大，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，炎性細(xì)胞增生明顯，腺管擴(kuò)張，杯狀細(xì)胞增多，上皮細(xì)胞層增厚，腺窩之間間隙增寬以及不規(guī)則的腺管結(jié)構(gòu)。而3 個劑量CGMP組均有不同程度的改善，且低劑量組改善情況最好。

2.3 CGMP對大鼠內(nèi)毒素、活性氧簇水平的影響

內(nèi)毒素和活性氧簇的活力可以準(zhǔn)確反應(yīng)結(jié)腸的氧化損傷程度，本研究中CGMP對大鼠內(nèi)毒素和活性氧簇活力的影響見圖2、3。

圖2 CGMP對大鼠內(nèi)毒素水平的影響Fig.2 Effect of CGMP on endotoxin levels of rats

圖3 CGMP對大鼠活性氧簇水平的影響Fig.3 Effect of CGMP on reactive oxygen species levels of rats

由圖2、3可知，與正常組相比，模型組的內(nèi)毒素和活性氧簇水平均有顯著性升高，具有極顯著性差異（P＜0.01），而3 個劑量CGMP組的內(nèi)毒素和活性氧簇水平差異不顯著。與模型組相比，3 個CGMP劑量組的內(nèi)毒素和活性氧簇水平均有顯著性降低，具有極顯著性差異（P＜0.01），而CGMP高劑量組的內(nèi)毒素和活性氧簇水平降低效果最佳。即CGMP可以在一定程度上改善結(jié)腸的氧化損傷程度，且CGMP中劑量改善效果最佳。

2.4 CGMP對各組大鼠ACF的影響

確認(rèn)結(jié)腸樣品ACF主要依據(jù)為：腺管染色加深，面積擴(kuò)大；管腔口呈鋸齒狀、裂隙狀等多種形狀；上皮層增厚；腺管極性消失，細(xì)胞核大多表現(xiàn)為不典型增生征象[13-15]。通過制作病理切片計數(shù)異型隱窩灶，探討CGMP對二甲肼處理的大鼠異型隱窩灶的影響，各組大鼠異型隱窩灶形狀見圖4。

圖4 各組大鼠異型隱窩灶Fig.4 Aberrant crypt foci (ACF) of each group of rats

異型隱窩灶區(qū)別于正常腺窩的特征是腸腺和腸腺周圍帶大、染色加深和具有裂紋開口等。實驗結(jié)束后處死大鼠，取結(jié)腸組織，分析各組大鼠異型隱窩灶數(shù)目，結(jié)果如圖4所示，正常組大鼠結(jié)腸組織未見ACF的出現(xiàn)，模型組和各劑量CGMP組大鼠結(jié)腸組織均有ACF出現(xiàn)。分析ACF數(shù)目，結(jié)果如圖5所示。

圖5 各組大鼠異形隱窩灶個數(shù)變化Fig.5 Changes in ACF number in each group of rats

由圖5可知，正常組沒有異型隱窩灶的形成，與正常組相比，模型組的異形隱窩灶的個數(shù)極顯著高于正常組（P＜0.01），各劑量組均發(fā)現(xiàn)了二甲肼誘導(dǎo)的異型隱窩灶的形成，與正常組相比，各劑量組異型隱窩灶個數(shù)具有顯著性差異，與模型組相比，灌胃CGMP顯著抑制了異型隱窩灶的形成（P＜0.05），即CGMP能在一定程度抑制二甲肼處理的大鼠異型隱窩灶的形成。

2.5 CGMP對各組大鼠細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的影響

2.5.1 血清中細(xì)胞因子的變化

表3 血清中細(xì)胞因子的變化Table 3 Changes in serum cytokines levels pg/mL

由表3可知，與正常組相比，模型組大鼠血清中IL-2等Th1類細(xì)胞因子水平均明顯降低，IL-4等Th2類細(xì)胞因子水平明顯升高，即可以認(rèn)為在DMH處理的大鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫存在Th1向Th2漂移。而與模型組相比，3 個劑量的CGMP組大鼠血清中Th1類細(xì)胞因子水平升高，Th2類細(xì)胞因子水平降低，即CGMP可以在一定程度上對二甲肼處理后的大鼠的Th1/Th2類細(xì)胞因子的失衡有改善作用，且以高劑量CGMP效果最佳。

2.5.2 結(jié)腸組織中細(xì)胞因子的變化

表4 結(jié)腸組織中細(xì)胞因子的變化Table 4 Changes in colonic cytokines levels pg/mL

由表4可知，與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中IL-2等Th1類細(xì)胞因子水平均明顯降低，IL-4等Th2類細(xì)胞因子水平明顯升高，即可以認(rèn)為在DMH處理的大鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫存在Th1向Th2漂移。而與模型組相比，3 個劑量的CGMP組大鼠結(jié)腸組織中Th1類細(xì)胞因子水平升高，Th2類細(xì)胞因子水平降低，即CGMP可以在一定程度上對二甲肼處理后的大鼠的Th1/Th2類細(xì)胞因子的失衡有改善作用，且以高劑量CGMP效果最佳。

3 討 論

結(jié)直腸癌腫瘤動物模型包括誘發(fā)性模型、移植性模型及轉(zhuǎn)基因模型[16-18]。誘發(fā)性模型操作簡單，重復(fù)性好，短時間內(nèi)可以大量復(fù)制，基本模擬了癌變過程，實驗中應(yīng)用較廣，目前建立結(jié)直腸癌誘發(fā)模型最常用DMH和及其代謝產(chǎn)物氧化偶氮甲烷[19]。本實驗選擇邊造模邊干預(yù)的方法進(jìn)行研究，即在給Wistar大鼠腹腔注射DMH的同時給予灌胃CGMP進(jìn)行干預(yù)。雖然結(jié)腸組織未見實體腫瘤出現(xiàn)，但ACF的出現(xiàn)可證明出現(xiàn)了癌前病變，因此認(rèn)為模型建造成功。

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖和蛋白的復(fù)合物，在正常機(jī)體內(nèi)，腸黏膜可以有效防止微生物及毒素的侵入。當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、感染、放化療和接受長期傳統(tǒng)的腸外營養(yǎng)時，腸黏膜會發(fā)生通透性升高，導(dǎo)致細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，引起內(nèi)毒素血癥?？焖贆z測血液、臟器內(nèi)毒素含量可以為臨床相關(guān)疾病的診斷預(yù)后提供參考。于耕紅等[20]的研究證明內(nèi)毒素與潰瘍性結(jié)腸炎的病情嚴(yán)重程度相關(guān)，其水平隨病情加重而上升，可以作為活動期的監(jiān)測指標(biāo)。羅錦花等[21]研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重燙傷破壞了腸道黏膜屏障功能，引起細(xì)菌、內(nèi)毒素移位，應(yīng)用中藥膳食干預(yù)，能有效預(yù)防腸源性感染。本研究結(jié)果表明，灌胃CGMP可以顯著抑制二甲肼處理的大鼠內(nèi)毒素水平，其機(jī)制為CGMP作為一種食源性短肽，具有促進(jìn)雙歧桿菌增殖的生物學(xué)活性，可改善二甲肼處理的大鼠腸道菌群失調(diào)的狀態(tài)。因此，對結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有緩解作用。

活性氧簇是一類含氧的、具有化學(xué)活性物質(zhì)的總稱。主要包括超氧陰離子、過氧化氫、氫氧自由基等，它們廣泛存在于機(jī)體內(nèi)并參與調(diào)節(jié)機(jī)體許多生理病理過程[22]。正常情況下，活性氧簇在代謝過程中產(chǎn)生（例如細(xì)胞呼吸鏈中），并保持平衡。它參與人體許多生理過程，是細(xì)胞主要的信號分子。大量研究顯示低水平活性氧簇在干細(xì)胞特性維持中起重要作用[23]。檢測細(xì)胞活性氧簇的含量，可以了解活性氧簇在細(xì)胞一些生理和病理狀態(tài)中的變化，分析藥物效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制。游宇等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥性腸病小鼠體內(nèi)，活性氧簇水平顯著升高，參苓白術(shù)散通過抑制氧化應(yīng)激及隨后觸發(fā)的炎癥反應(yīng)而起到抗炎癥性腸病的作用。本研究結(jié)果表明，灌胃CGMP可以顯著抑制DMH處理的大鼠活性氧簇水平，其機(jī)制可能與CGMP可以改善大鼠結(jié)腸黏膜水腫有關(guān)。因此，CGMP可以有效改善大鼠結(jié)腸黏膜損傷，緩解結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

大鼠經(jīng)DMH干預(yù)后其結(jié)腸內(nèi)內(nèi)毒素和活性氧簇的指標(biāo)與結(jié)腸組織和血清中細(xì)胞因子存在病理狀態(tài)，即炎癥狀態(tài)。而炎癥狀態(tài)是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的一個階段。

CRC的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的病理學(xué)程，涉及多步驟多階段的變化，從正常隱窩到異型隱窩灶，在分裂成腺瘤，腺瘤進(jìn)一步擴(kuò)大最后發(fā)展成為結(jié)直腸癌[25-26]。飲食因素在CRC的發(fā)生過程中的作用近年來被高度關(guān)注，攝食高動物蛋白以及脂肪與結(jié)直腸癌的發(fā)生呈明顯的正相關(guān)，而大量攝食蔬菜和水果則明顯的抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，而近年來國內(nèi)外生物活性肽的研究日愈活躍，越來越多的生物活性肽被發(fā)現(xiàn)分離，這些肽類不僅能夠用來作為氨基酸供體，而且被證明具有廣泛的生理功能，例如，抗血栓肽類，抗腫瘤多肽，免疫調(diào)節(jié)肽等[27]。

ACF是由Bird等[28]在1987年觀察鼠大腸癌模型時首次發(fā)現(xiàn)和提出的。ACF不同于正常腺管之處在于：腺管擴(kuò)大，上皮層增厚，腺管之間間距增大以及不規(guī)則的管腔和輕微的隆起。它的這些特征可以通過組織切片和美藍(lán)染色后電子顯微鏡下觀察而加以辨別[29]。研究發(fā)現(xiàn)，無論是在致癌物誘導(dǎo)的嚙齒類動物還是人類大腸癌變過程中，ACF均是大腸癌變的一種癌前損傷，作為鏡下可見的最早的大腸癌前病變，人們把ACF作為結(jié)直腸癌的早期診斷觀察指標(biāo)之一并用它來評價化合物和食品的抗癌和致癌作用以及相應(yīng)的作用機(jī)制等[30-38]。作為鏡下可見的最早的大腸癌前病變，人們把ACF作為結(jié)直腸癌的早期診斷觀察指標(biāo)之一并用它來評價化合物和食品的抗癌和致癌作用以及相應(yīng)的作用機(jī)制等[39-41]。為了探討CGMP對結(jié)腸癌形成的作用及作用機(jī)理，本研究通過對DMH處理的大鼠灌胃CGMP，觀察其對ACF形成的影響。結(jié)果顯示，未經(jīng)DMH處理的正常大鼠未沒有出現(xiàn)ACF，而經(jīng)DMH處理的大鼠均發(fā)現(xiàn)有ACF的形成，但灌胃了CGMP的大鼠其ACF的個數(shù)顯著低于模型組，且隨著CGMP的劑量的升高，ACF的數(shù)目減少，說明CGMP對ACF具有一定的抑制作用。

機(jī)體Th1/Th2平衡狀態(tài)失調(diào)后，與腫瘤免疫逃逸，細(xì)菌、病毒等微生物感染有一定關(guān)系，并參與變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的發(fā)生[42]。較多的證據(jù)表明，Th1/Th2極化是免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Th1/Th2極化異?；蛉毕菖c許多疾病有關(guān)，因而Th1/Th2極化已成為研究的新熱點[43]。高赟等[10]研究發(fā)現(xiàn)在胃腸癌患者與對照組相比IL-2/IL-4比值降低，證實在胃腸癌患者體內(nèi)細(xì)胞免疫為Th1向Th2漂移狀態(tài)。陳貴平等[9]研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者PBMC中Th1型細(xì)胞因子IL-2表達(dá)明顯低于正常組，Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10表達(dá)率明顯高于正常組；外周血血清細(xì)胞因子蛋白水平檢測，發(fā)現(xiàn)大腸癌患者血清中IL-2，明顯低于正常組，IL-10明顯高于正常組，與國內(nèi)外許多研究結(jié)果相同[44-46]。本研究通過對DMH處理的大鼠灌胃乳源CGMP，采用液相芯片技術(shù)分析DMH處理的大鼠血清和結(jié)腸組織提取液中8 種細(xì)胞因子的水平，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在DMH處理的大鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫存在Th1向Th2的漂移，乳源CGMP對這種狀態(tài)有一定的改善作用，且呈劑量依賴性。由此可以推斷，CRC的發(fā)生和發(fā)展與Th1/Th2的失衡是密切相關(guān)的，而乳源CGMP可以使大鼠機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫由Th2向Th1逆轉(zhuǎn)，為CRC的免疫治療提供了一定的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

乳源CGMP具有改善大鼠結(jié)腸組織損傷的功能，其機(jī)制為乳源CGMP 可以在一定程度上改善結(jié)腸的氧化損傷程度，且中劑量CGMP改善效果最佳?？梢杂行У匾种艱MH處理的大鼠體內(nèi)異型隱窩灶的形成，并呈劑量依賴性，而且CGMP可以下調(diào)大鼠體內(nèi)IL-4等Th2類細(xì)胞因子的異常升高，促進(jìn)IL-2等Th1類細(xì)胞因子的分泌，改善大鼠體內(nèi)處于失衡狀態(tài)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，從而改善結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。對于CGMP對大鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響，低劑量效果好，而在其他結(jié)果中又有劑量依賴性，這可能是因為量效關(guān)系。

[1] 梁云, 陳慶森. 食品生物活性物質(zhì)與結(jié)直腸癌DNA甲基化異常的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(21): 422-4264.

[2] KAWASAKI Y, DOSAKO S. Process of producing κ-casein glycomacropeptides: United States Patent, 5278288[P]. 1994.

[3] WOROBO R, KIM B C, KIM S, et al. Detection of choleratoxin- binding activity of glycomacropeptide from bovine κ-casein and optimization of its production by use of response surface methodology[J]. Dairy Foods, 1998, 81(1): 28-31.

[4] 吳疆, 龐廣昌. 酪蛋白糖巨肽的生物學(xué)活性[J]. 食品科技, 2003, 28(9): 19-22.

[5] WALDNER M, SCHIMANSKI C C, NEURATH M F. Colon cancer and the immune system: the role of tumor invading T cells[J]. World Journal of Gastroenterology, 2006, 12(45): 7233-7238.

[6] 龔非力. 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M]. 2版. 北京: 科學(xué)出版社, 2004: 164-171.

[7] BANCHEAEAU J, SCHECER T B, PALUCKA A K. Dendritic cell as vectors for therapy[J]. Cell, 2001, 106(3): 271-274.

[8] RIFA’I M, KAWAMOTO Y, NAKASHIMA I, et al. Essential roles of CD8+CDl22+regulatory T cells in the maintenance of T cell homeostasis[J]. Journal of Experimental Medicine, 2004, 200(9): 1123-1134.

[9] 陳貴平, 鞠海星, 李德川. 大腸癌患者外周血血清中Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)的測定及臨床意義[J]. 浙江臨床醫(yī)學(xué), 2006, 8(11): 1136-1137.

[10] 高赟, 許沈華, 朱赤紅, 等. CBA技術(shù)檢測胃腸癌患者Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2011, 20(2): 280-283.

[11] CHEN Qingsen, LIANG Yun, ZHU Chenchen, et al. Effects of casein glycomacropeptide on the early development of primary colorectal cancer in rats[J]. Food Science and Human Wellness, 2013, 2(3/4): 113-118.

[12] CHEN Qingsen, WANG Hua, ZHU Chenchen, et al. Anti-apoptotic effects of milk-derived casein glycomacropeptide on mice with ulcerative colitis[J]. Food and Agricultural Immunology, 2013, Available online 05. aughttp://dx.doi.org/10.1080/09540105. 2013. 823912.

[13] 程蕾, 來茂德. 一種新的結(jié)直腸癌癌前病變: 畸形腺窩灶[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2001, 17(3): 253-255.

[14] KOBAYASHI M, WATANABE H, AJIOKA Y, et al. Effect of K-ras mutation on morphogenesis of colorectal adenomas and early cancer: rlationship to distribution of proliferating cells[J]. Human Pathology, 1996, 27: 1042-1049.

[15] NUCCI M R, ROBINSON C R, LONGO P, et al. Phenotypicand genotypic characeristics aberrant crypt foci in human colonic mucosa[J]. Human Pathology, 1997, 28: 1369-1407.

[16] 涂經(jīng)楷, 傅仲學(xué). 大腸癌裸鼠移植模型研究進(jìn)展[J]. 中華消化外科雜志, 2009, 8(4): 318-320.

[17] 葉爾買克, 張明鑫, 王健生. 結(jié)直腸癌動物模型研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展, 2010, 13(5): 388-391.

[18] 劉成霞, 張尚忠, 李鐵軍, 等. 二甲基肼誘導(dǎo)昆明小鼠大腸癌的研究[J]. 中國腫瘤生物醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 12(1): 63-64.

[19] 侯冰宗, 周少朋, 余水平, 等. 二甲基肼誘導(dǎo)高齡SD大鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的初步研究[J]. 消化腫瘤雜志, 2011, 3(4): 251-254.

[20] 于耕紅, 范昕, 馮詠梅. 潰瘍性結(jié)腸炎患者CA125及內(nèi)毒素檢測價值的探討[J]. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 10(11): 827-829.

[21] 羅錦花, 詹劍華, 游浩元, 等. 中藥膳食對燙傷大鼠腸源性感染防治作用[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2012, 28(4): 486-488.

[22] BAUMANN M, KRAUSE M, HILL R. Exploring the role of cancer stem cells in radio resistance[J]. Nature Reviews Cancer, 2008, 8(7): 545-554.

[23] 田允鴻, 陳衛(wèi)國, 謝國柱, 等. 乳腺癌干細(xì)胞中活性氧簇水平的研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2011, 40(5): 417-419.

[24] 游宇, 劉玉暉, 高書亮. 參苓白術(shù)散抗小鼠炎癥性腸病的機(jī)制研究[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2012, 18(5): 136-140.

[25] TAKAYAMA T, KATSUKI S, TAKAHASHI Y, et al. Aberrant crypt foci of the colon precursors of adenoma and cancer[J]. The New England Journal of Medicine, 1998, 339(18): 1277-1284.

[26] MICHAEL C, ARCHER W, BRUCE R, et al. Aberrant crypt foci and microadenoma as makers for colon cancer[J]. Environmental Health Perspectives, 1992, 98: 195-197.

[27] XU R J. Bioactive peptides in milk and their biological and health imp lications[J]. Food Reviews International, 1998, 14: 1-16.

[28] BIRD P R, GOOD C K. The significance of aberrant crypt foci in understanding the pathogenesis of colon cancer[J]. Toxicol Letters, 2000, 112/113: 395-402.

[29] PAULSEN J E, STEFFENSEN I L, NAMORK E, et al. Scanning electron microscopy of aberrant crypt foci in rat colon[J]. Carcino-Genesis, 1994, 15: 2371-2373.

[30] CADEMI G, PERRELLI M G, CECCHINI F, et al. Enhanced growth of colorectal aberrant crypt foci in fasted/refed rats involve changes in TGF21 and p21CIP expressions[J]. Carcinogenesis, 2002, 23(2): 323-327.

[31] YAMADA Y, YOSHIMI N, HIROSE Y, et al. Frequent β-catenin gene mutations and accumulations of the protein in the putative preneo plastic lesions lacking macroscopic aberrant crypt foci appearance, in rat colon carcinogenesis[J]. Cancer Research, 2000, 60(7): 3323-3327.

[32] SAKURAZAWA N, TANAKA N, ONDA M, et al. Instability of X chromosome methylation in aberrant crypt foci of the human colon[J]. Cancer Research, 2000, 60(12): 3165-3169.

[33] HEINEN C D, SHIYAPURKAR N, TANG Z, et al. Microsatellite in stability in aberrant crypt foci from human colons[J]. Cancer Research, 1996, 56(23): 5339-5341.

[34] GEE J M, NOTEBOM H P J M, POLLEY A C J, et al. Increased induction of abberant crypt foci by l,2-dimethydrazine in rats fed diets containing purified genistein or genistein-rich soya protein[J]. Carcinogenesis, 2000, 21(12): 2255-2259.

[35] KASHUNOLO Y, MORISAWA I, HOSODA A, et al. Molecular changes in the early stage of colon carcinogenesis in rats treated with azoxy- methane[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2002, 21(2): 203-211.

[36] TAKYAMA T, OHI M, HAYASHI T, et al. Analysis of K-rats, APC and beta-catenin in aberrant crypt foci in sporadic adenoma, cancer, and familial adenomatous polyposis[J]. Gastroenterology, 2001, 121(3): 599-611.

[37] OEHIAI M, USHIGOME M, FUJIWARA K, et al. Characterization of dysplastic aberrant crypt foci in the rat colon induced by 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,52b] pyridine[J]. The American Journal of Pathology, 2003, 163(4): 1607-1614.

[38] TANAKA T, KOHNO H, YOSHITANI S, et al. Ligands for peroxisome proliferator-activated recap torsa and inhibit chemically induced colitis and formation of aberrant crypt foci in rats[J]. Cancer Research, 2001, 61(6): 2424-2428.

[39] WARGOVICH M J, JIMENEZ A, MEKEE K, et al. Efficacy of potential chemopreventive agents on rat colon aberrant crypt formation and progression[J]. Carcinogenesis, 2000, 21: 1149-1155.

[40] JEN J, POWELL S M, PAPADOPOULOS N, et al. Molecular determinants of dysplasia in colorectal lesions[J]. Cancer Research, 1994, 54: 5523-5526.

[41] SIU I M, PRETLOW T G, AMINI S B, et al. Identification of dysplasia in human colonic aberrant crypt foci[J]. The American Journal of Pathology, 1997, 150: 1805-1813.

[42] TSUKUI T, HILDESHEIM A , SCHIFFMAN M H, et al. Interleukin 2 production in vitro by peripheral lymphocytes in response to human papillomavirus-derived peptides: correlation with cervical pathology[J]. Cancer Research, 1996, 56: 3967-3974.

[43] OTTEN L A , TACCHINI F M, LOHOFF F, et al. Deregulated MHC class II Transactivator expression leads to a strong Th2 bias in CD4+T lymphocytes[J]. Journal of Immunology, 2003, 170: 1150-1157.

[44] GOURLEY T, ROYS N, LUKACS S, et al. A novel role for the major histocompatibility complex class II transactivator CIITA in the repression of IL-4 production[J]. Immunity, 1999, 10: 377-386.

[45] KHARKEVITCH D D, SEITO D, BALCH G C, et al. Characterization of autologous tumor-specific T-helper 2 cells in tumor- infiltrating lymphocytes from a patient with metastatic melanoma[J]. International Journal of Cancer, 1994, 58: 317-323.

[46] 丁強(qiáng), 沈歷宗. 大腸癌的基因治療進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué): 腫瘤學(xué)分冊, 2001, 28(6): 225-227.

Effects of Casein Glycomacropeptide on Dimethyl Hydrazine-Induced Alteration of Cytokine Network in Rats

CHEN Qing-sen1, WANG Jin-feng2, YAN Ya-li1, PANG Guang-chang1
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China; 2. Beijing Shihe Biological Technology Co. Ltd., Beijing 100176, China)

Purpose: In order to infer the infl uence of casein glycomacropeptide (CGMP) on the cytokine network in rats treated with dimethyl hydrazine, we studied the changes in cytokines in peripheral blood and colon of rats challenged with intraperitoneal injection of dimethyl hydrazine, followed by intragastric administration of different doses of CGMP. Methods: A total of 60 Wistar rats were randomly divided into fi ve groups: normal, model, low dose CGMP, moderate dose CGMP and high dose CGMP groups. The rats from all other groups except for the normal group were injected weekly with dimethyl hydrazine at 30 mg/kg bw. At the same time, the rats in the low-, moderate- and high dose-CGMP groups were orally ad ministered daily w ith CGMP at 10, 50 and 100 mg/(kg·d), respectively. Fifteen weeks later, the rats were killed and colon and serum samples were taken. The number of colon aberrant crypt foci was counted, and the levels of cytokines in colon and peripheral blood were detected by using the Luminex assay. Results: 1) no signifi cant difference in body weight in rats among CGMP-treated and control groups was seen whereas CGMP signifi cantly reduced the levels of endotoxin and reactive oxygen species in a dose-dependent manner; 2) CGMP signifi cantly inhibited the formation of aberrant crypt foci (ACF) in a dose-dependent manner; 3) CGMP signifi cantly inhibited imbalance of Th1/Th2 cytokines in rats treated with dimethyl hydrazine in a dose-dependent manner. Conclusions: CGMP could improve colon damage in rats treated with dimethyl hydrazine by effectively inhibiting the formation of ACF in a dose-dependent manner, downregulating the levels of Th2 cytokines such as IL-4, and promoting the secretion of Th1 cytokines such as IL-2 to improve the imbalance of the cytokine network.

casein glycomacropeptide (CGMP); cytokine network; aberrant crypt foci(ACF)

TS252.1

A

1002-6630（2014）13-0192-07

10.7506/spkx1002-6630-201413037

2014-03-24

國家自然科學(xué)基金面上項目（30771524；31071522）

陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、功能成分與腸道健康的關(guān)系。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn