不同干燥方式對(duì)銀耳多糖理化特性及抗氧化活性的影響

吳 振，李 紅，羅 楊，譚紅軍,,*，陳 崗，師 萱，楊 勇，詹 永，石文娟，黃婧禹

（1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 401121；3.重慶市銀耳營(yíng)養(yǎng)食品企業(yè)工程技術(shù)研究中心，重慶 409003）

不同干燥方式對(duì)銀耳多糖理化特性及抗氧化活性的影響

吳 振1，李 紅2，羅 楊1，譚紅軍1,3,*，陳 崗1，師 萱1，楊 勇1，詹 永1，石文娟3，黃婧禹1

（1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 401121；3.重慶市銀耳營(yíng)養(yǎng)食品企業(yè)工程技術(shù)研究中心，重慶 409003）

研究傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥、冷凍干燥和抽真空干燥等不同干燥方式對(duì)銀耳多糖（Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs）的理化特性和體外還原力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（hydroxyl free radical，?OH）和超氧陰離子自由基（superoxide free radicals，O2－·）的影響。結(jié)果表明：3種干燥方式對(duì)TFPs均有顯著影響，其中冷凍干燥處理多糖（freezing drying Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs-F）的得率、總糖和黏度最高；3種干燥方式對(duì)粗多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布和和抗氧化活性有一定影響；TFPs-F的還原力、清除DPPH自由基、?OH和O2－·的半抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）分別為2.61、1.64、1.78、1.75 mg/mL；傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥和抽真空干燥處理多糖的還原力、清除DPPH自由基、?OH和O2－·的IC50高于低溫冷凍干燥處理多糖相應(yīng)的IC50。結(jié)果說(shuō)明，冷凍干燥處理是獲得高品質(zhì)和高活性銀耳多糖的較好方法。

銀耳多糖；干燥方式；理化特性；抗氧化活性

銀耳（Tremella fuciformis）在分類學(xué)上屬于銀耳科（Tremellaeeae），銀耳屬（Tremella），是一種重要的食用菌，其含有多糖、酚類、黃酮類和多種氨基酸等生物活性成分，被譽(yù)為“食用菌之王”[1]，是一種優(yōu)質(zhì)的功效成分提取資源。中醫(yī)認(rèn)為，銀耳味甘淡性平，歸肺、胃經(jīng)，具有滋陰潤(rùn)肺、養(yǎng)胃生津的功效。銀耳的藥理活性多數(shù)與銀耳多糖（Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs）有關(guān)，TFPs是銀耳孢子經(jīng)深層發(fā)酵的產(chǎn)物，主要是以α-（1,3）-D-甘露糖為主鏈的雜多糖，具有廣泛的藥理活性。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、抗凝血血栓、抗?jié)?、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抗病毒、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及改善記憶力等多方面的活性[2-7]，已成為當(dāng)前醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，真菌多糖的生物功能與其理化組成、水溶性、分子質(zhì)量大小、分支度、黏度和高級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)等緊密相關(guān)，主要受到樣品處理方法、提取工藝參數(shù)和干燥方法三大類因素的影響[8-11]。Ma Lishuai等[11]研究了不同干燥條件對(duì)白樺茸多糖理化特性和生物活性的影響，F(xiàn)an Liuping等[12]通過(guò)分析不同干燥處理方法對(duì)靈芝多糖抗氧化活性的影響，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，不同干燥方式對(duì)真菌多糖的理化特性和生物活性有顯著的影響。脫水干制是真菌多糖加工貯藏的一個(gè)重要方法，傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品企業(yè)，但是傳統(tǒng)高溫干燥破壞了多糖的品質(zhì)和活性[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了3 種不同多糖干燥方式（傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥、冷凍干燥和抽真空干燥）對(duì)TFPs的得率、理化特性和抗氧化活性的影響，該研究對(duì)于引導(dǎo)銀耳多糖的科學(xué)利用和發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮銀耳：采于重慶市黔江區(qū)，子實(shí)體呈乳白色，膠質(zhì)半透明，直徑10～12 cm，鮮樣平均含水率為75%～80%（濕基），采后在冷藏并保濕的條件下貯運(yùn)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Dextrans系列標(biāo)樣（T-10、T-40、T-70、T-500）、Sephadex G-150 瑞典 Pharmacia公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所用水為雙蒸水，所用溶液均自行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；LSC真空冷凍干燥機(jī)德國(guó)Martin Christ公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì) 上海菁海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 銀耳多糖提取

將銀耳干燥（55 ℃）至水分含量8%；粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩。用95%的乙醇40 ℃熱處理兩次（2×1 h），以除去單糖、低聚糖和色素等小分子物質(zhì)，同時(shí)滅酶活以防止在提取過(guò)程中多糖的降解。抽濾、濃縮、干燥，得到預(yù)處理原料。預(yù)處理后的銀耳粉于95℃熱水提取兩次（料液比為30∶1，2×2 h）→離心（3 000 r/min，10 min）→合并上清液→95%乙醇、100%乙醇和丙酮分別處理，4 ℃放置24 h→離心（3 000 r/min，10 min）→溶解，Sevag方法脫蛋白[13]（10 次）→透析→粗提物；將粗提物分別采用傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥（50 ℃，16 h）、冷凍干燥（－50 ℃，72 h）和抽真空干燥（50 ℃，0.06 MPa，12 h）等不同干燥方式進(jìn)行處理，干燥至水分含量小于10%；傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥、冷凍干燥和抽真空干燥獲得的多糖分別命名為傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥多糖（traditional hot-air drying Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs-H）、冷凍干燥多糖（freezing drying Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs-F）和抽真空干燥多糖（vacuuming drying Tremella fuciformis polysaccharides，TFPs-V）。

1.3.2 粗多糖化學(xué)組成分析

以葡萄糖為標(biāo)樣，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，具體參考文獻(xiàn)[14]；灰分測(cè)定參考AOAC 942.05方法[15]，蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考AOCS Ba 4a-38方法[16]；采用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)測(cè)定粗多糖的相對(duì)黏度，粗多糖水溶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL（25 ℃）[17]。各組分以占干質(zhì)量的百分比計(jì)算。

1.3.3 粗多糖相對(duì)分子質(zhì)量

采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定TFPs相對(duì)分子質(zhì)量。分別將已知相對(duì)分子質(zhì)量的DextranT-10、DextranT-40、DextranT-70、DextranT-500（相對(duì)分子質(zhì)量分別為1×104、4×104、7×104、5×105）溶解于蒸餾水中，質(zhì)量濃度為2 mg/mL。上Sephadex G-150凝膠柱（1.6 cm× 100 cm），以純水洗脫，上樣量1 mL，流速24 mL/h，自動(dòng)部分收集儀收集洗出液，用苯酚-硫酸法于490 nm檢測(cè)葡聚糖，根據(jù)洗脫體積求得相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。以相同的條件將樣品上柱，根據(jù)洗脫體積，求得相對(duì)分子質(zhì)量[18]。

1.3.4 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.4.1 還原力的測(cè)定

參照Wu Huichun等[19]的方法，在具塞比色管中加入0.2 mol/L、pH值為6.6的磷酸緩沖液2 mL、不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）0.2 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，50 ℃水浴反應(yīng)20 min后迅速冷卻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液2mL，將混合物3 000 r/min離心20 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氯化鐵0.4 mL，混勻后室溫放置10 min，于波長(zhǎng)700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（吸光度越大表明還原力越強(qiáng)）。VC作為陽(yáng)性對(duì)照；還原力的半抑制濃度（halfinhibitory concentration，IC50）為吸光度0.50時(shí)對(duì)應(yīng)的測(cè)試物的質(zhì)量濃度。

1.3.4.2 清除DPPH自由基的測(cè)定

參照Liu Lixiang等[20]方法進(jìn)行，將DPPH 1 mL（10–4mol/L，95%乙醇）與不同質(zhì)量濃度（0.5～3.5 mg/mL）的樣品和VC陽(yáng)性對(duì)照溶液3 mL混勻后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度Ai，同時(shí)，將DPPH 1 mL與樣品空白3 mL混勻后測(cè)定吸光度Ac，將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液3 mL與95%乙醇1 mL混勻后測(cè)定吸光度Aj，按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

以樣品質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除率作圖，求出清除率為50%時(shí)所需樣品質(zhì)量濃度，即半抑制濃度（IC50）。

1.3.4.3 清除羥自由基（hydroxyl free radical，?OH）的測(cè)定

參照Wang Hongyuan等[21]方法并略有修改。取0.6 mL鄰二氮菲的乙醇溶液（5 mmol/L），加入0.4 mL的磷酸鹽緩沖液（0.15 mol/L，pH 7.40）和0.6 mL的FeSO4（0.75 mmol/L），加入待測(cè)樣品2 mL混勻后，加入0.4 mL的H2O2（0.1%）搖勻，37℃條件下水浴60 min，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度（Ai）；以去離子水代替TFPs和H2O2溶液重復(fù)上述操作，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度（Ac）；以去離子水代替TFPs來(lái)重復(fù)以上操作，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度（Aj）。按式（3）計(jì)算·OH清除率。

以樣品質(zhì)量濃度對(duì)·OH清除率作圖，求出清除率為50%時(shí)所需樣品質(zhì)量濃度，即IC50。

1.3.4.4 清除超氧陰離子自由基（superoxide free radical，O2－·）的測(cè)定

參照J(rèn)iang Bo等[22]的方法，在具塞比色管中加入不同濃度的樣品和VC陽(yáng)性對(duì)照溶液（0.5～3.5 mg/mL）4 mL、0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH8.2）2.5 mL混勻，在25℃水浴后加入6.0 mmol/L的鄰苯三酚溶液（25 ℃水浴預(yù)熱）2.5 mL，用0.5 mL的濃鹽酸終止反應(yīng)，迅速在299 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1，以去離子水代替鄰苯三酚溶液測(cè)定吸光度A2，以去離子水代替樣品溶液測(cè)定吸光度A0，按式（4）計(jì)算O2－·清除率。

以樣品質(zhì)量濃度對(duì)O2－·清除率作圖，求出清除率為50%時(shí)所需樣品質(zhì)量濃度，即IC50。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 15數(shù)據(jù)處理軟件，各組數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s（n=3）表示，并進(jìn)行方差分析，LSD法多重比較，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式對(duì)TFPs理化特性的影響

表1 不同干燥方式對(duì)銀耳多糖化學(xué)組成和相對(duì)黏度的影響Table 1 Effects of different drying methods on chemical composition and viscosity of TFPs

由表1可知，冷凍干燥處理的TFPs得率最高，達(dá)到（19.17±1.13）%，但不同干燥方式對(duì)TFPs得率的影響差異不顯著（P＞0.05）；不同干燥方式對(duì)TFPs總糖有顯著影響（P＜0.05），其中冷凍干燥處理的TFP s總糖最高，達(dá)到（78.58±3.11）%。冷凍干燥TFPs的相對(duì)黏度最大（2.82±0.11），與傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥和抽真空干燥處理差異顯著（P＜0.05）。傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥和抽真空干燥處理所需溫度更高，較高溫度情況下，多糖可能發(fā)生降解。Ma Lishuai等[11]研究了不同干燥條件對(duì)白樺茸多糖理化特性和生物活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同干燥方式對(duì)白樺茸多糖化學(xué)組成有顯著的影響，提取效果為：冷凍干燥＞抽真空干燥＞傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥。Nep等[10]通過(guò)分析不同干燥處理方法對(duì)Grewia mollis多糖理化特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同干燥方式對(duì)真菌多糖的理化特性有顯著的影響。

2.2 不同干燥方式對(duì)TFPs相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響

由圖1、表2可知，冷凍干燥TFPs凝膠柱洗脫曲線主要有4 個(gè)洗脫峰，且相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍較窄，分別為33.27×104、12.30×104、6.34×104和1.17×104；傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥TFPs凝膠柱洗脫曲線主要有4 個(gè)洗脫峰（相對(duì)分子質(zhì)量分別為54.70×104、14.52×104、4.55×104和2.27×104）；而抽真空干燥TFPs凝膠柱洗脫曲線的4 個(gè)洗脫峰介于TFPs-H和TFPs-F之間，其中TFPs-H的相對(duì)分子質(zhì)量最大，可能原因在于高溫作用下多糖分子更易發(fā)生交聯(lián)和聚集[11]。根據(jù)Sun Liqin等[23]報(bào)道，通過(guò)制備不同相對(duì)分子質(zhì)量的紫球藻多糖（分子質(zhì)量位于6.55～2 918.7 kD），結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量2 918.7 kD的紫球藻多糖沒(méi)有明顯的抗氧化活性，降解之后的低分子質(zhì)量多糖顯示出較強(qiáng)的抗氧化保護(hù)作用，并且分子質(zhì)量6.55 kD多糖的抗氧化活性強(qiáng)于分子質(zhì)量60.66 kD和256 kD多糖。

圖1 不同干燥方式對(duì)TFPs相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響Fig.1 Effects of different drying methods on molecular size distribution of TFPs

表2 不同干燥方式對(duì)銀耳多糖相對(duì)分子質(zhì)量的影響Table 2 Molecular weight of TFPs dried by different metho ds

2.3 不同干燥方式對(duì)TFPs還原力和清除自由基活性的影響

圖2 不同干燥方式對(duì)TFPs的還原力（A）和清除DPPH自由基（B）、?OH（CC）、OO2－·（DD）的影響Fig.2 Effects of different drying methods on reducing power (A), DPPH free radical (B), ?OH (C) and O－2· (D) scavenging activity of TFPs

由圖2A可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.5～3.5 mg/mL），還原力與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，線性方程R2均大于0.99；TFPs-H、TFPs-F、TFPs-V與VC還原力的IC50值分別為3.48、2.61、3.23、1.66 mg/mL，表明TFPs具有一定的還原能力，但還原能力弱于VC，其中還原力能力為：VC＞TFPs-F＞TFPs-V＞TFPs-H。由圖2B可知，TFPs對(duì)DPPH自由基的清除率隨著TFPs質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，兩者呈正相關(guān)；VC、TFPs-F、TFPs-V、TFPs-H對(duì)DPPH自由基的IC50值分別為0.98、1.64、2.11、2.19 mg/mL，其中TFPs-V、TFPs-H對(duì)DPPH自由基清除作用差別較小。由圖2C可知，3 種干燥處理的銀耳多糖TFPs對(duì)?OH的清除率，隨TFPs質(zhì)量濃度的增加而增大，相同質(zhì)量濃度條件下，?OH的清除能力為：VC＞TFPs-F＞TFPs-V＞TFPs-H，其中TFPs-V和TFPs-F對(duì)?OH清除作用較強(qiáng)。由圖2D可知，與TFPs清除DPPH自由基和?OH能力相比，TFPs清除O2－·能力較弱（清除率≤80.56%），總體趨勢(shì)與TFPs對(duì)?OH的清除率相似。

3 結(jié) 論

銀耳是人們生活中常用的食用菌，含有酚類、黃酮類及膳食纖維等物質(zhì)，但多糖是其主要的活性成分，開(kāi)發(fā)銀耳多糖新產(chǎn)品具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。為提高銀耳多糖的品質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥、冷凍干燥和抽真空干燥3 種方式干燥銀耳多糖，通過(guò)測(cè)定TFPs的化學(xué)組成、相對(duì)分子質(zhì)量分布和抗氧化活性，比較了3 種干燥方法的優(yōu)劣。結(jié)果表明：3 種干燥方法對(duì)TFPs化學(xué)組成和抗氧化活性有顯著影響（P＜0.05），其中冷凍干燥處理較有優(yōu)勢(shì)，TFPs-F品質(zhì)和抗氧化活性最高，優(yōu)于其他兩種干燥方法，較適于工業(yè)生產(chǎn)較高品質(zhì)和高活性的抗氧化銀耳多糖。

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Effects of Different Drying Methods on Physio-chemical Properties and Antioxidant Activities of Polysaccharides Extracted from Tremella fuciformis

WU Zhen1, LI Hong2, LUO Yang1, TAN Hong-jun1,3,*, CHEN Gang1, SHI Xuan1, YANG Yong1, ZHAN Yong1, SHI Wen-juan3, HUANG Jing-yu1
(1. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China; 2. Chongqing Institute for Food and Drug Control, Chongqing 401121, China; 3. Chongqing Engineering Research Center for Tremella Nutrition Food Enterprises, Chongqing 409003, China)

The influences of different drying methods, including traditional hot air drying, freeze drying and vacuum drying, on the physio-chemical properties and antioxidant activities of crude polysaccharides extracted from Tremella fuciformis (TFPs) were investigated. The results showed that freeze-dried TFPs (TFPs-F) had higher extraction efficiency, total sugar content and viscosity. It was also found that molecular size distribution and antioxidant activities of TFPs were affected by three different drying methods. The IC50for reducing power and scavenging activities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH free radical), hydroxyl and superoxide anion radicals of TFPs-F were 2.61, 1.64, 1.78, and 1.75 mg/mL, respectively. Moreover, it was clearly demonstrated that the IC50of traditional hot air dried and vacuum dried TFPs was higher than that of low temperature freeze dried TFPs. The data obtained in vitro models suggest that freeze drying is an appropriate and effective way of obtaining the polysaccharides with antioxidant activity from Tremella fuciformis.

Tremella fuciformis polysaccharides; drying methods; physio-chemical properties; antioxidant activity

TS201.2

A

1002-6630（2014）13-0093-05

10.7506/spkx1002-6630-201413017

2013-09-18

重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（CSTC2012AA5026；CSTC2012GG-YYJS0188；CSTC2013YYKFA80004）；重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研課題（ZY20132075）

吳振（1985—），男，助理研究員，碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：wuzhen985@126.com

*通信作者：譚紅軍（1973—），男，副研究員，碩士，主要從事中藥健康食品研發(fā)。E-mail：thj-1973@163.com