有機相納米辣根過氧化物酶傳感器法測定植物油的過氧化值

王麗然，張媛媛，李書國

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

有機相納米辣根過氧化物酶傳感器法測定植物油的過氧化值

王麗然，張媛媛，李書國*

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

研究有機相CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器的制備及其在植物油過氧化值測定中的應用。通過循環(huán)伏安法研究了HRP感器在二氯乙烷0.1 mol/L的氯化鋰溶液中對脂質(zhì)過氧化物的電催化作用，該酶傳感器的電極過程屬于表面電化學控制過程而非蛋白質(zhì)擴散控制過程；利用電鏡掃描技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)該酶傳感器修飾膜層內(nèi)部形成有利于酶電化學催化反應三維的微網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，所制備的酶傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重復性。過氧化月桂酰在該酶傳感器上的催化還原峰電流增量與其在2.5×10－6～3.0×10－5mol/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，y =0.108 5x－0.354 8，R2=0.992 3，最低檢測限為2.0×10－7mol/L（RSN=3）。該方法應用于實際大豆油、玉米油等樣品的過氧化值測定，其結(jié)果與國家標準中碘量法的測定結(jié)果一致，而且精度和準確度高于碘量法，所需油樣少，檢測速度快，不受油樣顏色影響，該方法可用于過氧化值的快速、準確測定。

有機相酶傳感器；多壁碳納米管；植物油；過氧化值測定

植物油含有豐富的不飽和脂肪酸，易于發(fā)生氧化變質(zhì)，產(chǎn)生不良風味，破壞必需脂肪酸和脂溶性維生素VA、VE、VK，從而降低營養(yǎng)價值；氧化的油脂對機體的細胞膜、酶系統(tǒng)造成損害作用，從而加快機體的衰老，產(chǎn)生有毒物質(zhì)和致癌物，嚴重危害著人體的健康，因此預防油脂的氧化變質(zhì)對保證食品安全意義重大。過氧化值是判斷油脂新鮮程度、質(zhì)量等級和安全性的重要指標[1-3]。目前過氧化值的測定方法有碘量法[4-5]、紫外檢測法[6]、色譜法[7-8]、過氧化物酶傳感器法[9-11]等，其中碘量法是國家標準方法，該法雖然簡單易行，但測定過程耗時長，所需化學試劑多，對深顏色油脂的測定滴定終點難以判斷等問題[12]。

過氧化物酶傳感器已廣泛地應用于生物、環(huán)境、醫(yī)學、工業(yè)、食品等領域的過氧化物的測定，但一般過氧化物酶電極的研究集于測定水相介質(zhì)中的過氧化氫和其他水溶性過氧化物為主，而植物油及其有機過氧化物屬于疏水性的物質(zhì)成分，在水相電解質(zhì)溶液中的溶解度比較低，所以有機相過氧化物酶傳感器的研究及其在有機過氧化物分析測定的應用備受關注，有機相酶電極的獨特性在于測定疏水性底物，避免微生物污染，減少或避免水相中的副反應以及熱力學穩(wěn)定性的提高等，為酶電極的研究與應用開辟了新的領域[13]，Konash等[14]利用Eastman AQ聚合物膜包埋辣根過氧化物酶，以二茂鐵為電子介體，構(gòu)建有機相酶傳感器，用于快速流動注射分析食用油樣品中的過氧化物，酶電極作為流動探測器，氯仿作為載體，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）電極與油樣中的過氧化物反應迅速，檢測限為2.5×10－6mol/L。Chut等[15]利用硅溶膠-凝膠法在碳糊電極表面包埋固定化HRP制備電流型HRP電極，并利用該酶電極測定有機相中的過氧化氫、過氧化月桂酰等有機過氧化物；李書國等[16]制備了Nafion/MB/HRP電極，應用于實際油樣過氧化值的檢測，其最低檢測限為2.75×10－7mol/L。

本實驗以殼聚糖（chitosan，CS）為新型固定化材料，同時利用具有大的比表面積和強的吸附能力的多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs），將辣根過氧化物酶、二茂鐵（ferrocene，F(xiàn)C）等固定在玻碳電極表面制備夾心式有機相納米HRP傳感器，優(yōu)化檢測條件，確定分析參數(shù)，并測定了3 種植物油樣品的過氧化值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆油、玉米油、葵花籽油 市購；殼聚糖（脫乙酰度≥90.0%） 北京Solarbio公司；多壁碳納米管（8～15 nm，50 μm，＞95%） 北京德科島金公司；辣根過氧化物酶（生化級）（700 U/mg） 上海雪滿生物科技有限公司；過氧化月桂酰（95%） 美國Fluka公司；1,2-二氯乙烷、異丙醇、異辛烷、碘化鉀、無水氯化鋰、高氯酸鋰、甲醇、乙腈、氯仿、丙酮、可溶性淀粉、冰乙酸、95%乙醇、硫酸、二茂鐵、硫代硫酸鈉、無水乙醇（均為分析純） 天津市永大化學試劑有限公司；電極預處理所用硫酸溶液用三蒸水配制，其余溶液均用無水乙醇配制。

1.2 儀器與設備

PAR 270電化學系統(tǒng)（M283型恒電位儀/恒電流儀、方正電腦及操作軟件M270電化學軟件） 美國EG & G公司；三電極系統(tǒng)包括（玻碳電極為工作電極（直徑為3 mm），鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，電極拋光粉（Al2O3，1.0、0.3、0.05 μm））美國CHI儀器公司；SR8001型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo 公司；超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；Dragon MED微量移液器 大龍醫(yī)療設備（上海）有限公司；TGL-10B高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；SHH.W21型電熱恒溫水浴箱 北京長風儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器的制備

玻碳電極依次用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3粉研磨拋光，用超純水潤濕，接著進行超聲清洗處理，再用超純水和丙酮沖洗除去其表面吸附物質(zhì)，使成鏡面，然后在0.2 mol/L的硫酸溶液中用循環(huán)伏安法掃描處理，掃描速率為50 mV/s，電壓范圍為－0.5～＋1.5 V，持續(xù)掃描10 min，得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖后，用二蒸餾洗凈，室溫干燥后備用。

將0.1 mL 0.1 mol/L二茂鐵液溶于0.9 mL活化多壁碳納米管[17-18]的溶液中使二茂鐵濃度為0.01 mol/L，用微量移液管吸取5 μL該MWCNTs-FC分散液滴涂于玻碳電極表面，室溫條件下干燥后，滴涂5 μL HRP緩沖溶液（質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL）于電極表面，室溫條件下干燥后，再滴涂5 μL MWCNTs＋CS溶液與電極表面，室溫條件下干燥，制備好的CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 碘量法

參照GB/T 5538—2005《動植物油脂過氧化值測定》方法測定。

1.3.3 有機相酶傳感器法

選擇循環(huán)伏安法研究修飾電極對油脂中的過氧化物的催化反應及電極過程，用方波伏安法測量CS-FC/HRP/ MWCNTs酶傳感器對油脂中過氧化物的催化還原電流響應，實驗在（25±0.5）℃條件下進行。循環(huán)伏安圖及方波伏安圖在1.0～0.0 V電位范圍、20 mV/s的掃描速率下記錄。

1.3.4 標準加入法

過氧化月桂酰一般在測定油脂產(chǎn)品的過氧化值時，被用作標準品，準確稱取0.398 g過氧化月桂酰標準品加入到100 mL的容量瓶，用無水乙醇溶解并稀釋到刻度，其濃度為1.0×10－2mol/L，避光貯存?zhèn)溆?；?.5 mL的0.1 mol/L硫酸溶液和0.5 mL的1.0 mol/L的氯化鋰乙醇溶液以及一定體積的過氧化月桂酰乙醇溶液使其濃度達2.0×10－5、4.0×10－5mol/L，加入適量體積的1,2-二氯乙烷到25 mL的容量瓶，使其達到70%的比例，用乙腈稀釋至刻度要求。在空白樣和加入標準過氧化月桂酰溶液樣品中，分別記錄其循環(huán)伏安圖及方波伏安圖，每個樣品都進行3 次平行實驗，計算3 次還原峰電流平均值，減去空白樣時酶傳感器的還原峰電流后即為過氧化月桂酰的催化還原電流值，然后利用Origin軟件計算過氧化月桂酰的催化還原電流值與其濃度之間的校正曲線模型。

1.3.5 有機相HRP法測定植物油樣品的過氧化值

取0.5～2.0 g的植物油樣品置于25 mL的容量瓶，隨后加入0.40 mL的0.1 mol/L的乙醇硫酸溶液，0.5 mL的1.0 mol/L的乙醇-氯化鋰溶液和3.5 mL的1,2-二氯乙烷，然后用乙腈稀釋到最終刻度?；旌先芤杭尤氲诫娀瘜W池中，攪拌溶解并通氮除氧2～5 min，然后在1.0～0.0 V電位范圍內(nèi)，利用方波伏安法進行掃描，記錄過氧化月桂酰還原峰電流值。

2 結(jié)果與分析

2.1 CS-FC/HRP/MWCNTs測定油脂過氧化值原理

利用循環(huán)伏安技術(shù)記錄了玻碳電極和CS-FC/HRP/ MWCNTs酶傳感器在2.0×10－5mol/L過氧化月桂酰的乙腈-1,2-二氯乙烷混合溶液（含0.1 mol/L的LiCl）中的循環(huán)伏安圖以及酶電極在空白溶液中的循環(huán)伏安圖如圖1所示。由圖1A可以看出，裸玻碳電極在掃描電位范圍1.0～0.0 V內(nèi)，沒有任何波峰出現(xiàn)，說明過氧化月桂酰在既無氧化也無還原；而圖1B表明，CS-FC/HRP/ MWCNTs酶傳感器在空白溶液中的循環(huán)伏安圖上出現(xiàn)了一對形狀良好的氧化還原峰，是二茂鐵電子對FCox/ FCred在電極表面的發(fā)生氧化還原反應，這說明二茂鐵能有效地在HRP活性中心和電極表面?zhèn)鬟f電子，氧化峰與還原峰電位差ΔEp200 mV；由圖1C可知，隨著溶液中過氧化月桂酰的加入，CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器的循環(huán)伏安圖中的還原峰電流顯著增大，當溶液中加入2.0×10－5mol/L的過氧化月桂酰時，其還原峰電流與空白溶液時相比增加了35%，而且隨著過氧化月桂酰濃度的增加，其還原峰電流會繼續(xù)增大，而氧化峰電流越來越小，濃度增大到一定程度就基本消失。

電解質(zhì)溶液中的過氧化月桂酰通過擴散至酶傳感器的修飾膜層內(nèi)，將HRP（red）氧化成為氧化態(tài)HRP（ox），而過氧化月桂酰發(fā)生還原反應，而酶膜內(nèi)的二茂鐵作為電子介體，在HRP活性中心與電極表面之間起到快速傳遞電子的作用，使氧化態(tài)的HRP（ox）快速還原，而二茂鐵被氧化，氧化態(tài)二茂鐵在電極表面得電子快速被還原，所以當溶液中加入過氧化月桂?；蚱渌^氧化物時，電極表面的氧化態(tài)二茂鐵濃度增加，因此所形成的還原峰電流顯著增大，而氧化峰電流下降，變?yōu)椴豢赡孢^程，同時由于二茂鐵的電子傳遞作用及多壁碳納米管的增加電流響應作用使得過氧化月桂酰還原反應的活化能下降，因此其還原峰電位略微正移，這說明CSFC/HRP/MWCNTs酶傳感器對油脂中的過氧化物有良好的還原催化作用，其催化還原機理如下：

酶傳感器內(nèi)HRP的氧化還原過程：

根據(jù)HRP傳感器研究資料，HRP電極對過氧化月桂酰等脂質(zhì)過氧化物的還原催化機理與催化H2O2的過程基本一致，只是二者的催化反應速率和傳質(zhì)速率有所不同，主要與兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、分子大小、溶解性等有關[19]。

圖1 循環(huán)伏安圖Fig.1 Voltammograms

在上述電解質(zhì)溶液中，CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器的氧化峰和還原峰電流響應隨著電位掃描速率的增加（10、20、30、50、100、150、200 mV/s）而增加，氧化峰電流和還原峰電流與掃描速率平方根的線性關系分別為：y=0.017 3x＋0.055 8及y=0.005 9x＋0.059 7，線性相關系數(shù)R2分別為0.998與0.991，還原峰電流Ipred與v1/2呈線性關系，而氧化峰電流Ipox與v1/2線性關系略差，這說明HRP傳感器在過氧化月桂酰溶液中的電極過程是不可逆的，HRP傳感器的電化學反應屬于表面電化學控制過程而非蛋白質(zhì)擴散控制過程，因為HRP的氧化還原與電子介體-二茂鐵在電極表面的氧化還原速率有關，而不是HRP中的電子傳遞到電極表面發(fā)生氧化還原反應的。

2.2 CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器的微觀結(jié)構(gòu)表征

利用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）對所制備的CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器表面微觀結(jié)構(gòu)進行了表征，圖2為各種修飾膜在放大30萬 倍條件下的掃描電鏡圖。圖2A為裸玻碳電極上修飾一層CS薄膜的掃描電鏡圖。圖2B為裸玻碳電極上修飾一層MW-CS薄膜的掃描電鏡圖，從圖2B可以明顯看出MWCNTs呈現(xiàn)特有的非常規(guī)整的多孔網(wǎng)狀納米纖維結(jié)構(gòu)，且多壁碳納米管的前處理使得C管末端斷裂并羧基化與羥基化，有利于酶的固定。這種結(jié)構(gòu)會增加酶傳感器的表面積，從而使更多的酶量固定到電極表面，并且可以有效防止HRP從傳感器上脫附泄漏，提高傳感器靈敏度。圖2C為HRP修飾到MWCNTs-CS復合膜上時的掃描電鏡圖?？梢钥闯鲂揎椖こ深w粒狀，結(jié)構(gòu)較疏松，HRP分子很好地嵌到了MWCNTs-CS膜的空隙當中。因此，根據(jù)電鏡掃描結(jié)果可以得知，MWCNTs-CS膜用來固定酶會擁有較大的比表面積，能夠固載更多HRP量，增加電極響應靈敏度，減少響應時間。

圖2 不同修飾膜層的電鏡掃描圖Fig.2 SEM pictures of different modified membrane layers

2.3 制備生物酶傳感器工藝參數(shù)優(yōu)化

2.3.1 有機相溶劑及電解質(zhì)對酶傳感器性能的影響

有機溶劑顯著影響酶的構(gòu)象及功能，所以對于有機相酶傳感器來說，選擇適宜的有機相溶劑對保證酶的活性及催化能力、電流響應靈敏度等十分重要。本實驗所研究的HRP傳感器用于測定油脂中的脂質(zhì)過氧化物，有機相溶劑的選擇遵考慮以下4點：1） 所選有機溶劑能最大限度保證HRP的生物活性與催化功能，不會致使HRP失活；2）可對油脂樣品與支持電解質(zhì)有良好的溶解性；3）介電性質(zhì)良好，保證電解質(zhì)溶液具有良好的導電性能，降低遷移電流對分析測定的影響；4）所選有機溶劑的動力學黏度系數(shù)（η）要盡可能小，溶液中待測底物的傳質(zhì)阻力就小，催化反應速度就會提高，電流響應時間就會減少，HRP電極的催化電流響應也會增加。綜合考慮選擇1,2-二氯乙烷-乙腈作為作為有機相溶劑。

選擇合適的支持電解質(zhì)可增強溶液的導電性，降低有機溶劑的電阻，減小或消除電遷移電流。支持電解質(zhì)需要滿足以下條件：1）在所選溶劑中有足夠的溶解度；2）本身不會在電極上發(fā)生氧化還原反應，不會對電極反應產(chǎn)生干擾，且應有較寬的電位窗口；3）價格低廉，容易購得；4）毒性和危險性較小。根據(jù)本課題組以前研究的資料，選用氯化鋰作為支持電解質(zhì)，氯化鋰的濃度對HRP傳感器的響應電流的影響如圖3所示，隨著氯化鋰濃度的增加，HRP傳感器的氧化還原峰電流顯著增加，但當其濃度大于0.1 mol/L后，電流開始呈下降趨勢，這可能是由于高濃度的氯化鋰對HRP的活性有破壞作用，所以選擇氯化鋰為支持電解質(zhì)，濃度為0.1 mol/L。

圖3 支持電解質(zhì)濃度對峰電流的影響Fig.3 Influence of supporting electrolyte concentration on peak current

2.3.2 HRP的固定量對酶傳感器性能影響

HRP傳感器的固定酶量會直接影響其對脂質(zhì)過氧化物的催化還原響應電流的大小。分別配制0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL 8個質(zhì)量濃度的HRP的PBS溶液，均取5 μL的HRP溶液按1.3.1節(jié)的方法制備8 支HRP傳感器，然后于2×10－5mol/L過氧化月桂酰溶液中進行循環(huán)伏安掃描，記錄過氧化月桂酰溶液的還原電流增量ΔIpred，并作出ΔIpred與HRP質(zhì)量濃度之間的關系曲線如圖4所示。由圖4可知，隨著HRP質(zhì)量濃度的增加即HRP固定量的增加，HRP傳感器對過氧化月桂酰的催化還原電流增量逐漸增加，當酶質(zhì)量濃度逐漸增加到4 mg/mL時，還原電流增量達到最大，而后隨著HRP質(zhì)量濃度持續(xù)增加而有所下降隨后基本恒定。

HRP質(zhì)量濃度較低時，以“三明治”式結(jié)構(gòu)包埋在殼聚糖-多壁碳納米管膜內(nèi)的HRP量較少，所以當CSFC/HRP/MWCNTs酶傳感器與過氧化月桂酰作用時，沒有足夠的酶量用來催化過氧化月桂酰的還原，HRP電催化反應速率就較慢，所以過氧化月桂酰還原電流增量就較低；而當緩沖液中HRP質(zhì)量濃度增加即HRP的固定量增加時，酶傳感器對過氧化月桂酰催化反應越充分，其還原電流就越大；但當HRP質(zhì)量濃度大于4.0 mg/mL時，固定到酶傳感器的HRP量相對脂質(zhì)過氧化物呈現(xiàn)過剩狀態(tài)，這時其還原響應電流的基本上趨于穩(wěn)定，綜合考慮靈敏度和成本因素，選擇4.0 mg/mL為最適HRP質(zhì)量濃度。

圖4 HRP質(zhì)量濃度對還原峰電流響應的影響Fig.4 Influence of HRP concentration on reductive peak current response

2.3.3 電解質(zhì)溶液pH值對酶傳感器性能的影響

pH值是影響酶催化反應速率與酶生物活性的重要因素之一，當將酶固定到電極上時，因固定化材料的的緣故，酶的最適pH值可能會發(fā)生一些變化，所以有必要研究pH值對酶傳感器的電流響應的影響。選擇pH 5.0～9.0時，在過氧化月桂酰濃度為2×10－5mol/L時，考察不同pH值條件下HRP傳感器的催化還原電流增量的變化，結(jié)果如圖5所示。pH 7.0時電流值響應達到最大值，正好與HRP的最適pH值7.2相接近，說明殼聚糖生物兼容性良好，并未對HRP的構(gòu)象等造成影響。因此，溶液的pH值選為7.0。

圖5 溶液pH值對過氧化月桂酰還原峰電流的影響Fig.5 Influence of pH value on reductive peak current of lauroyl peroxide solution

2.3.4 電子介體濃度對酶傳感器性能的影響

電子介體濃度是影響HRP傳感器性能的一個重要因素。分別取0.001、0.005、0.01、0.05、0.08、0.1 mol/L濃度的二茂鐵溶液，按照1.3.1節(jié)的方法6 支HRP傳感器，在含2×10－5mol/L的過氧化月桂酰的有機相電解質(zhì)溶液中進行循環(huán)伏安掃描，記錄其還原電流響應值，結(jié)果如圖6所示。HRP傳感器對過氧化月桂酰的催化還原電流響隨著二茂鐵濃度增加而增大，當二茂鐵濃度達到0.05 mol/L時，電流響應值達到最大，隨后開始隨著濃度的增大而逐漸減小。因為二茂鐵在低濃度范圍內(nèi)時，電極的電流響應受媒介體動力學控制，當二茂鐵濃度增大到一定值時，電流響應開始受酶底物動力學控制。二茂鐵屬于疏水性的有機金屬絡合物，通過將其固定包埋在殼聚糖中，使其不易流失，從而能夠提高傳感器的穩(wěn)定性。因此，選用濃度為0.05 mol/L的二茂鐵作為最佳電子介體。

圖6 電子介體濃度對電流響應的影響Fig.6 Influence of electronic medium concentration on current response

2.3.5 電化學參數(shù)的選擇

方波伏安法是一種快速、高效、多功能、高靈敏度，適用廣泛的電分析方法。該方法掃描速度快，能較好地抑制背景電流，減小噪聲的影響，從而提高信噪比降低檢測限。該法較差分脈沖伏安法響應更快、靈敏度更高。過氧化月桂酰的方波伏安圖如圖7所示，實驗條件為前述所定最適實驗條件。電位范圍1.0～0.0 V、方波頻率2.0 Hz、電位增量1 mV、方波幅度0.02 V、等待時間2 s時，還原峰電流響應最好，峰形良好。

圖7 過氧化月桂酰的方波伏安圖（濃度為4×10－5mol/L）Fig.7 Square wave voltammogram of 4 × 10－5mol/L lauroyl peroxide

綜上所述，最終確定的最佳電化學分析參數(shù)如下：1,2-二氯乙烷為最宜有機溶劑；0.1 mol/L乙醇-氯化鋰為最宜支持電解質(zhì)，乙醇硫酸濃度6 mmol/L，電位范圍1.0～0.0 V、方波頻率2.0 Hz、電位增量1 mV、方波幅度0.02 V、等待時間2 s。在該參數(shù)下，峰形良好，靈敏度較高。

2.4 酶電極的重復性和穩(wěn)定性

按1.3.1節(jié)方法及優(yōu)化條件制備15 支CS-FC/HRP/ MWCNTs酶傳感器，采用方波伏安法對4×10－5mol/L過氧化月桂酰進行重復性實驗測定研究，測定結(jié)果的過氧化月桂酰催化還原電流增量平均值為3.72 μA，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.5%，證明該法制備的HRP傳感器具有良好的重復性。同樣方法制備一支CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器，對4×10－5mol/L過氧化月桂酰進行6次測定，平均響應電流為（3.68±0.02）μA，RSD為2.10%。同樣方法制備的CS-FC /HRP/MWCNTs酶傳感器置于4 ℃的冰箱保存，1 周后其電流響應為初始電流響應值的98%，4 周后電極響應為到初始值的95%。由此表明本實驗制備的CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器具有良好的可重復性與穩(wěn)定性，這主要是因為多壁碳納米管與殼聚糖生物相容性好，所選有機相溶劑合理，能較好地保持辣根過氧化物酶的活性。

2.5 CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器對脂質(zhì)過氧化物的催化還原電流與脂質(zhì)過氧化物濃度之間的關系

圖8 HRP傳感器催化過氧化月桂酰還原電流與其濃度的關系Fig.8 Calibration curve of reductive current response of HRP enzyme sensor against lauroyl peroxide concentration

按標準加入法配制一定梯度濃度的過氧化月桂酰的乙醇溶液，在最優(yōu)實驗條件下進行方波伏安掃描并分別記錄不同濃度的過氧化月桂酰在CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器上的催化還原峰電流值，如圖8所示，每一個濃度樣品均做3 次平行實驗，以3 次還原電流的平均值作為過氧化月桂酰的還原電流值，然后減去空白對照樣時CSFC/HRP/MWCNTs酶傳感器在電解質(zhì)溶液中還原峰電流值即得到該濃度的過氧化月桂酰在CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器上的催化還原電流增量。以催化還原峰電流增量為縱軸，過氧化月桂酰的濃度為橫軸作圖，得到二者的校正曲線方程y =0.108 53 x－0.354 8，R2=0.992 3（式中：y為過氧化月桂酰在CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器上的催化還原電流增量/μA；x為有機相電解質(zhì)溶液中過氧化月桂酰的濃度/（mol/L））。線性檢測范圍為2.5×10－6～3.0×10－5mol/L，最低檢測限為2.0×10－7mol/L（RSN=3），檢測靈敏度為1.08×10－5μA/（mol/L）。CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器的電化學 催化還原電流響應隨著過氧化物濃度的增加而增加，且響應靈敏迅速，單次樣品測定分析只需45～60 s，檢測結(jié)果的精確性、準確性、所需時間均好于Mannino等[20]的報道。

2.6 實際植物油樣品過氧化值的測定

利用CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器法測定了4 種市售植物油（大豆油、花生油、玉米油和葵花籽油）的過氧化值，為了驗證該方法的有效性，同時利用國標碘量法測定同一植物油樣的過氧化值，并加以對比，測定結(jié)果如表1所示，CS-FC/HRP/MWCNTs酶傳感器法測定樣品如圖9所示。采用HRP傳感器法測定實際植物油樣品的過氧化值時，無需對植物油樣品進行預處理。準確稱取0.5 g的油樣品置于10 mL的電解池中，隨后加入3.5 mL的1.0 mol/L乙醇-氯化鋰溶液、1.5 mL的乙腈，攪拌均勻并通氮除氧2 min，然后進行方波伏安掃描，并記錄其脂質(zhì)過氧化物的催化還原峰電流。每個植物油樣品平行測定3 次，其平均值作為植物油樣品過氧化物的還原峰電流，帶入2.5節(jié)中校正曲線，計算得到其過氧化物值；碘量法測定按照GB/T 5538—2005 《動植物油脂：過氧化值測定》進行。

表1 HRP傳感器法與國標碘量法測定植物油樣過氧化值的結(jié)果Table1 Determination of peroxide value of vegetable oils by HRP enzyme sensor method vs iodometric titration

圖9 玉米油樣品方波伏安圖Fig.9 Square wave voltammogram of corn oil sample

由表1可知，HRP傳感器法所測得的植物油樣的過氧化值與國標碘量法所測結(jié)果基本一致，RSD小于5%。圖9表明，該酶傳感器在玉米油樣中的方波伏安圖出現(xiàn)兩個峰，其中峰1為玉米油中過氧化物的還原峰，峰2可能是植物油中含有的其他能被HRP所催化反應的其他物質(zhì)，但對峰1不產(chǎn)生干擾。

3 結(jié) 論

采用殼聚糖為固定化材料，制備了有機相CS-FC/ HRP/MWCNTs酶傳感器。該酶傳感器對脂質(zhì)過氧化物等有機過氧化物的還原具有顯著催化作用。用循環(huán)伏安法研究了過氧化物在該電極上的電化學行為，并對分析條件進行了優(yōu)化，該修飾電極對過氧化物的催化氧化電流與其濃度在2.5×10－6～3.0×10－5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，該方法檢測限為2.0×10－7mol/L。利用該酶傳感器法對市售4 種植物油中的過氧化值進行測定，所測結(jié)果與國標碘量法測定結(jié)果基本一致，而且該方法的靈敏度、準確度較高，能有效避免油樣自身的顏色對檢測結(jié)果的影響，所需植物油樣量小且無需任何預處理，故該法可用于油脂及含油食品過氧化值的測定。

[1] 盧艷杰, 龔院生, 張連富. 油脂檢測技術(shù)[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2004: 134-254.

[2] 李書國, 李雪梅, 陳輝. 我國食用油質(zhì)量安全現(xiàn)狀、存在問題及對策研究[J]. 糧食與油脂, 2005(12): 3-6.

[3] 韓玉蓮. 油脂氧化常用檢測方法及其評價[J]. 中國食品衛(wèi)生, 1994, 6(1): 57-60.

[4] 梅盛華, 張偉忠, 劉馬英. 碘量比色法測定食品油脂中過氧化值的研究[J]. 海峽預防醫(yī)學, 2000, 6(2): 48-49.

[5] 李遂勤. 可見分光光度法與碘量法測定食用植物油過氧化值的比較[J]. 河南預防醫(yī)學, 2001, 12(3): 147-148.

[6] DOBARGANES M, VELASCO J. Analysis of lipid hydroperoxides[J]. European Journal of Lipid Science and Technology, 2002, 104(7): 420-428.

[7] 戴晉生, 曹素芳, 尚瑛達. 測定食用植物油中過氧化值方法改進[J].西部糧油科技, 2001, 26(6): 51-52.

[8] 江秀明, 周長智, 李建偉. 可見分光光度法測定食用油過氧化值[J].鄭州糧食學院學報, 1999, 20(2): 55-57.

[9] 應太林, 王朝瑾, 劉海鷹. Nafion膜固定的亞甲基藍為介體的生物傳感器[J]. 生物化學與生物物理進展, 1997, 24(3): 254-258.

[10] WANG J, DEMPSEY E, EREMENKO A. Organicphase biosensing of enzyme inhibitors[J]. Analytica Chemica Acta, 1993, 279(2): 203-208.

[11] CAMPANELLA L, de SANTIS G, FAVERO G, et al. Two OPEEs (organic phase enzyme electrodes) used to check the percentage water content in hydrophobic foods and drugs[J]. Analyst, 2001, 126: 1923-1928.

[12] 李書國, 薛文通, 張惠. 食用油脂過氧化值分析檢測方法研究進展[J].糧食與油脂, 2007(7): 35-38.

[13] WANG J. Organic-phase biosensors-new tools for flowanalysis: a short review[J]. Talanta, 1993, 40(12): 1905-1909.

[14] KONASH A, MAGNER E. Characterization of an organic phase peroxide biosensor based on horseradish peroxidase immobilized in eastman AQ[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2006, 22(1): 116-123.

[15] CHUT S L, LI J. Reagentless amperometric determination of hydrogen peroxide by Silica Sol-Gel modified biosensor[J]. Journal of the Electrochemical Society, 1998, 448: 69-77.

[16] 李書國, 陳輝, 李雪梅. Nafion/MB/HRP酶電極的制備及在測定植物油過氧化值中的應用[J]. 中國糧油學報, 2009(2): 106-112.

[17] OSINA M A, BOGDANOVSKAYA V A, TARASEVICH M R. Bioelectrocatalytic reduction of peroxide compounds on the peroxidase-nafion composite[J]. Russian Journal of Electrochemistry, 2004, 40(8): 802-812.

[18] BI Huaqing, LI Yanhui, LIU Shufeng, et al. Carbon-nanotube-modified glassy carbon electrode for simultaneous determination of dopamine, ascorbic acid and uric acid: the effect of functional groups[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2012, 171/172: 1132-1140.

[19] 張凌燕, 袁若, 柴雅琴, 等. 基于辣根過氧化物酶/納米金/辣根過氧化物酶/多壁納米碳管修飾的過氧化氫生物傳感器的研究[J]. 化學學報, 2006, 64(16): 1711-1715.

[20] MANNINO S, COSIO M S. Determination of peroxide value in vegetable oils by an organic-phase enzyme electrode[J]. Analytical Letters, 1994, 27(2): 299-308.

An Organic Phase Horseradish Peroxidase Sensor Based on Nanomaterials for the Determination of Peroxide Value in Vegetable Oils

WANG Li-ran, ZHANG Yuan-yuan, LI Shu-guo*
(College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China)

An organic phase chitosan-ferrocene horseradish peroxidase multiwalled carbon nanotubes (CS-FC/HRP/ MWCNTs) enzyme sensor for the determination of peroxide value of vegetable oils was studied. The catalytic effect of CS-FC/HRP/MWCNTs enzyme sensor on the electrochemical reduction of lipid hydroperoxide in organic phase was investigated by cyclic voltammetry. The mechanism of the redox process of lauroyl peroxide and HRP was expounded. The electrode process of CS-FC/HRP/MWCNTs enzyme-based sensor was typically controlled by the electrochemical reaction on the electrode surface, instead of the diffusion of HRP protein. The micro-grid structure in three dimensions which facilitated electrocatalytic reaction of enzyme sensor was observed by scanning electron microscopy technique (SEM). The increase in catalytic reduction current of lauroyl peroxide at the CS-FC/HRP/MWCNTs enzyme sensor was linearly correlated with substrate concentration in the range of 2.5 × 10-6－3.0 × 10-5mol/L (y = 0.108 5x - 0.354 8, R2= 0.992 3). Meanwhile, the limit of detection of this enzyme sensor was 2.0 × 10-7mol/L (RSN= 3). The developed method was applied to the determination of peroxide value of soybean oil and grapeseed oil, and the results well agreed with those obtained by the classical iodometric titration method. Being more precise and accurate than iodometric titration method, it is a practical method for rapid determination of peroxide value in vegetable oils.

organic phase enzyme sensor; multi-walled carbon nanotube; vegetable oil; determination of peroxide value

TS227

A

1002-6630（2014）20-0119-07

10.7506/spkx1002-6630-201420024

2013-12-24

國家自然科學基金面上項目（20876165）；河北省教育廳科技項目（2009329）

王麗然（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學與安全。E-mail：963673369@qq.com

*通信作者：李書國（1969—），男，教授，博士，研究方向為糧油食品科學與安全技術(shù)。E-mail：shuguolee@126.com