奶粉中游離氨基酸的提取工藝參數(shù)優(yōu)化及同時(shí)測定

加列西·馬那甫，德娜·吐熱汗，李俊芳

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)數(shù)理學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

奶粉中游離氨基酸的提取工藝參數(shù)優(yōu)化及同時(shí)測定

加列西·馬那甫1，德娜·吐熱汗2，李俊芳1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)數(shù)理學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

根據(jù)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對影響奶粉游離氨基酸提取量的料液比、硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)和離心時(shí)間3 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，并采用偏最小二乘法對以上游離氨基酸的模擬混合試樣進(jìn)行同時(shí)測定。結(jié)果表明，奶粉游離氨基酸的最佳提取條件為料液比1∶3.02（g/mL）、沉淀劑中硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.23%、離心時(shí)間6.79 min，在此條件下，提取量為170 μg/g。硫酸銅與甘氨酸、谷氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸反應(yīng)生成的絡(luò)合物，由于吸收光譜重疊嚴(yán)重，用光度法難以對單一組分進(jìn)行同時(shí)測定。偏最小二乘法對游離氨基酸的模擬混合試樣進(jìn)行同時(shí)測定的結(jié)果顯示，回收率98.2%～99.2%；相對預(yù)報(bào)誤差為1.7%～2.9%。

奶粉；游離氨基酸；響應(yīng)面分析法；提??；偏最小二乘法；同時(shí)測定

牛奶中的游離氨基酸對人體疾病的康復(fù)和預(yù)防起著重要的保健作用，對牛奶的鮮度、滋味、色澤有較明顯的影響，是形成乳制品香氣和鮮爽度的重要成分；其主要以甘氨酸、谷氨酸的形式存在，且含量一定；而有些氨基酸在人體內(nèi)不能被合成，必須從食品或藥品中得到。為了提高蛋白質(zhì)的含量或改善牛奶的口感，在乳制品中添加單一的氨基酸而造成產(chǎn)品質(zhì)量不合格的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此對乳制品游離氨基酸的提取和分析測定是非常必要的[1-4]。

食品中氨基酸的分析方法主要有滴定法、毛細(xì)管電泳、色譜法、氨基酸測定儀、光度法等[5-15]。滴定法只能測定總氨基酸含量；色譜法和氨基酸測定儀具有選擇性好、靈敏度高等特點(diǎn)，但對于多組分存在使用儀器、試劑昂貴且有污染等問題；光度法作為一種傳統(tǒng)的分析方法，具有操作簡便快速、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，但對于多組分的同時(shí)測定，由于組分間吸收光譜重疊，無法對單一組分進(jìn)行同時(shí)測定。響應(yīng)面法結(jié)合偏最小二乘-光度法提取、同時(shí)測定奶粉游離氨基酸的含量尚未見報(bào)道。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化奶粉游離氨基酸的提取工藝，偏最小二乘（partial least squares，PLS）法對光譜重疊的甘氨酸、谷氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸4組分的模擬樣品進(jìn)行同時(shí)測定，并建立食品游離氨基酸多組分同時(shí)定量分析的多元校正方法[5,16-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

袋裝奶粉購于烏魯木齊市超市。甘氨酸、谷氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、氨水、乙醇、蘇丹紅l號、乙醚、石油醚、硫酸銅均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TV-1810型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL204-IC型電子分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；WC/09-05恒溫水浴槽 上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 模擬試樣測定

精取適量20 mg/mL甘氨酸、8 mg/mL谷氨酸、12 mg/mL纈氨酸和4 mg/mL苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10.00 mL容量瓶中，加4.5 mL 0.1 mol/L硫酸銅溶液，加水定容至刻度，搖勻，配制成各單組分或4組分混合溶液，在600～900 nm波長范圍，間隔1 nm對各單組分進(jìn)行光譜掃描，得到吸收光譜圖，并在此波長范圍讀取各單組分或4 組分混合溶液的吸光度。測定結(jié)果用PLS處理。

1.3.2 樣品游離氨基酸的提取

精稱5.000 g奶粉樣品，置于100.0 mL容量瓶中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸鋅和10%亞鐵氰化鉀溶液各10 mL，搖勻，定容至刻度，靜置沉淀，離心10 min，過濾。

1.3.3 樣品游離氨基酸含量測定

精取樣品濾液10.00 mL，移入具塞量筒中，加2 mL氨水，60 ℃水浴加熱5 min，冷卻至室溫，加10 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，移入分液漏斗中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%蘇丹紅l號溶液2 滴，搖勻，分別加入25 mL無水乙醚和石油醚，振搖30 s，敞開靜置30 min，分取下層溶液，重復(fù)上述操作兩次。分取液置于50 mL燒杯中，于80 ℃水浴加熱除去氨水和乙醇、乙醚、石油醚。移至50.00 mL容量瓶中，加水定容至刻度。精取4 mL，于10.00 mL容量瓶中加4.5 mL硫酸銅溶液，加水稀釋至刻度。在600～850 nm波長范圍間隔1 nm測定吸光度A，計(jì)算游離氨基酸含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以市售袋裝奶粉為原料，研究料液比、沉淀劑中硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)（亞鐵氰化鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為10%）和離心時(shí)間3 個(gè)因素對奶粉游離氨基酸提取量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化奶粉游離氨基酸提取條件

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法，在三因素三水平上對奶粉游離氨基酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。以料液比（A）、硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）和離心時(shí)間（C）3 個(gè)因素為自變量，游離氨基酸提取量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對游離氨基酸提取量的影響

保持硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%和離心時(shí)間10 min不變，料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g/mL）時(shí)，考察奶粉游離氨基酸提取量的變化。

圖1 料液比對奶粉游離氨基酸提取量的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of free amino acids

圖1結(jié)果表明，隨著液體含量的增加，提取量逐漸升高，料液比達(dá)到1∶3時(shí)提取效果最佳，但當(dāng)液體含量繼續(xù)增加時(shí)提取量有所下降。由于用干燥材料實(shí)驗(yàn)時(shí)材料吸水量大，料液比在1∶3之前，提取液被材料所吸收，不易過濾分離，從提取量及節(jié)約成本等方面考慮，料液比以1∶3為宜。

2.1.2 硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)對游離氨基酸提取量的影響

保持料液比、離心時(shí)間和亞鐵氰化鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變，硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、7.5%、10%、12.5%和15%時(shí)，考察其對奶粉游離氨基酸提取量的影響。

圖2結(jié)果表明，隨著硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，提取量逐漸升高，硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%提取效果最佳，但當(dāng)硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)提取量有所下降趨勢。這是由于沉淀劑中硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí)，樣品所含有的蛋白質(zhì)徹底被沉淀，游離氨基酸的提取量最高，因此選擇10%為最佳硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖2 沉淀劑中硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)對游離氨基酸提取量的影響Fig.2 Effect of zinc sulfate concentration on the extraction efficiency of free amino acids

2.1.3 離心時(shí)間對游離氨基酸提取量的影響

保持其他條件不變，離心時(shí)間分別為2、5、10、15、20 min時(shí)，考察奶粉游離氨基酸提取量的變化。

圖3 離心時(shí)間對游離氨基酸提取量的影響Fig.3 Effect of centrifugation time on the extraction efficiency of free amino acids

從圖3可看出，隨著離心時(shí)間的延長，提取液與蛋白質(zhì)沉淀的分層更徹底，緊接著游離氨基酸的提取量也呈增加趨勢，在離心10 min以后，蛋白質(zhì)沉淀徹底，提取液澄清。考慮到提取效率等因素，離心時(shí)間選擇在10 min為宜。

2.2 奶粉游離氨基酸提取工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table2 Response surface design arrangement and experimental results

2.2.2 模型的建立與方差分析

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用SAS 9.1.3軟件，對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得料液比（A）、硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）和離心時(shí)間（C）與奶粉游離氨基酸提取量的二次多元回歸方程為：

Y=120.250 00＋16.375 00A＋1.250 00B＋1.825 00C－0.050 000AB＋0.050 000AC－0.020 000BC－1.875 00A2－0.021 250B2－0.075 000C2

對表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析表Table3 Analysis of variance for the regression model

由表3方差分析可知，方程模型F值為92.37%，P＜0.05，表明回歸模型顯著；失擬項(xiàng)F值為0.75，P值為0.614 8＞0.05，表明失擬項(xiàng)相對于絕對誤差是不顯著的，說明該回歸方程對試驗(yàn)擬合情況較好。各因素中一次項(xiàng)A顯著；二次項(xiàng)中B極顯著，A、C顯著；交互項(xiàng)不顯著。由此可見，各具體試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of operating parameters on the extraction efficiency of free amino acids

為了觀察某兩個(gè)因素及其交互作用同時(shí)對提取量的影響，將其他因素條件保持不變，獲得某兩個(gè)因素及其交互作用對提取量影響的響應(yīng)面圖，從而確定因素的最佳水平范圍；響應(yīng)面坡度的平緩與陡峭程度，表明在處理?xiàng)l件發(fā)生變異時(shí)奶粉游離氨基酸提取量的響應(yīng)靈敏程度。由圖4可知，奶粉游離氨基酸的提取中料液比與硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比與離心時(shí)間、硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)與離心時(shí)間的交互作用不顯著，與表3中交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致。

2.2.3 最佳提取條件的確定

通過軟件SAS 9.1.3求解方程，得到奶粉游離氨基酸的最佳提取條件為料液比 1∶3.02（g/mL）、硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.23%、離心時(shí)間6.79 min；對應(yīng)的理論提取量響應(yīng)值為170 μg/g。該回歸方程與實(shí)際情況很吻合，說明響應(yīng)面優(yōu)化奶粉游離氨基酸的提取條件是可行的。

2.3 吸收光譜

圖5 吸收光譜圖Fig.5 Absorption spectra

由圖5可見，不同氨基酸的吸收光譜譜帶較復(fù)雜，最大吸收波長較接近，且相互重疊。經(jīng)典的光度法以最大吸收點(diǎn)來解析數(shù)據(jù)，不能解決吸收光譜重疊嚴(yán)重的多組分同時(shí)測定問題。在一定波長范圍利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，建立其數(shù)學(xué)模型，才能確定氨基酸質(zhì)量濃度與光譜間的關(guān)系[19-21]。

2.4 最佳計(jì)算測定條件的確定

2.4.1 吸光度加和性的考察

按1.3.1節(jié)配制4 份不同質(zhì)量濃度的甘氨酸、谷氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)模擬混合試樣和相應(yīng)質(zhì)量濃度的各純標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的波長處測定吸光度，比較混合體系吸光度A與4 組分純?nèi)芤旱奈舛燃雍螦0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體系的|A－A0|∕A0均大于0.1，體系吸光度的加和性不好。如果體系的吸光度加和性好，體系不能用多元校正法同時(shí)測定多組分混合物，因?yàn)樽罴盐展庾V區(qū)域在同一個(gè)波長范圍。如果沒有加和性，說明體系的吸收光譜相互沒有干擾，單獨(dú)可以測定每一個(gè)化合物。

2.4.2 波長范圍及間隔的確定

波長范圍及間隔的選擇是建立模型和進(jìn)行計(jì)算的關(guān)鍵步驟[22-23]。為了檢查波長范圍對計(jì)算結(jié)果的影響，根據(jù)吸收曲線，在相同的波長間隔、不同的波長選擇范圍，對同一套模擬混合試樣進(jìn)行PLS計(jì)算，計(jì)算結(jié)果可知，對于此類模擬混合體系，波長范圍的選擇對計(jì)算結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響，選擇波長600～850 nm為最佳。在保證準(zhǔn)確度前提下，選擇2 nm的間隔為宜。

2.4.3 模擬混合試樣的測定

按正交設(shè)計(jì)表L9（34）配制9 組不同質(zhì)量濃度的4組分模擬混合試樣作校正組（表4），建立校正模型，測定不同波長處的吸光度。對另一9 組不同質(zhì)量濃度4組分模擬混合試樣預(yù)報(bào)組進(jìn)行測定，用PLS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果見表5。

表4 模擬混合樣品校正組質(zhì)量濃度組成Table4 Composition of mixed free amino acids in calibration set

表5 模擬混合樣品預(yù)報(bào)組質(zhì)量濃度組成、PLS預(yù)測值及誤差分析Table5 Composition, PLS prediction values and error analysis of mixed free amino acids in prediction set

2.5 市售袋裝奶粉中游離氨基酸測定結(jié)果

表6 樣品測定結(jié)果（n=3）Table6 Results obtained for determination of free amino acids in real samples（n=3）

為了避免在乳制品中添加單一氨基酸而造成產(chǎn)品質(zhì)量不合格的現(xiàn)象，采用PLS對單一氨基酸進(jìn)行同時(shí)測定；如表6所示，市售袋裝奶粉中，甘氨酸含量35 μg/g、谷氨酸含量140 μg/g、纈氨酸含量0.3 μg/g、苯丙氨酸含量0。

3 結(jié) 論

游離氨基酸含量是判定乳制品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，特別是近幾年摻雜單一氨基酸而造成產(chǎn)品質(zhì)量不合格的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，檢測此項(xiàng)目尤為重要。本研究使用硫酸鋅、亞鐵氰化鉀較好地解決了樣品中蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的沉淀問題，避免了維生素、氯化物和碘化物等陰離子成分的干擾。與正交試驗(yàn)相比，響應(yīng)面法在試驗(yàn)條件尋優(yōu)過程中，可以對各水平進(jìn)行分析，研究試驗(yàn)因素間的交互作用，求得高精密度的回歸方程，具有設(shè)計(jì)簡單、精確度高等優(yōu)點(diǎn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化奶粉游離氨基酸的提取工藝，通過擬合方程得到的最佳提取條件為料液比1∶3.02（g/mL）、硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.23%、離心時(shí)間6.79 min，在此條件下，提取量為170 μg/g。由于生成的氨基酸絡(luò)合物吸收光譜重疊，難以分離，無法對單一組分進(jìn)行同時(shí)測定，采用PLS不僅解決因重疊光譜造成測定某些物質(zhì)選擇性差而需進(jìn)行繁瑣的化學(xué)掩蔽和分離等問題，而且對質(zhì)量濃度給出較準(zhǔn)確的預(yù)測，減小測定誤差。對食品游離氨基酸類多組分含量的同時(shí)測定提供新的研究手段，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

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Optimization of Extraction Parameters and Simultaneous Determination of Free Amino Acids in Milk Powder

JIALIEXI Manafu1, DENA Turehan2, LI Jun-fang1
(1. College of Chemical Engineering, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China; 2. College of Mathematics and Physics, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China)

Three variables (operating parameters) affecting the extraction efficiency of free amino acids from milk powder, solid-to-solvent ratio, zinc sulfate concentration (for protein precipitation), and centrifugation time, were optimized by response surface analysis (RSA) based on a Box-Behnken design. Simultaneous determination of mixed free amino acids and free amino acids in milk powder samples was performed by visible spectrophotometry combined with partial least square (PLS). The results showed that under the optimal conditions: solid-to-solvent ratio, 1:3.02 (g/mL); zinc sulfate concentration, 10.23%; and centrifugation time, 6.79 min, the extraction yield was 170 μg/g. The complexation of copper sulfate with glycine, glutamic acid, valine and phenylalanine resulted in highly overlapping absorption spectra when mixed together, which made it difficult to simultaneously determine the individual components. The simultaneous determination of mixed free amino acids using PLS demonstrated that the recovery rate was 98.2%-99.2% and the relative prediction error (RPE) was 1.7%-2.9%.

milk power; free amino acids; response surface analysis; extraction; partial least squares; simultaneous determination

TS201.1

A

1002-6630（2014）20-0093-05

10.7506/spkx1002-6630-201420019

2014-01-13

加列西·馬那甫（1964—），男，副教授，學(xué)士，研究方向?yàn)閷?shí)用藥物分析。E-mail：jialiexi@sina.cn