綠原酸納米脂質(zhì)體制備與抑菌性分析

徐賢柱，魏 允，饒 華，王曼瑩

（1.江西亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室，江西 南昌 330022；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022）

綠原酸納米脂質(zhì)體制備與抑菌性分析

徐賢柱，魏 允，饒 華，王曼瑩*

（1.江西亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室，江西 南昌 330022；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022）

目的：研究綠原酸納米脂質(zhì)體制備及其抑菌性。方法：采用薄膜超聲法制備綠原酸納米脂質(zhì)體，并用掃描電鏡和粒度儀分析測定其形貌及粒徑，考察膜材比、藥脂比及超聲時間對包封率的影響，最后對其體外穩(wěn)定性和抑菌能力進行評價。結(jié)果：膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比1∶8、綠原酸與膜材質(zhì)量比1∶10、超聲時間15 min所制備的綠原酸納米脂質(zhì)體呈橢圓形，形態(tài)規(guī)整，粒徑在110 nm左右，分散性良好，包封率和載藥量最高分別達到87.5%和36%；紫外測試表明綠原酸被成功包覆在脂質(zhì)體中；體外緩釋實驗表明，在24 h和14 d中綠原酸納米脂質(zhì)體均釋放穩(wěn)定；在抑菌實驗中，綠原酸納米脂質(zhì)體與綠原酸和四環(huán)素相比具有更持久的抑菌能力。結(jié)論：采用薄膜超聲法制備的綠原酸納米脂質(zhì)體具有很好的形貌和分散性能，也具有很好持續(xù)抑菌能力。

綠原酸；脂質(zhì)體；制備；抑菌

綠原酸（chlorogenic acid，CA）是從杜仲、金銀花和蒲公英等植物中提取出來的一種活性物質(zhì)，具有較多的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、清除自由基等，是保健品、食品、藥品、化妝品等的重要原料[1-6]。由于綠原酸難溶于水，在腸道中吸收差，所以應(yīng)用過程中受到很大的阻礙。綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3 個不穩(wěn)定部分，在體內(nèi)易被蛋白質(zhì)滅活而失去活性。

研究表明，綠原酸作為一種抗氧化劑，可以有效保護皮膚免受紫外線的傷害，綠原酸-磷脂復(fù)合物可以顯著延長保護時間達4 h以上[7]。

脂質(zhì)體包裹的藥物可以有效地提高其穩(wěn)定性和在體內(nèi)的吸收。脂質(zhì)體[8-10]是由膽固醇和卵磷脂形成的一種微型腔室，具有生物相溶性好、無毒、無免疫原性等優(yōu)點，修飾后，能增強靶向性，提高藥物的療效，更重要的是它還具有緩釋的功能，對脂溶性藥物包封性好，改變傳統(tǒng)給藥途徑。關(guān)于綠原酸脂質(zhì)體制備的研究還不多見，本研究采用薄膜分散超聲方法制備CA納米脂質(zhì)體，考察膜材比（m（膽固醇）∶m（卵磷脂））、藥脂比（m（CA）∶m（膜材））、超聲時間對其包封率的影響，并對CA納米脂質(zhì)體在體外的穩(wěn)定性和抑菌效果進行評價，對其形貌和粒徑進行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠原酸（色譜純，純度＞99%） 湖南遠航生物科技有限公司；大豆卵磷脂 上海藍季科技有限公司；膽固醇 上海伯奧生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌 江西師范大學(xué)生命學(xué)院微生物實驗室；四環(huán)素 上海生工生物工程有限公司；無水乙醇、乙醚、氯仿、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DelsaNano S粒度儀 美國貝克曼公司；S-3400N掃描電子顯微鏡、U-331紫外-可見光分光光度計 日本Hitachi公司；UV-vis8453紫外吸收光譜儀 美國安捷倫公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CA納米脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散超聲法[11]，按比例精確稱取大豆卵磷脂、膽固醇，加入15 mL氯仿溶解，120 r/min轉(zhuǎn)速、35 ℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)除去氯仿。加入乙醇溶解的CA溶液，120 r/min轉(zhuǎn)速、50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇。加入pH 7.2的磷酸緩沖液10 mL和適量玻璃珠，120 r/min轉(zhuǎn)速、37 ℃旋轉(zhuǎn)，待溶液渾濁，超聲，得CA納米脂質(zhì)體。

1.3.2 CA的紫外檢測

采用紫外-可見分光光度法在327 nm波長處測定[12]。

1.3.3 包封率和載藥量的測定[13-14]

稱取100 mg CA溶于乙醇，按上述方法制備CA納米脂質(zhì)體。5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，去上清。用乙醇重懸脂質(zhì)體，5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，去上清，重復(fù)兩次洗滌去除未包封的CA。加入質(zhì)量分數(shù)1%聚乙二醇單辛基苯基醚（Triton）溶液0.5 mL使脂質(zhì)體破損溶出CA，并用PBS液定容，采用紫外-可見光分光光度計測定脂質(zhì)體中CA的質(zhì)量，膜材質(zhì)量為卵磷脂與膽固醇質(zhì)量總和。包封率及載藥量的計算如式（1）、（2）所示。

式中：P1為原料CA質(zhì)量/mg；P2為脂質(zhì)體中CA質(zhì)量/mg；P3為膜材質(zhì)量/mg。

1.3.4 不同條件對包封率及載藥量的影響

固定藥脂比1∶10、超聲時間15min，考察不同膜材比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）對CA納米脂質(zhì)體包封率及載藥量的影響；固定膜材比1∶8、超聲時間15 min，考察不同藥脂比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）對CA納米脂質(zhì)體包封率及載藥量的影響；固定膜材比1∶8、藥脂比為1∶10，考察不同超聲時間（0、5、10、15、20、25 min）對CA納米脂質(zhì)體包封率及載藥量的影響。

1.3.5 脂質(zhì)體形貌及粒徑測定[15]

CA納米脂質(zhì)體分散在無水乙醇中，毛細管取少量滴于硅片表面并通過導(dǎo)電膠粘貼在載物臺上，乙醇揮發(fā)干后噴金，最后用掃描電子顯微鏡觀察脂質(zhì)體的形貌；在不同條件下分別制備5 個樣本，用激光散射粒徑儀測定脂質(zhì)體的平均粒徑和Zeta電位，折射指數(shù)1.33、波長633 nm、入射與散射光束夾角為90o。

1.3.6 脂質(zhì)體穩(wěn)定性測定[16]

將CA納米脂質(zhì)體分散在生理鹽水中，一份在37 ℃條件下200 r/min轉(zhuǎn)速攪拌，分別在0.5、1、2、4、8、12、24 h測定其體外釋放率；另一份在4 ℃存放，分別在第2、4、6、8、10、12、14 d測定體外釋放率。

1.3.7 抑菌實驗[17-18]

將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接入裝培養(yǎng)基斜面上，37 ℃培養(yǎng)24 h，使菌種活化，再將活化好的菌接種到平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h。用生理鹽水將細菌從平板洗脫制成菌懸液，菌落數(shù)調(diào)至1×108CFU/ mL。

用打孔器將濾紙打成6 mm的小片并滅菌，將0.2 mL 1 mg/mL的CA溶液、CA納米脂質(zhì)體、空白脂質(zhì)體、四環(huán)素分別滴加于濾紙片上，控制CA納米脂質(zhì)體中的CA含量為0.2 mg。

分別向培養(yǎng)基表面涂布0.2 mL菌懸液，再將滴加CA溶液、CA納米脂質(zhì)體、空白脂質(zhì)體的濾紙片貼于培養(yǎng)基表面，每個皿貼5 片，用四環(huán)素紙片做對照，37 ℃培養(yǎng)24、36、48、60、72、84、96 h后測定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對CA納米脂質(zhì)體包封率的影響

包封率和膜材比存在較大的關(guān)系，卵磷脂在成膜過程中需要膽固醇調(diào)節(jié)其通透性，當(dāng)膽固醇含量過高時，會引起卵磷脂成膜不穩(wěn)定，從而降低包封率；當(dāng)膽固醇含量過低時，膜的通透性下降，也會降低脂質(zhì)體的包封率。

從圖1a可見，CA納米脂質(zhì)體包封率隨著卵磷脂質(zhì)量的增加而增大，當(dāng)膜材比達到1∶8時，包封率達到最高87.5%。CA納米脂質(zhì)體包封率不會隨藥脂比的改變而存在顯著性差異。

如圖1b所示，超聲時間對CA納米脂質(zhì)體的包封率有顯著影響，當(dāng)超聲時間在15 min時，包封率達到最大值。隨著超聲時間延長有一部分脂質(zhì)體會破裂導(dǎo)致包封率下降。

圖1 膜材比和藥脂比（a）及超聲時間（b）對CA納米脂質(zhì)體包封率的影響Fig.1 Effect of cholesterol/lecithin mass ratio and CA/film mass ratio (a), and ultrasonication time (b) on the encapsulation efficiency of liposomes

2.2 不同因素對CA納米脂質(zhì)體載藥量的影響

圖2 膜材比與藥脂比（a）及超聲時間（b）對CA納米脂質(zhì)體載藥量的影響Fig.2 Effect of cholesterol/lecithin mass ratio and CA/film mass ratio (a), and ultrasonication time (b) on the drug loading of liposomes

載藥量直接關(guān)系到納米脂質(zhì)體的應(yīng)用前景。如圖2a所示，藥脂比和膜材比對CA納米脂質(zhì)體載藥量的影響不顯著；隨著超聲時間延長載藥量會緩慢上升，15 min達到最大載藥量為36%，當(dāng)超聲到20 min時載藥量出現(xiàn)顯著下降，分析其析因可能是超聲時間延長導(dǎo)致脂質(zhì)體破裂，致使載藥量下降明顯。

2.3 CA納米脂質(zhì)體的形貌、粒徑和Zeta電位

表1 CA納米脂質(zhì)體粒徑和Zeta電位Table1 Particle size and zeta potential of CA liposomes

采用膜材比1∶8、藥脂比1∶10、超聲時間15 min條件制備CA納米脂質(zhì)體，用于粒徑和Zeta電位測定。從表1可以看出，CA納米脂質(zhì)體粒徑與膜材比有較大的關(guān)系，當(dāng)膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比在1∶8之后時，粒徑可以達到110 nm左右，CA納米脂質(zhì)體粒徑隨著膽固醇在膜材中比例減小而變小。在藥脂比中，當(dāng)CA與膜材質(zhì)量比為1∶2時形成的CA納米脂質(zhì)體粒徑較大，隨著CA比例下降到1∶4以下，其粒徑的變化沒有顯著性。

圖3 CA納米脂質(zhì)體粒徑圖與掃描電鏡圖Fig.3 Particle size distribution and SEM of CA liposomes

如圖3所示，CA納米脂質(zhì)體形貌較好、大小較均一，從粒度分布圖中可以看出CA納米脂質(zhì)體粒徑主要為100～150 nm，粒徑分布較窄；從掃描電鏡放大2萬 倍和20萬 倍時看到CA納米脂質(zhì)體成橢圓形，大小均勻，分散度也較好。

2.4 紫外吸收光譜分析

采用膜材比1∶8、藥脂比1∶10、超聲時間15 min條件制備CA納米脂質(zhì)體，用于紫外測定。采用紫外吸收光譜儀分別測定紫外吸收光譜，其結(jié)果如圖4所示。CA的最大吸收峰位于327 nm波長處，在空白脂質(zhì)體中未觀測到該位置有紫外吸收，而CA納米脂質(zhì)體中觀察到該位置有明顯吸收，這說明了CA被成功地包覆在脂質(zhì)體中。

圖4 紫外測試圖Fig.4 UV spectra

2.5 CA納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性

在膜材比1∶8、藥脂比1∶10、超聲時間15 min條件制備CA納米脂質(zhì)體，將其置于生理鹽水中，在37 ℃、200 r/min轉(zhuǎn)速攪拌和4 ℃條件下分別測定其體外釋放率。圖5a為24 h內(nèi)測定，可以看出，在前1 h內(nèi)釋放率上升較快，隨后變緩，在24 h內(nèi)總釋放率在7.2%。圖5b為14 d內(nèi)測定結(jié)果，可以看出，4 d內(nèi)釋放率上升較為顯著，隨著時間延長，釋放率也開始下降，14 d內(nèi)總釋放率沒有超過2.8%。可見CA納米脂質(zhì)體性質(zhì)比較穩(wěn)定，體外釋放速率較慢。

圖5 24 h（a）和14 d（b）CA納米脂質(zhì)體體外釋放率Fig.5 Stability of CA liposomes in 24 h (a) and 14 days (b)

2.6 抑菌性分析

以四環(huán)素為對照，使用膜材比1∶8、藥脂比1∶10、超聲時間15 min條件制備的CA納米脂質(zhì)體，分別對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌做抑制實驗，比較對兩種細菌的抑制作用。

圖6 對金黃色葡萄球菌（a）和大腸桿菌（b）的抑菌作用Fig.6 Inhibitory effect of CA liposomes on Staphylicoccus aurreeuuss aanndd Escherichia ccoollii

從圖6可以看出，CA抑菌效果比較顯著，與四環(huán)素相比無明顯差異，抑菌圈直徑均大于15 mm，空白脂質(zhì)體對兩種細菌都沒有明顯的抑制效果。

CA納米脂質(zhì)體有明顯的抑菌效果，在24 h內(nèi)與CA、四環(huán)素相比有明顯的降低，但在48 h后，CA和四環(huán)素的抑菌作用下降較為顯著，CA納米脂質(zhì)體抑菌作用下降緩慢，抑菌效果明顯更強。分析其原因可能是CA、四環(huán)素在培養(yǎng)基上隨著時間延長其質(zhì)量濃度下降導(dǎo)致抑菌作用下降，而CA納米脂質(zhì)體具有緩釋作用，隨著時間的延長緩釋效果顯現(xiàn)，所以到后期的抑菌效果會明顯更強。

3 結(jié) 論

綠原酸是一種難溶于水、易溶于乙醇的活性物質(zhì)，采用脂質(zhì)體包裹可以使其均勻的分散于水溶液中。納米脂質(zhì)體的制備方法很多，通過不同方法和條件控制包封率、粒徑、緩釋效果等指標(biāo)。同本研究使用的方法相比，冷凍干燥法制備的脂質(zhì)體在貯存過程中易發(fā)生聚集和藥物滲漏等，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和緩釋效果差；凍融法制備脂質(zhì)體在反復(fù)凍融的過程中產(chǎn)生的冰晶容易破損脂質(zhì)體膜，影響包封率；復(fù)乳法制備的脂質(zhì)體粒徑較大，難以達到納米級；反相蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體體積較大，而且更適用于水溶性藥物，所以沒有選擇此方法[19]。對納米脂質(zhì)體進行修飾是未來靶向控釋給藥研究的方向[20]。

本實驗采用薄膜分散超聲法制備的CA納米脂質(zhì)體有較好的分散度，粒徑控制在110 nm左右，經(jīng)過掃描電鏡觀察，脂質(zhì)體成橢圓形；經(jīng)紫外光譜吸收測定，CA和CA納米脂質(zhì)體在327 nm波長處有一個最大吸收峰，而空白脂質(zhì)體在此處沒有，說明CA已經(jīng)成功包被其中；包封率和載藥量分別達到87.5%和36%。在體外37 ℃24 h和4 ℃14 d的實驗中可以看出，CA納米脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性，其釋放率都不超過10%，同時也具備了緩釋功能。

在抑菌實驗中，CA和CA納米脂質(zhì)體都有較好的抑菌效果，CA納米脂質(zhì)體的抑菌能力略低于CA，分析其原因可能是CA納米脂質(zhì)體游離出CA的速率會比CA慢，導(dǎo)致其開始時抑菌能力較CA低，但是隨著CA納米脂質(zhì)體中CA緩慢釋放，其抑菌時間會比CA長，這是因為脂質(zhì)體具有緩釋的功能。

CA是一種難溶于水的活性物質(zhì)，在使用過程中通常被這一性質(zhì)所阻礙，通過脂質(zhì)體包被，為CA的應(yīng)用提供新的途徑。

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Preparation and Antibacterial Effect of Chlorogenic Acid Nanoliposome

XU Xian-zhu, WEI Yun, RAO Hua, WANG Man-ying*
(1. Jiangxi Provincial Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropical Plant Resources, Nanchang 330022, China; 2. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

Objective: To investigate the preparation and antibacterial effect of chlorogenic acid (CA) nanoliposome. Methods: CA nanoliposomes were prepared by film-ultrasonic dispersion method and the products were characterized with scanning electron microscopy (SEM) and particle size analyzer. The effects of cholesterol/lecithin mass ratio, CA/film (lecithin + cholesterol) mass ratio and ultrasonication time on the encapsulation efficiency of liposomes were investigated. Finally, the stability and the bacteriostasis ability of the prepared liposomes were evaluated. Results: Oval-shaped liposomes were prepared by ultrasonication for 15 min at a cholesterol/lecithin mass ratio of 1:8 and a CA/film ratio of 1:10, which showed regular morphology, a particle size of approximately 110 nm in diameter, good dispersity, an encapsulation efficiency of up to 87.5%, and a drug loading of up to 36%. UV spectroscopy showed that CA was encapsulated successfully into nanoliposomes. In vitro test showed that the drug could be sustained-released from liposomes without a burst release and with stability for 24 h and 14 days. Comparing with CA and tetracycline, the nanoliposomes had better bacteriostasis ability. Conclusion: CA nanoliposomes prepared by film-ultrasonic dispersion method have a regular shape, good dispersion ability and persistent antibacterial ability.

chlorogenic acid; nanoliposomes; preparation; antibacterial activity

TS201.2

A

1002-6630（2014）20-0062-05

10.7506/spkx1002-6630-201420013

2014-01-20

江西省教育廳青年科學(xué)基金項目（GJJ13216）；江西省科技支撐計劃項目（20142BBF0008）；江西亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室開放基金項目（YRD201206）

徐賢柱（1981—），男，實驗師，碩士，主要從事植物活性成分提取及其藥理與劑型研究。E-mail：9901189@163.com

*通信作者：王曼瑩（1944—），女，教授，學(xué)士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：wangmy8888@sina.com.cn