響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取獼猴桃根熊果酸工藝

楊 艷，任亞梅*，馬 婷，周九慶，查 晶，張哲學(xué)

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取獼猴桃根熊果酸工藝

楊 艷，任亞梅*，馬 婷，周九慶，查 晶，張哲學(xué)

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

為優(yōu)化獼猴桃根熊果酸的超聲波提取最佳工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度為自變量，熊果酸得率為響應(yīng)值，利用中心組合試驗(yàn)法和響應(yīng)面分析法，研究各自變量交互作用及其對(duì)熊果酸得率的影響，模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型。結(jié)果表明：當(dāng)超聲功率225 W、超聲頻率40 kHz時(shí)，超聲波提取熊果酸工藝最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)73.8%、液料比7.80∶1（mL/g）、提取時(shí)間23.2 min、提取溫度79.1 ℃。此提取條件下，熊果酸得率達(dá)到2.014%，與模型預(yù)測值之間具有較好的擬合性，且提取液中熊果酸的純度為49.7%。

獼猴桃根；熊果酸；超聲波提??；響應(yīng)面分析

獼猴桃根是一種肉質(zhì)根，多為側(cè)根和水平根，無主根[1]。根中主要含有β-谷甾醇、抗壞血酸、熊果酸、齊墩果酸、琥珀酸和胡蘿卜苷等成分，并富含F(xiàn)e、Cu、Mn和Se等元素。獼猴桃根具有清熱消毒、利尿和活血消腫的功效，民間常用于治療肝炎、水腫、跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、乳汁不足、淋蟲、帶下、瘡癤和瘰疬等疾病[2]。目前，與國內(nèi)外對(duì)獼猴桃、獼猴桃 籽油等研究的比較廣泛和深入相比，獼猴桃根方面的研究便顯得十分有限。

熊果酸（ursolic acid，UA）又稱為烏蘇酸或?yàn)跛魉?，是一種弱極性的五環(huán)三萜酸。其分子式為C30H48O3，相對(duì)分子質(zhì)量為456.68，在自然界分布很廣，并且是多種天然產(chǎn)物的功能性成分。熊果酸在山茱萸、山楂、獼猴桃根、車前草、女貞子等藥用植物中廣泛分布[3-4]。已有研究[5-12]表明，熊果酸具有較廣泛的藥理和生物學(xué)作用，如降血脂、抗菌、抗病毒、抗癌、抗艾滋病、免疫活性等作用。熊果酸的傳統(tǒng)提取方法有索氏提取、回流提取等，近年來在提取工藝方面引入了一些新方法如超臨界CO2流體萃取[13]、微波提取[14]、超聲提取[15-17]、分子蒸餾技術(shù)等。超聲提取作為一種先進(jìn)的提取方法，具有提取時(shí)間短、能耗低、效率高等特點(diǎn)。目前采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化熊果酸提取工藝的報(bào)道較少。本研究以農(nóng)民入冬前修剪的秦美獼猴桃根粉為原料，對(duì)秦美獼猴桃根粉乙醇溶液進(jìn)行超聲波處理，利用超聲波的空化作用、熱效應(yīng)、機(jī)械作用加速細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解，縮短提取時(shí)間[17]，以熊果酸得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、超聲功率、提取溫度等單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取熊果酸的工藝條件，以期為開發(fā)利用獼猴桃根資源及工業(yè)化生產(chǎn)熊果酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秦美獼猴桃根，于2011年10月采自陜西省周至縣丁麻村一管理良好的獼猴桃園。首先，將獼猴桃根用清水沖洗3遍；然后，將根莖切至5 cm以下，60 ℃恒溫干燥48 h，控制其含水量為8%；最后，用多功能中藥粉碎機(jī)粉碎，粉體過60目篩，將篩下物用0.05 mm厚的PE密封袋包裝，在低溫（0～10 ℃）條件下保存。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海金穗生物科技有限公司；無水乙醇、香草醛、冰醋酸、乙酸乙酯、高氯酸、石油醚均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ7200紫外分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；HWSYⅡ-K恒溫水浴鍋 北京長風(fēng)儀器儀表公司；DGG-9140B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ 250DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ（A）循環(huán)水真空泵 河南省太康縣科教儀器廠；FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

獼猴桃根→清洗→粉碎→過篩（60目）→除雜→乙醇溶解→超聲波提取→靜置→抽濾→稀釋→定容→待測提取液

1.3.2 提取方法

分別稱取2.00 g過60 目篩的除雜后的獼猴桃根粉，加入一定量、一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇浸提液，置于250 mL三角瓶中搖勻，在一定功率條件下超聲波（頻率為40 kHz）處理一定時(shí)間后，靜置l h，抽濾得含有熊果酸的乙醇溶液上清液，取0.5 mL上清液移至10 mL容量瓶中，并用相應(yīng)提取體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液定容。取0.2 mL的稀釋液移至試管中，置于90 ℃水浴鍋中使乙醇蒸干，得到獼猴桃根中熊果酸粗提物的待測樣品。

1.3.3 熊果酸測定

稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于具塞試管中，各具塞試管均放入90℃水浴鍋中，揮發(fā)掉具塞試管中的乙醇溶劑，各具塞試管中分別加入5%香草醛-冰醋酸0.3 mL和高氯酸0.7 mL，置于60 ℃水浴中加熱15 min，取出冷卻后移至5 mL聚酯試管中，用99.5%的乙酸乙酯定容至5 mL，搖勻后在549 nm波長處測定吸光度[18]。以吸光度為縱坐標(biāo)，熊果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出熊果酸標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：Y=0.045X－0.012 2（R2=0.998 6），熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在6～20 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。將超聲波提取后的樣品，按以上測定方法，以無樣品液的實(shí)驗(yàn)做空白參比，測定吸光度，由熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測溶液中熊果酸的質(zhì)量濃度ρ。熊果酸得率的計(jì)算公式為：

X/%=（ρ×D×V/m）×100

式中：X為熊果酸得率/%；ρ為待測溶液中熊果酸的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為待測溶液的體積/mL；D為稀釋倍數(shù)；m為獼猴桃根粉的質(zhì)量/g。

1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design-Expert統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。依據(jù)四因素中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD），見表1，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)熊果酸得率的影響。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案因素水平Table 1 Factors and levels used in quadratic orthogonal rotation combination design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)熊果酸得率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)熊果酸得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of ursolic acid

在超聲功率225 W、液料比10∶1、溫度50 ℃、提取30 min的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)熊果酸得率有顯著影響，如圖1所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，熊果酸得率先增加后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，熊果酸得率最大，為1.448%，其原因可用相似相溶原理解釋，當(dāng)提取溶劑的極性與熊果酸的極性接近時(shí)，得率最高，由此可以推測75%的乙醇水溶液的極性與獼猴桃根中熊果酸的極性最接近，所以乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%左右為宜，即選取75%為自變量乙醇體積分?jǐn)?shù)的零水平。

2.1.2 液料比對(duì)熊果酸得率的影響

在超聲功率225 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、溫度50 ℃、提取30 min的條件下，液料比對(duì)獼猴桃根中熊果酸得率的影響見圖2，隨著溶劑添加量的增加，熊果酸的得率先增后迅速減小，當(dāng)液料比達(dá)到8∶1時(shí)，浸提可達(dá)到比較理想的效果，原因可能是隨著液料比的增大，熊果酸在整體溶劑中的比例迅速減小，不利于熊果酸的提取。所以液料比8∶1左右為宜，即選取8∶1為自變量液料比的零水平。

圖2 液料比對(duì)熊果酸得率的影響Fig.2 Effect of solvent-to-solid ratio on the extraction yield of ursolic acid

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響

在超聲功率225 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比8∶1、溫度50 ℃時(shí)，超聲波提取時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響見圖3，在超聲波提取10～30 min內(nèi)，熊果酸得率呈上升趨勢，提取時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，得率達(dá)到最大值1.64%；當(dāng)提取時(shí)間超過30 min后，得率開始下降。原因可能為由于超聲波提取時(shí)間太短，熊果酸不能全部迅速游離到溶劑中，超聲波提取時(shí)間過長，除熊果酸以外的醇溶性物質(zhì)充分游離至溶劑中，從而與熊果酸競爭溶劑，使得熊果酸的得率下降，故提取時(shí)間以30 min為宜。所以，選取30 min為自變量時(shí)間的零水平。

圖3 提取時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響Fig.3 Effect of urtrasonic treatment time on the extraction yield of ursolic acid

2.1.4 超聲功率對(duì)熊果酸得率的影響

在溫度50 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比8∶1、提取時(shí)間30 min的條件下，超聲功率對(duì)熊果酸得率的影響見圖4。由圖4可知，功率在125～250 W之間，隨著超聲功率的升高，熊果酸得率呈上升趨勢，通過對(duì)225 W與250 W功率條件下熊果酸得率的顯著性分析，發(fā)現(xiàn)得率并無顯著的升高，考慮到設(shè)備在最大功率下運(yùn)行對(duì)其壽命的影響，故選擇225 W作為提取熊果酸的超聲功率。以下試驗(yàn)中超聲功率均為225 W。

圖4 超聲功率對(duì)熊果酸得率的影響Fig.4 Effect of urtrasonic power on the extraction yield of ursolic acid

2.1.5 提取溫度對(duì)熊果酸得率的影響

在超聲功率225 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比8∶1、超聲時(shí)間30 min的條件下，提取溫度對(duì)熊果酸得率的影響見圖5。由圖5可知，提取溫度在40～60 ℃時(shí)，熊果酸得率迅速上升，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值1.652%，但隨著溫度的繼續(xù)升高，熊果酸得率開始下降并最終趨于平衡，這可能是由于在升溫和機(jī)械波作用下，熊果酸結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成得率下降。因此，最佳提取溫度應(yīng)在60 ℃附近，選取60 ℃為自變量溫度的零水平。

圖5 提取溫度對(duì)熊果酸得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction yield of ursolic acid

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 模型優(yōu)選

根據(jù)四因素中心組合設(shè)計(jì)，于中心點(diǎn)重復(fù)12次共計(jì)30次試驗(yàn)，結(jié)果見表2，對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。將試驗(yàn)結(jié)果輸入Design-Expert系統(tǒng)，并尋找合適的回歸方程。

表2 四元二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of four-variable quadratic orthogonal rotation combination dessiiggnn

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

由表3可知，模型P值小于0.01，表示模型高度顯著，而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），預(yù)測值與試驗(yàn)值之間有較好的相關(guān)性，決定系數(shù)R2=0.973 1，因此，采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行獼猴桃根粉熊果酸的提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得回歸模型是有效的對(duì)應(yīng)的P值小于0.01，說明其對(duì)結(jié)果影響極顯著；交互項(xiàng)對(duì)應(yīng)的P值小于0.05，說明其對(duì)結(jié)果影響顯著；X1、對(duì)結(jié)果影響不顯著。

根據(jù)莊恒揚(yáng)等[19]因素重要性分析方法，綜合考慮各因子的線性、二次及交互作用三方面的影響，在試驗(yàn)考察范圍內(nèi)，各因素對(duì)熊果酸得率的影響為：液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn)

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)用二次多項(xiàng)式擬合后，得到因子編碼值回歸方程和實(shí)際值回歸方程為∶

回歸方程的擬合程度可通過決定系數(shù)R2和R2校正值來驗(yàn)證[20]，此處R2校正值為0.944 2，表明在熊果酸超聲波提取工藝研究中，大約有94.4%的變異分布在所研究的4個(gè)因子當(dāng)中，另有5.6%的變異不能由該模型來解釋。相關(guān)系數(shù)R=0.973 1，表明熊果酸得率的實(shí)際值與預(yù)測值（表2）之間具有很好的擬合相關(guān)性。

2.2.3 響應(yīng)面分析優(yōu)化提取條件

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比交互影響熊果酸得率的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of solvent-to-solid ratio and ethanol concentration on the extraction yield of ursolic acid

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，模型總效應(yīng)F=33.62，P＜0.000 1，說明各因素間有交互作用。根據(jù)上述回歸方程作各因素間交互作用的響應(yīng)曲面和等高線如圖6～8所示。等高線的形狀可直觀地看出交互效應(yīng)的大小，橢圓形反映了兩因素的交互作用較強(qiáng)，而圓形則相反[21]。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度交互影響熊果酸得率的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and ethanol concentration on the extraction yield of ursolic acid

圖8 提取溫度和提取時(shí)間交互影響熊果酸得率的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and extraction time on the extraction yield of ursolic acid

由圖6可知，固定超聲提取溫度和提取時(shí)間，熊果酸得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的增加都呈先增加后減少的趨勢。由圖7可知，固定液料比和提取時(shí)間，熊果酸的得率隨提取乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈先增加后減少的趨勢；而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在低水平時(shí)，得率隨提取溫度的升高呈增大趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在高水平時(shí)，得率隨提取溫度的升高無明顯變化。由圖8可知，固定液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)，熊果酸的得率隨提取時(shí)間的延長呈先增加后減少的趨勢；而當(dāng)提取時(shí)間在低水平時(shí)，得率隨提取溫度的升高呈逐漸增加趨勢，當(dāng)提取時(shí)間在高水平時(shí)，得率隨提取溫度的升高無明顯變化。

2.2.4 Design-Expert系統(tǒng)的最優(yōu)提取條件模擬與檢驗(yàn)

通過Design-Expert系統(tǒng)對(duì)回歸方程求解，得到一組優(yōu)化方案。在試驗(yàn)的優(yōu)化水平范圍內(nèi)預(yù)測熊果酸提取的最優(yōu)條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73.8%、液料比7.80∶1（mL/g）、提取時(shí)間23.2 min、提取溫度79.1 ℃，此提取條件下，熊果酸得率達(dá)到（2.018±0.006）%。在此條件下實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到熊果酸得率的平均值為2.014%，與模型預(yù)測值僅相差0.004%，說明模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值吻合，可用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。采用大孔樹脂法測定熊果酸含量，得出獼猴桃根提取液中熊果酸的純度為49.7%。

3 結(jié) 論

3.1 利用Design-Expert系統(tǒng)對(duì)獼猴桃根熊果酸的超聲波提取工藝4個(gè)關(guān)鍵參數(shù)作了考察，研究表明在試驗(yàn)考察范圍內(nèi)，各因子對(duì)熊果酸得率的影響為：液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，且這4個(gè)因素與熊果酸得率之間的關(guān)系更接近于二次多項(xiàng)式模型。

3.2 此模型的預(yù)測值與真實(shí)值之間的相關(guān)性達(dá)94.42%，模型能夠解釋94.4%的總變異，即模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確的預(yù)測獼猴桃根熊果酸的得率。

3.3 響應(yīng)面分析表明獼猴桃根中熊果酸提取的最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)73.8%、液料比7.80∶1（mL/g）、提取時(shí)間23.2 min、提取溫度79.1 ℃，在此條件下熊果酸得率可達(dá)2.014%，與模型預(yù)測值僅相差0.004%，可用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。在最優(yōu)提取條件下，參考白新鵬[22]的方法對(duì)最優(yōu)條件下從獼猴桃根中提取的熊果酸進(jìn)行純化，采用大孔樹脂法測定熊果酸含量，得出獼猴桃根提取液中熊果酸的純度為49.7%。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Ursolic Acid from Roots of Actinidia chinensis Using Response Surface Analysis

YANG Yan, REN Ya-mei*, MA Ting, ZHOU Jiu-qing, ZHA Jing, ZHANG Zhe-xue
(College of Food Science and Engineering, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China)

In this study, the conditions for ultrasonic-assisted extraction of ursolic acid (UA) from the roots of Actinidia chinensis were optimized by response surface methodology. On the basis of single-factor experiments, a mathematical regression model was established indicating the effect of ethanol concentration, solv ent/solid ratio, extraction time and temperature on the extraction yield of UA by response surface central composite design. Under the conditions of 225 W and 40 kHz, the optimum extraction conditions determined were as follows: 73.8% ethanol concentration, 7.80:1 solvent/solid ratio (mL/g), 23.2 min and 79.1 ℃. Under these conditions, the experimental extraction yield of UA was 2.014%, which is well matched with the predicted value, and the purity of UA in the extract was 49.7%.

Actinidia chinensis root; ursolic acid; ultrasonic-assisted extraction; response surface analysis

TQ929.2

A

1002-6630（2014）04-0044-06

10.7506/spkx1002-6630-201404010

2013-02-18

西北農(nóng)林科技大學(xué)科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（Z222021313）

楊艷（1988—），女，碩士，研究方向?yàn)楣吖δ苄猿煞值姆治雠c提取。E-mail：330579453@qq.com

*通信作者：任亞梅（1970—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣肥卟说馁A藏及加工。E-mail：yameiren@yahoo.com