發(fā)酵對(duì)幾種谷物提取物總酚及抗氧化活性的影響

張慧蕓，陳俊亮，康懷彬

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

發(fā)酵對(duì)幾種谷物提取物總酚及抗氧化活性的影響

張慧蕓，陳俊亮，康懷彬

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

目的：研究發(fā)酵對(duì)谷物提取物抗氧化活性的影響。方法：采用德氏乳桿菌和啤酒酵母菌分別對(duì)小米、燕麥、黑米、高粱米4種谷物進(jìn)行發(fā)酵，福林-酚法測(cè)定未發(fā)酵及發(fā)酵后谷物乙醇提取物總酚含量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydraz yl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）法測(cè)定清除自由基能力、鐵還原抗氧化能力（ferric reducing-antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測(cè)定還原能力、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力。結(jié)果：4種谷物提取物具有顯著的清除自由基能力、鐵離子還原能力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力和較高的總酚含量；經(jīng)兩種微生物發(fā)酵后谷物提取物總酚含量增加，具有更高抗氧化活性；其中德氏乳桿菌發(fā)酵對(duì)總酚含量及抗氧化能力影響均顯著（P＜0.05）；啤酒酵母發(fā)酵對(duì)總酚含量影響顯著（P＜0.05），但對(duì)抗氧化能力影響不顯著（P＞0.05）。結(jié)論：微生物發(fā)酵可提高谷物的總酚含量及抗氧化活性，但提高的程度與發(fā)酵采用的微生物種類(lèi)有關(guān)。

發(fā)酵；谷物提取物；總酚；抗氧化

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，谷物及谷物食品中含有大量的多酚類(lèi)化合物，包括酚酸、 黃酮類(lèi)化合物和原花青素等，這些多酚類(lèi)化合物具有很強(qiáng)的抗氧化活性[1-5]，開(kāi)發(fā)潛力極大。小米、高粱中的酚類(lèi)化合物具有很強(qiáng)的抗氧化能力，尤其是清除自由基和螯合金屬離子能力[6-7]。黑米亦含有大量酚類(lèi)化合物，能有效地清除過(guò)氧自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基，有效地控制低密度脂蛋白膽固醇的氧化，在抗氧化保健品開(kāi)發(fā)方面具有很大潛力[8]。研究表明，具有抗氧化活性的谷物食品有助于減少與衰老有關(guān)慢性疾病的發(fā)生率，包括心臟病和某些癌癥[9]。另一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)谷物中含有一定量的抗?fàn)I養(yǎng)成分，影響其生物可利用性，如不易溶解、消化的植酸鹽類(lèi)、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子[10]。發(fā)酵長(zhǎng)期以來(lái)被作為一種提高產(chǎn)品性能的方法，微生物發(fā)酵過(guò)程可以改性植物組分[11]；發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生許多生物化學(xué)變化，從而可以改變植物中營(yíng)養(yǎng)組分和抗?fàn)I養(yǎng)組分的比例，提高產(chǎn)品的生物活性和消化性等[12-13]。Juan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黑豆在經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵后總酚和總黃酮的含量都有增加。Moore等[15]研究發(fā)現(xiàn)，麥麩經(jīng)酵母菌固態(tài)發(fā)酵后抗氧化活性提高。本實(shí)驗(yàn)研究了酵母菌發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵對(duì)4種谷物提取物抗氧化活性和總酚含量的影響，以期為開(kāi)發(fā)谷物抗氧化食品提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）ATCC7830 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

MRS培養(yǎng)基和胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 材料與試劑

小米、高粱米、燕麥 洛陽(yáng)市呂昌谷業(yè)有限公司，產(chǎn)地河南省洛陽(yáng)市伊川縣；黑米 河南黑谷源土特產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司，產(chǎn)地河南省洛陽(yáng)市宜陽(yáng)縣。

大豆卵磷脂、Fe3+-三吡啶三吖嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、DPPH 美國(guó)Sigma公司；氯仿、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、沒(méi)食子酸、福林酚試劑 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物菌種的培養(yǎng)

L. delbrueckii和S. cerevisiae凍干粉分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基（37℃，24h）和胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基中（30℃，24h）進(jìn)行活化，活化3次后接種于谷物樣品中。

1.3.2 谷物提取物的制備

谷物100g在室溫下于蒸餾水中浸泡24h后過(guò)濾，加入400 mL蒸餾水研磨得漿狀物于高壓鍋中殺菌1h，然后冷卻至室溫。每種谷物樣品分為3組：第1組接種5mL L. delbrueckii，第2組接種5mL S. cerevisiae，第3組不接種。3組谷物樣品均于30 ℃發(fā)酵24h。發(fā)酵后加入700 mL 70%乙醇磁力攪拌3h，4500 r/min離心10 min，殘?jiān)尤?00 mL 70%乙醇重提3h后，4500 r/min離心10 min。合并濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60 ℃）中濃縮，取出濃縮液在60 ℃烘箱中干燥，得到谷物提取物，避光保存于4 ℃冰箱中待用。

1.3.3 總酚含量的測(cè)定

參考Wu[16]和Djeridane[17]等的方法，稍加改進(jìn)。100μL樣品置10 mL容量瓶中，加入福林酚試劑500μL，加蒸餾水至約6 mL，于漩渦混合器中混合，在1～8 min內(nèi)加15g/100 mL碳酸鈉溶液2 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，于漩渦混合器中混合，2h后在765nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸作標(biāo)準(zhǔn)品代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的總酚含量以沒(méi)食子酸的含量表示，單位為mg/g。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考Larrauri等[18]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。吸取0.1 mL 200μg/mL的谷物提取物，加入0.5 mL 50g/L 的DPPH-甲醇溶液，用甲醇定容至5 mL。室溫下避光靜置1h后于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率用下式表示。

式中：A為樣品溶液的吸光度；A0為空白溶液的吸光度。1.3.5 鐵還原抗氧化能力（ferric reducing-antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測(cè)定抗氧化能力

參照Benzie等[19]的方法，在反應(yīng)管中加入0.1 mL 200μg/mL的谷物提取物，再準(zhǔn)確加入3 mL FRAP工作液，300μL雙蒸水，混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)8 min，于593nm波長(zhǎng)處讀取吸光度，95%食用酒精調(diào)零。以100～1000μmol/L FeSO4·7H2O制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的抗氧化活性（FRAP值）以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4毫摩爾數(shù)表示，每份試樣重復(fù)測(cè)定3次。FRAP工作液現(xiàn)用現(xiàn)配，由pH3.6的100 mL 30mmol/L醋酸鹽緩沖液、10 mL 10mmol/L TPTZ溶液和10 mL 20mmol/L FeCl3·6H2O溶液混合在一起組 成。

1.3.6 抗脂質(zhì) 過(guò)氧化能力的測(cè)定

脂質(zhì)體由大豆卵磷脂制得，采用Decker等[20]的方法進(jìn)行一些改進(jìn)。將大豆卵磷脂溶解（200mg/L）在0.12mol/L KCl、5mmol/L組氨酸緩沖溶液（pH6.8）均質(zhì)后，4 ℃條件下進(jìn)行45 min超聲波處理，以促其溶解[21]。

將5 mL脂質(zhì)體溶液和1 mL 200μg/mL的谷物提取物混合。對(duì)照為用1 mL 70%乙醇代替1 mL谷物提取物與5 mL脂質(zhì)混合。加入0.1 mL 50mmol/L FeCl3和0.1 mL 10mmol/L抗壞血酸鈉引發(fā)脂質(zhì)氧化，然后將樣品放在37 ℃水浴中保溫1h，其氧化程度由TBA法測(cè)定。樣品溶液與0.02mol/L TBA反應(yīng)后，與氯仿體積比1∶1混合，旋渦振蕩，1800×g離心10 min。取上清測(cè)定在532nm波長(zhǎng)處的吸光度?？怪|(zhì)氧化能力的計(jì)算公式同1.3.4節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，用Statistix 8（分析軟件，St Paul，MN）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，平均數(shù)之間顯著性差異（P＜0.05） 通過(guò)最小顯著差值進(jìn)行，用Sigmaplot9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對(duì)谷物提取物總酚含量的影響

圖1 發(fā)酵對(duì)4種谷物提取物總酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation on total polyphenolics of cereal extracts

如圖1所示，所測(cè)未發(fā)酵谷物提取物中黑米中總酚含量最高為18.7mg/g，小米和高粱中總酚含量較低分別為16.9mg/g和16.4mg/g，燕麥中總酚含量最低為14.2mg/g。發(fā)酵可提高谷物中所含生物活性成分含量，經(jīng)S. cerevisiae和L. delbrueckii發(fā)酵后，黑米提取物總酚含量分別提高了16%和40.6%，高粱提取物總酚含量分別提高了14.6%和25%，小米提取物總酚含量分別提高了11.2%和25.4%，燕麥提取物總酚含量分別提高了23.9%和43.7%。結(jié)合酚是谷物酚類(lèi)化合物的主要存在形式[22-23]，谷物中結(jié)合酚類(lèi)化合物可在提取之前通過(guò)堿、酸或酶處理使其釋放出來(lái)[24]，這可能是發(fā)酵后谷物提取物總酚含量增加，具有更高抗氧化活性的主要原因。另外，由于發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝活動(dòng)對(duì)植物中生物活性物質(zhì)進(jìn)行改性，且發(fā)酵可使谷物細(xì)胞壁分解，導(dǎo)致各種生物活性物質(zhì)的釋放或合成[13,25]。

2.2 發(fā) 酵對(duì)谷物提取物DPPH自由基清除能力的影響

圖2 發(fā)酵對(duì)4種谷物提取物DPPH自由基清除能力的影響Fig.2 Effect of fermentation on DPPH radical scavenging activity of cereal extracts

由于此法簡(jiǎn)單方便，DPPH自由基已被廣泛用 于分析抗氧化活性成分的自由基清除能力。如圖2所示，未發(fā)酵小米提取物自由基清除能力僅為31%。Linda等[6]研究也表明，小米提取物DPPH自由基清除能力較弱。燕麥和高粱具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力分別為46.7%和46.6%。黑米提取物具有最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力為54.7%。經(jīng)L. delbrueckii發(fā)酵后谷物提取物DPPH自由基清除活性均有所提高，差異顯著（P＜0.05）；而經(jīng)S. cerevisiae發(fā)酵對(duì)谷物提取物的DPPH自由基清除活力影響不顯著（P＞0.05）。Moore等[15]研究發(fā)現(xiàn)小麥經(jīng)某種酵母菌發(fā)酵后DPPH自由基清除能力有所增加，但經(jīng)其他類(lèi)型酵母菌發(fā)酵后其清除能力反而降低，造成這種差別的原因可能是由于不同酵母菌本身具有不同的DPPH自由基清除能力。

2.3 發(fā)酵對(duì)谷物提取物還原能力的影響

圖3 發(fā)酵對(duì)4種谷物提取物還原能力的影響Fig.3 Effect of fermentation on FRAP of cereal extracts

如圖3所示，未發(fā)酵燕麥提取物FRAP值最高為714.6μmol/L，其次是小米提取物和高粱提取物分別為634.9μmol/L和574.5μmol/L，黑米提取物最低為528.6μmol/L。本研究中只有高粱經(jīng)L. delbrueckii發(fā)酵后其提取物FRAP值顯著增加（P＜0.05），小米、黑米和燕麥經(jīng)L. delbrueckii發(fā)酵前后其提取物FRAP值差異不顯著（P＞0.05）；經(jīng)S. cerevisiae發(fā)酵前后4種谷物提取物FRAP值亦差異均不顯著（P＞0.05），與Hubert等[14]的報(bào)道相一致。

2.4 發(fā)酵對(duì)谷物提取物抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的影響

圖4 發(fā)酵對(duì)4種谷物提取物抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的影響Fig.4 Effect of fermentation on lipid peroxidation inhibition activity of cereal extracts

如圖4所示，未發(fā)酵燕麥提取物具有最大的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力為57.6%，接下來(lái)依次為小米和高粱分別為54.5%和51.6%，黑米最低為45.6%。經(jīng)L. delbrueckii發(fā)酵后谷物提取物抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力顯著提高（P＜0.05），小米、黑米、燕麥和高粱提取物抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力分別提高了16.0%、11.8%、10.0%和19.4%，而經(jīng)S. cerevisiae發(fā)酵后對(duì)其影響不顯著（P＞0.05）。關(guān)于微生物發(fā)酵谷物提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化抑制效果影響的報(bào)道較少，同一種樣品測(cè)定抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性使用的脂質(zhì)體系不同所測(cè)得抗氧化活性相差也很大[27]。

3 討 論

不同微生物發(fā)酵對(duì)被測(cè)谷物中多種生物活性化合物改性的影響不同，這可能由于不同微生物發(fā)酵產(chǎn)生的pH值不同，谷物內(nèi)核細(xì)胞壁降解酶的釋放程度不同[28]。Kariluoto等[29]研究亦表明，發(fā)酵通常情況下會(huì)提高谷物總多酚含量和谷物提取物的抗氧化活性，但提高的程度與發(fā)酵采用的微生物種類(lèi)有關(guān)。對(duì)抗氧化活性與總酚含量之間的不確定關(guān)系有幾種解釋?zhuān)?）總酚含量不包括所有抗氧化物，如抗壞血酸、類(lèi)胡蘿卜素和生育酚；2）不同抗氧化物的協(xié)同作用使其抗氧化活性不僅取決于抗氧化物的含量還要考慮抗氧化物的結(jié)構(gòu)及之間的相互作用，這就是導(dǎo)致具有相似總多酚濃度的樣品其抗氧化活性相差很大的原因；3）不同測(cè)定抗氧化活性的方法基于不同的反應(yīng)機(jī)制，可能會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果[30]。

本研究結(jié)果表明，谷物具有顯著的清除自由基能力、鐵離子還原能力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力和較高的總酚含量，谷物食品本身可能包含重要的膳食抗氧化劑，因此，值得進(jìn)一步研究，以確定這些膳食抗氧化劑是否利于人體健康?？赏ㄟ^(guò)微生物對(duì)谷物進(jìn)行發(fā)酵提高其抗氧化活性，發(fā)酵可提高谷物中許多生物活性化合物的含量并可改變谷物中營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)成分的比例以提高產(chǎn)品特性；發(fā)酵類(lèi)型對(duì)谷物生物活性組分具有潛在影響。然而，對(duì)谷物發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群變化和相關(guān)酶活性的變化還需要進(jìn)行更詳細(xì)的研究，以便建立發(fā)酵谷物提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的明確機(jī)制。還需進(jìn)一步研究發(fā)酵谷物提取物的組成，鑒定其中的抗氧化物質(zhì)，分析谷物產(chǎn)品作為天然抗氧化劑和保健品的潛力；研究影響谷物抗氧化劑在人體中分布、穩(wěn)定性和活性的生物和食品加工條件以便生產(chǎn)出具有最大產(chǎn)品功效的保健食品。

4 結(jié) 論

通過(guò)研究?jī)煞N不同微生物發(fā)酵對(duì)4種谷物提取物總酚含量及抗氧化活性的影響發(fā)現(xiàn)，未發(fā)酵4種谷物提取物具有較強(qiáng)的清除自由基能力、鐵離子還原能力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力和較高的總酚含量；經(jīng)兩種微生物發(fā)酵后谷物提取物總酚含量增加，具有更高抗氧化活性；其中L. delbrueckii發(fā)酵對(duì)總酚含量及抗氧化活性影響均顯著（P＜0.05）；S. cerevisiae發(fā)酵對(duì)總酚含量影響顯著（P＜0.05），但對(duì)抗氧化活性影響不顯著（P＞0.05）。微生物發(fā)酵可提高谷物的總酚含量及抗氧化活性，但提高的程度與發(fā)酵采用的微生物種類(lèi)有關(guān)。

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Effect of Fermentation on Total Polyphenol Content and Antioxidant Activity of Cereal Extract

ZHANG Hui-yun, CHEN Jun-liang, KANG Huai-bin
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

The objective of this work was to assay the in uence of different fermentation types (yeast fermentation and lactic acid fermentation) on antioxidant activity and total polyphenol content in selected cereals. After fermented by Lactobacillus delbrueckii, Saccharomyces cerevisiae or nothing, the cereals were extracted by ethanol. The content of total polyphenols in extracts was determined by the Folin-Ciocalteu m ethod, and the antioxidant activity was measured by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay, ferric reducing-antioxidant power (FRAP) method and thiobarbituric acid (TBA) test. This study indicated that four cereals used widely for human consumption exhibited signi cant levels of free radical scavenging activity, ferric-reducing power, inhibitory activity against lipid peroxidation and total polyphenol content. These factors suggested that cereal-based foods alone could contain important dietary antioxidants, but further research is needed to determine whether or not these dietary antioxidants could be bene cial to human health. The total polyphenol content (TPC) increased upon fermentation. The presence of these microorganisms was more or less important for enhanced levels of antioxidant activity. Thus fermentation offers a tool to further increase the bioactive potential of cereal products. In conclusion, it seems advantageous to select microorganism starter culture for the fermentation of cereals based on their positive correlation with total antioxidant capacity.

fermentation; cereal extracts; total polyphenol; antioxidant

TS201.2

A

1002-6630（2014）11-0195-05

10.7506/spkx1002-6630-201411039

2013-05-29

張慧蕓（1977—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性分析。E-mail：zhanghuiyun21@163.com